Abstract
Bakgrunn
Ved hjelp av antistoff /aptamer-legemiddelkonjugater kan være en lovende metode for å redusere toksisitet, og samtidig øke effektiviteten av kjemoterapi.
metodikk /hovedfunnene
i denne studien, antitumormidlet Doksorubicin (Dox) ble innlemmet i den modifiserte DNA aptamer TLS11a-GC, som er spesielt rettet mot LH86, en human leverkreft cellelinje. Celleviabilitet tester viste at TLS11a-GC-DOX-konjugater viste både styrke og målrette spesifisitet. Viktigere, interkalerende Dox inn i den modifiserte aptamer hemmet ikke-spesifikk opptak av membran-gjennomtrengelige Dox til den ikke-mål-cellelinje. Siden konjugater er selektiv for celler som uttrykker høyere mengder av target proteiner, begge kriteriene nevnt ovenfor er oppfylt, noe som gjør TLS11a-GC-Dox konjugater potensielle kandidater for målrettet levering til leveren kreftceller.
Konklusjon /Betydning
Vurderer stort antall tilgjengelige aptamerer som har konkrete mål for et bredt spekter av kreftceller, vil denne romanen aptamer-drug intercalation metoden har lovende implikasjoner for kjemoterapeutika generelt
Citation. Meng L, Yang L, Zhao X, Zhang L, Zhu H, Liu C, et al. (2012) Målrettet Levering av kjemoterapi agenter Ved hjelp av en leverkreft-Specific Aptamer. PLoS ONE 7 (4): e33434. doi: 10,1371 /journal.pone.0033434
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 24 oktober 2011; Godkjent: 08.02.2012; Publisert: 25 april 2012
Copyright: © 2012 Meng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) GM066137, GM079359, og CA133086. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Det er vel kjent at tradisjonelle kreft kjemoterapi kan forårsake alvorlige bivirkninger ved deres uspesifikke toksisitet. For å overvinne dette problem, og å oppnå spesifikk levering av legemidler, har vår gruppe, og andre forskere som benyttes antistoffer [1], [2] eller aptamerer [3], [4], [5], [6], [7], [8] [9], [10] for å designe ligand bundet legemiddelkonjugater for målrettet-levering programmer.
aptamerer er single-strandet oligonukleotider som spesifikt kan bindes til små molekyler, [11] peptider og proteiner. [12] aptamerer ikke bare gi fordelene av antistoffer, så som høy spesifisitet og affinitet, men de har også lav immunogenitet og høy stabilitet, sammen med enkel syntese og modifisering. Nylig har en prosess som kalles celle-SELEX (Systematisk Evolution of ligander ved eksponentiell berikelse) er utviklet for å generere aptamerer for innpassing av målet kreftceller, inkludert T-celle akutt lymfatisk leukemi (T-celle ALL), små-celle lunge kreft , lever- kreft og virusinfiserte celler. [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19] Disse aptamerer er meget spesifikke for forskjellige typer av tumorceller, og har gode bindingsaffiniteter. Fordi aptamerer gi spesifisitet på molekylært nivå, er det antatt at aptamer-legemiddelkonjugater kan forsterke effektiviteten av medikamentavgivelse, mens på samme tid, redusere systemisk toksisitet.
hepatocellulært karsinom (HCC) er en av de de fleste vanlige og dødelige kreft i verden. Det fører til ca 600.000 dødsfall hvert år. Foreløpig har behandlinger for tidlig leverkreft stolt på levertransplantasjon og kirurgisk reseksjon. Konvensjonell kjemoterapi har ikke vært effektive med leverkreftpasienter, og siden de kjemoterapeutiske midler er ikke spesifikke for leverkreftceller, resultere toksiske bivirkninger. I en tidligere publikasjon, vi rapporterte utviklingen av en rekke spesifikke aptamerer basert på en musemodell. [14] En av disse aptamerer kan også spesifikt gjenkjenner humane leverkreftceller, og vi rapporterer her en ny utforming for målrettet levering av Doxorubicin (Dox) til leverkreftceller.
Doxorubicin har vært brukt til behandling av leverkreft i form av lokalisert avgivelse, men dens virkning hemmes av toksiske bivirkninger. For å bøte på dette problemet, har vi Pilgrim Dox inn en modifisert aptamer sonde. Dox er kjent for å intercalate inn i DNA-kjeden som ved tilstedeværelse av flate aromatiske ringer i Dox molekylet. Nyere forskning har allerede vist at Doxorubicin kan intercalate inn aptamer A10 å gi spesifikk drepende virkning på prostata kreft celler. [6], [20].
Aptamer TLS11a ble tidligere valgt av celle SELEX mot BNL 1ME A.7R.1 (Mear) mus hepatomcelle linje. [14] Det ble valgt for dette programmet fordi det viste stor bindende affinitet for LH86, en leverkreft cellelinje. [21] For å oppnå større effektivitet innskyting, ble en lang hale GC tilsatt til TLS11a for å danne en modifisert aptamer, TLS11a-GC. Gjennom samhandling, forholdet mellom Doxorubicin og TLS11a-GC var 25:1. Følgelig leveringseffektiviteten av doxorubicin var mye høyere sammenlignet med den opprinnelige TLS11a. Også,
in vitro Hotell og
in vivo
eksperimenter viste at TLS11a-GC-DOX-konjugater har mye bedre spesifikk drepende virkning for målet kreftceller sammenlignet med fritt DOX og kontroll aptamer-Dox konjugater.
Resultater
bindingsaffiniteten Aptamer TLS11a
Aptamer TLS11a (fig. 1a) ble generert mot BNL 1ME A.7R.1 (mear) mus hepatoma cellelinje [ ,,,0],14] og viste sterk binding affinitet (Kd = 4,51 ± 0,39 nM). [14] Den LH86-cellelinjen ble etablert fra en pasient med leverkreft. [21] Ved TLS11a ble anvendt for å teste LH86 celler, åpenbare binding evne ble observert (Fig. 1b). Også når normale humane leverceller, Hu1082, ble testet ved hjelp av TLS11a, ingen signifikant binding ble observert (Fig. 1c). På fig. 1 b og c, viser det grønne histogrammet bakgrunnen binding (kontroll aptamer, TD05), og de røde fluorescensstyrkene viser bindingen av TLS11a med mål-og kontrollcellene. Sammenlignet med kontrollen aptamer, det er en betydelig forskjell mellom bindingsstyrke TLS11a til LH86 og Hu1082 celler. Ingen tidligere rapportert probe skiller mellom leverkreftceller og humane normale leverceller. Også, Kd på TLS11a til LH86 var 7,16 ± 0,59 nM (fig. 1d), sammenlignet med 4,51 ± 0,39 nM til BNL 1ME A.7R.1. [14].
(a) Den sekundære strukturen til aptamer TLS11a og dens bindingsevnen til (b) LH86 og (c) humane normale leverceller, Hu1082. Den grønne Histogrammet viser bakgrunnsbinding (kontroll aptamer, TD05), og de røde fluorescensstyrkene viser binding av TLS11a med mål-og kontrollcellene. Alle prober ble merket med Phycoerythrin-Cy5.5. (D) Kd besluttsomhet
Immunohistologisk bildebehandling og fluorescens mikroskopi har vært mye brukt i studiet av solide svulster.; Derfor har vi også vurdert om TLS11a kan brukes for tumoravbildning med LH86, den positive cellelinje. Figur S1 viser confocal bilder av LH86 oppdaget med TLS11a og en kontrollsekvens, TD05 (Tekst S1). Det var signifikant signalstyrken TLS11a sammenlignet med den negative kontroll, og signalet mønsteret viser at aptamerer bindes til overflaten av cellene.
Det er vanligvis antatt at aptamerer utvalgte mot cellelinjer binder seg til cellemembranproteiner . Dette er blitt vist i de fleste SELEX Protokoller som innbefatter tumorcellelinjer. [22], [23] For å undersøke målmolekylet av TLS11a, utførte vi en protease-analyse, i hvilket LH86-celler ble behandlet med trypsin i 10 minutter ved 37 ° C. Etter inkuberingsperioden, ble proteaseaktiviteten stoppet ved tilsetning av iskald PBS inneholdende 20% FBS. Cellene ble raskt vasket to ganger ved sentrifugering og deretter inkubert med aptamerer. Som vist i fig S2, TLS11a tapt gjenkjennelse betydelig i trypsin-behandlede celler (Text S1). De fluorescenssignaler redusert til bakgrunnen, som indikerer at behandling av cellene med proteasene som skyldes nedbrytning av målproteinet, som igjen viser at den målmolekylet av TLS11a er et membranprotein.
An internalise assay ble deretter utføres for å fastslå om TLS11a kunne internaliseres på målet bindende. LH86 celler ble først inkubert med biotinmerket TLS11a eller TD05 og deretter videre inkubert med streptavidin konjugert PE-Cy5.5. Deretter ble bufferen ble fjernet, og kulturmedium med LysoSensor ™ grønne DND-189 ble tilsatt til cellene og inkubert ved 37 ° C i to timer. LysoSensor tjente som en indikator på lysosomet plassering i cellene. Som vist i fig S3, var det klart internalisering av den aptamer (Text S1). Den TLS11a signal stammer fra inne i cellene i stedet for på de ytre marginer, og det co-lokalisert med LysoSensor. Kontrollen sekvensen viste ingen signal i enten 4 ° C eller 37 ° C analyser. Resultatene tyder på at TLS11a kan ha bundet til et protein som kan bli internalisert.
Bøyning og Eiendom Study of Aptamer-Dox Complex
Dox er kjent for å intercalate innen DNA-tråden ved tilstedeværelse av flate aromatiske ringer, og den fortrinnsvis binder seg til dobbelt-trådet 5′-GC-3 «eller 5′-CG-3′ sekvenser. [24], [25]. Den sekundære strukturen til TLS11a, som forutsagt ved NUPACK programvare (https://www.nupack.org/), er vist i Figur 1a. I henhold til strukturen, er det to 5»-GC-3 «eller 5′-CG-3′ sekvenser i TLS11a sekvensen slik at en TLS11a sekvens kan intercalate maksimalt to Doxorubicin-molekyler. For å intercalate flere Doxorubicin-molekyler, ble en lang hale GC tilsatt til 5»-enden av TLS11a for å generere en modifisert aptamer, TLS11a-GC (Fig. 2a). På grunn av den lange GC-halen, danner TLS11a-GC en dimer struktur. Nupack beregning indikerte at en TLS11a-GC-dimer kan intercalate opp til 56 Doxorubicin-molekyler for å fremstille en TLS11a-GC-til-Doxorubicin-forhold på 01:28. En kontrollsekvens aptamer, TD05, ble også modifisert med en lang hale GC for å gi den samme aptamer mot Doxorubicin-forhold (fig. 2b). Selv om TLS1a-GC og TD05-GC dimerer kan intercalate opptil 28 Dox per aptamer, forholdet mellom aptamer og doxorubicin ble holdt på 01:25 i disse forsøkene.
intercalation av Dox i GC-modifisert aptamerer dannet fysiske konjugater. (A) TLS11a-GC-Dox. (B) TD05-GC-Dox. (C) Avkjøling av Dox fluorescens etter interkalering. Bindingsaffiniteten til (d) TLS11a-GC eller (e) TD05-GC til LH86 celler overvåkes ved hjelp av flow cytometri. Fluorescenssignalet er fra Phycoerythrin-Cy5.5. Internalisering av (f) Dox, (g) TLS11a-gc-Dox, og (h) TD05-GC-Dox observert av konfokal mikroskopi.
Det er velkjent at Dox har fluorescens-egenskaper, men den innskyting av Dox i DNA aptamer slukker fluorescensen av Dox på grunn av dannelsen av charge-transfer komplekser mellom DNA-baser og antracyklinet ring. [26], [27], [28] For å undersøke hvorvidt en slik interaksjon forekommer med modifisert TLS11a-GC og TD05-GC aptamerer, fluorescens ble kjøpt for Dox i fravær og i nærvær av en av de aptamerer (fig. 2c) . Oppløsningen av fritt DOX hadde den høyeste fluorescens-signalet i forhold til den sorte gruppen (bindingsbuffer). Når modifisert aptamer (TLS11a-GC eller GC-TD05) ble tilsatt til løsningen ved Dox 01:28 forhold og blandes godt, fluorescensen dramatisk redusert til nesten bakgrunnsnivået, noe som indikerer at innskyting av Dox i DNA aptamer er gjennomførbart og hurtig . Selv etter at aptamer-Dox-komplekset oppløsningen ble holdt ved romtemperatur i 3 timer, fluorescensen oppholdt seg den samme, noe som indikerer at aptamer-Dox-komplekset er meget stabil.
Bindingsaffiniteten til TLS11a-GC ble bestemt ved hjelp en konkurranse metode. Etter inkubasjon med umerket TLS11a-GC, ble bindingsstedene på LH86 celler helt okkupert. Da vil alle cellene ble videre inkubert med dye-merket TLS11a. Fordi alle bindingsseter på cellemembranen var okkupert av umerket TLS11a-GC, kan farvestoff-merket TLS11a ikke bindes til LH86-celler, og etter vasking ingen fluorescens-signal ble påvist (Fig. 2d). Samtidig, en konkurranse eksperiment mellom TD05-GC og fargestoff merket TLS11a ble gjennomført. Fordi TD05-GC ikke ble bundet til LH86, bindingssetene var tilgjengelig for interaksjon med fargestoff-merket TLS11a, noe som resulterer i en høy fluorescens-signal (fig. 2e). Etter modifisering med lang GC hale, flowcytometri data viste tydelig at TLS11a-GC kan fortsatt binde seg til LH86 celler, mens TD05-GC kunne ikke.
Doksorubicin meldingen ble undersøkt ved hjelp av konfokal mikroskopi. Etter 1 time inkubasjon med doxorubicin eller aptamer-DOX-konjugater, ble cellene inkubert ytterligere i 3 timer ved 37 ° C før avbildning. Figur 2f viser at celler behandlet med fri doksorubicin hadde den mest Doxorubicin i sine kjerner, mens kjerner av celler behandlet med TLS11a-GC-DOX-konjugater (fig. 2g) inneholdt også doxorubicin. Imidlertid kjerner av cellene behandlet med TD05-GC-DOX-konjugater (fig. 2h) inneholdt nesten ingen doxorubicin. Dette eksperimentet bekreftet at TLS11a-GC-DOX-konjugater hadde spesifikk binding affinitet til LH86 celler sammenlignet med TD05-GC-Dox konjugater. Videre Dox kan bli løslatt fra TLS11a-GC-Dox konjugater etter internalisering og kunne gå inn i kjernen.
Cell Giftig Aptamer-Dox Konjugater
Cellen levedyktighet LH86 behandlet med TLS11a-GC -Dox, TD05-GC-Dox, doksorubicin, TLS11a-GC, eller TD05-GC ble testet og sammenlignet med den i ubehandlede celler (fig. 3a). Den doxorubicin konsentrasjon i TLS11a-GC-Dox, TD05-GC-Dox, og fri doksorubicin ble holdt ved 7,5 uM, og forholdet mellom Doxorubicin til aptamer var 25:1. Den aptamer-konsentrasjonen i TLS11a-GC, GC-TD05, TLS11a-GC-Dox, og TD05-GC-Dox-grupper ble holdt ved 300 nM. Fra dataene vist i figur 3a, TLS11a-GC og TD05-GC hadde ingen signifikant effekt på celle levedyktighet. Det er åpenbart at behandling med TLS11a-GC-DOX-konjugater redusert cellelevedyktighet. Effektiviteten av celletoksisitet var Doxorubicin TLS11a-GC-Dox TD05-GC-Dox. Selv om cellen toksisitet av TLS11a-GC-Dox var mindre enn den for fri doksorubicin, giftigheten effekten av TD05-GC-Dox var mye dårligere. Ytterligere eksperimenter med Hu1229 humane normale leverceller (Fig. 3b) viste at gratis Dox hadde signifikant toksisitet, mens TLS11a-GC-Dox og TD05-GC-Dox hadde lignende og svært begrenset toksisitet. Disse data viser at spesifisiteten til aptamer TLS11a-GC til LH86 celler oppnådd toksisitet overfor målceller bare
(a) relativ cellelevedyktighet LH86 (mål-cellelinje).; (B) Relativ celle levedyktighet Hu1229 (humane normale leverceller); (C) Hoechst 33258 farging for apoptotiske og døde LH86 celler behandlet med en serie av konsentrasjoner av TLS11a-GC-Dox eller TD05-GC-Dox; (D) Western blot resultater for spaltede caspase 3 i LH86 celler behandlet med en serie av konsentrasjoner av TLS11a-GC-Dox eller TD05-GC-Dox.
celle apoptose ble undersøkt ved anvendelse av Hoechst 33258 farging ( fig. 3c). Fra fluorescens bilder, når den Dox-konsentrasjonen var 60 uM, var det mer apoptotiske og døde celler i TLS11a-GC-Dox-gruppen (35,1%) enn i den TD05-GC-Dox-gruppen (13,7%), noe som ytterligere indikerer spesifisiteten av aptamer-Dox konjugater. I tillegg ble kaspase 3 aktiveringen overvåket ved hjelp av Western blot (Fig. 3d). Caspase 3 spiller en viktig rolle i celle apoptose, og spaltet caspase 3 indikerer dens aktivering. Fra dataene som er vist, da den Dox-konsentrasjonen var 60 uM, bandet tettheten av spaltet caspase 3 i celler behandlet med TLS11a-GC-Dox var 3,3 ganger høyere enn i celler behandlet med TD05-GC-Dox.
In Vivo
studier
Tretti NOD. Cg-Prikdc (scid) IL2-mus ble behandlet som beskrevet i den eksperimentelle delen. Tumorstørrelsen hos hver mus ble målt hver annen dag, og den gjennomsnittlige tumorvolum ble beregnet (fig. 4a). Dataene viser at både fri Dox og TLS11a-GC-DOX-komplekset hadde tydelig tumor-inhiberende effekter sammenlignet med den ubehandlede gruppen. Også, TLS11a-GC-DOX-komplekset hadde en mer effektiv virkning sammenlignet med fri Dox, noe som indikerer at TLS11a-GC-DOX-konjugater målrettet tumorcellene og oppnådde høyere lokal Dox konsentrasjon i tumorstedet sammenlignet med fri Dox. Også, ble tumorer i hver mus oppsamlet og løst under anvendelse av 10% formalin i 24 timer. Så alle prøver ble sendt til molekylær patologi kjernen lab for H E farging. Fra H E beiset lysbilder, den TLS11a-GC-DOX kompleks-behandlede tumor (Fig. 4b, høyre) viste signifikant tumorcelle nekrose i forhold til ubehandlet tumor (figur 4b, venstre.)
(. a) Gjennomsnittlig tumorvolum hos mus behandlet med noe (sort), doxorubicin (rød), eller TLS11a-GC-Dox (blå); (B) Mikroskopi bilder av H . E farget tumorvev lysbilder
Diskusjoner
Aptamer TLS11a ble generert ved hjelp av musen leverkreftceller, men det viser også høy bindende affinitet til human lever kreftceller. Videre er TLS11a den første aptamer å bli identifisert som spesifikke for humane leverkreftceller. Våre resultater viste at målmolekylet av TLS11a er meget sannsynlig at et membranprotein som kan bli internalisert inn i cellene. Disse resultatene indikerer at TLS11a kan være et nyttig aptamer for målrettet levering av legemidler i leveren behandling av kreft.
Doxorubicin spiller en meget viktig rolle i leverkreft behandling, og det anses å være den mest anvendt anticancer medikament over hele verden. Dox er i stand til å hemme celleproliferering ved innskyting av DNA i cellekjernen. Flere rapporter har vist at fri Dox er membran-gjennomtrengelige og kan uptaken av celler gjennom en passiv diffusjon mekanisme, hurtig transportert til kjerner, og bundet til det kromosomale DNA. [29] Derfor, mens Dox er generelt toksisk for prolifererende celler, er det også giftige for normale celler, og dermed begrense dens terapeutiske virkning i klinisk bruk. Her, ved å gjøre bruk av modifikasjon av en spesifikk leverkreft aptamer og interkalering egenskap av Dox, genererte vi en enkel, rask og effektiv metode for å levere Dox til målrettet kreftceller. Under
in vitro
eksperimenter, viste vi den spesifikke binding affinitet modifisert TLS11a-GC å målrette LH86 celler, men ikke-anerkjennelse til humane normale leverceller. Videre demonstrerte vi den spesifikke toksisitet av TLS11a-GC-Dox-komplekset til målceller, sammenlignet med normale leverceller, for derved å begrense dens giftighet for bare målceller. Denne målrettingen ble oppnådd gjennom den spesifikke binding affinitet aptamer TLS11a. Selv TLS11a-GC-Dox oppnås god celletoksisitet sammenlignet med kontroll TD05-GC-Dox under MTS analysen, ble mindre toksisitet observert i TLS11a-GC-Dox gruppen enn i den frie Dox gruppen. Dessuten ble mindre intern og frigjøring av Dox i TLS11a-GC-Dox gruppen enn i den frie Dox gruppen observert ved hjelp av konfokal mikroskopi. Dox i seg selv er et lite molekyl som kan bli hurtig uptaken av celler gjennom en passiv diffusjon mekanisme. Innen 15 min ble cellene behandlet med fri Dox viser en intens rød fluorescens i atom regionen, noe som indikerer at opptaket hastigheten er meget hurtig. [29] Imidlertid, når Dox ble interkalert i DNA aptamer for å danne et mye større molekyl, celle opptak av aptamer-Dox-komplekset var i hovedsak avhengig av aptamer og dens cellemembranen mål. I tillegg aptamer internalisering kreves mer tid (ca. 2 timer) enn fri Dox, og dermed bremse internalisering av aptamer-Dox-komplekset og frigjøring av Dox fra komplekset. Derfor ble mindre toksisitet observert i TLS11a-GC-Dox gruppen enn i den frie Dox gruppe under
in vitro
eksperimenter. Under
in vivo
eksperimenter, TLS11a-GC-Dox hadde redusert celle intern hastighet i forhold til gratis Dox. Men på grunn av target gjenkjennelse av TLS11a aptamer, ble den lokale konsentrasjon av Dox økt, sammenlignet med fri Dox. Derfor var høyere tumorinhibering effektivitet oppnådd i TLS11a-GC-Dox-behandlede mus gruppe.
I sammendrag, ved å gjøre bruk av evnen til antracyklin-legemidler til intercalate mellom baser av nukleotidene, en ny utforming for å modifisere aptamer TLS11a til TLS11a-GC og gjøre Dox og TLS11a-GC konjugater ble undersøkt. Spesifisitet og effekt av denne konjugat for å tjene som en narkotika-levering plattform ble ytterligere demonstrert
in vitro Hotell og
in vivo
. Våre data viser at den modifiserte aptamer beholder sin spesifisitet og kan lastes mye mer Dox enn umodifisert aptamer. Også, aptamer-DOX-konjugater er stabile i cellekulturmedium og kan differensielt målrette LH86 celler. Spesifisiteten til dette systemet ble videre demonstrert ved behandling av humane normale leverceller som mangler aptamer bindingen målet. Den aptamer-DOX-konjugatet forhindrer den ikke-spesifikke opptak av Dox og reduserer cellulær toksisitet til de ikke-målceller. Videre
in vivo
forsøket viste bedre svulst hemming av TLS11a-GC-Dox gruppen sammenlignet med alle andre kontrollgrupper, noe som indikerer vellykket levering av Dox av den modifiserte aptamer. Dette målretting spesifisitet enn en høyere lokal Dox konsentrasjon i tumoren. I tillegg aptamer-DOX-konjugater er mindre enn antistoffbasert levering av legemidler systemsand et annet avgivelsessystem, [30], [31] som tillater raskere gjennomtrengning og færre immunreaksjoner. Vi forventer at den nydesignede aptamer-Dox konjugering plattformen, som er basert på intercalation av antracykliner innen baser av aptamerer, kan benyttes i forskjellige måter å utvikle nye målrettede terapeutiske metoder for mer effektiv kreft kjemoterapi.
materialer og metoder
Cell Kultur og reagenser
LH86 cellene er blitt beskrevet tidligere. [21] Cellene ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (varmeinaktivert) og 100 IU /ml penicillin-streptomycin ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 5% CO
2. Doksorubicinhydroklorid (Dox) ble kjøpt fra Fisher Scientific (Houston, Texas, USA). Alle reagenser for DNA-syntese ble kjøpt fra Glen Research. Med mindre annet er angitt, ble reagenser, buffere og løsemidler oppnås kommersielt fra Fisher Scientific.
Bøyning av Aptamer-Dox
Aptamer TLS11a (5′
ACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTG TTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCTG
-3 « ); en kontrollsekvens TD05
(5′-CACCGGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCG GTG-3 «).; modifisert aptamer TLS11A-GC (5»
CGCGCGCGCGCGCGC GCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGACAGCATCCCCATGTGAACAATCGCATTGTGATTGTTACGGTTTCCGCCTCATGGACGTGCT G
-3 «); og endret kontrollsekvens TD05-GC (5»
CGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGAACACCGTGGAGGATAGTTCGGTGGCTGTTCAGGGTCTCCTCCCGGTG
-3 «) Ble syntetisert på en ABI3400 DNA /RNA synthesizer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). De ferdige sekvenser ble deretter avbeskyttet i AMA (ammoniumhydroksyd /40% vandig metylamin 01:01) ved 65 ° C i 30 minutter og ytterligere renset ved omvendt-fase HPLC (ProStar, Varian, Walnut Creek, CA, USA) på en C- -18 kolonne ved å bruke 100 mM trimetylamin-acetat-buffer (TEAA, pH 7,5) og acetonitril som mobil fase. For å gjøre aptamer-DOX-konjugater, ble enten TLS11a-GC eller TD05-GC blandet med doxorubicin i bindingsbuffer (PBS inneholdende 5 mM MgCl
2, 4,5 mg /ml glukose, 0,1 mg /ml gjær tRNA, 1 mg /mL BSA) eller DMEM media på en 1:25 ratio på aptamer til Dox.
Overvåking av Complex Dannelse av Fluorescens
Fysiske konjugater mellom aptamer (TLS11a eller TD05) og doxorubicin var forberedt på en 1 :28 molforhold på aptamer mot Doxorubicin (10 uM) i bindingsbuffer, og fluorescens ble overvåket ved 500-720 nm (1,5 mm spalte) på en Fluorolog-Tau-3 spektrofluorometer (Jobin Yvon) med eksitasjon ved 480 nm.
Bestemmelse av Aptamer Affinity
LH86 cellene ble løsnet fra retter ved hjelp av ikke-enzymatisk celledissosiasjon oppløsning (Cellgro) og deretter vasket med vaskebuffer (PBS inneholdende 5 mM MgCl
2 og 4,5 mg /mL glukose). Bindingsaffiniteten til TLS11a ble bestemt ved å inkubere cellene LH86 (10
5) på is i 30 minutter med en serie av konsentrasjoner av biotin-merket TLS11a i bindingsbuffer (100 ul). Cellene ble deretter vasket to ganger med vaskebuffer (1,0 ml) og suspenderes i fluorescein-merket streptavidin (0,1 ml) i ytterligere inkubasjon (15 min på is). Før flowcytometrisk analyse, ble cellene vasket med vaskebuffer to ganger og suspenderes i vaskebuffer (0,2 ml). Den midlere fluorescensintensitet av celler ble anvendt for å beregne den likevekts-dissosiasjonskonstanten (Kd) av TLS11a og LH86 celle-interaksjon ved montering av avhengighet av fluorescens-intensitet (F) på konsentrasjonen av den biotin-merkede TLS11a (L) til ligningen F = Bmax [L] /(Kd + [L]). Bindingsanalysen Forsøkene ble gjentatt minst tre ganger.
For å overvåke bindingsaffiniteten TLS11-GC, ble et konkurranseeksperiment utført. I korte trekk ble 200 nM TLS11a-GC inkubert med LH86-celler i 20 minutter på is, og deretter ble 1 mM biotin-merkede TLS11a ble tilsatt i 15 minutter ytterligere inkubasjon. Cellene ble deretter vasket to ganger med vaskebuffer (1,0 ml) og suspenderes i fluorescein-merket streptavidin (0,1 ml) i ytterligere inkubasjon (15 min på is). Før flowcytometrisk analyse ble cellene vasket med vaskebuffer to ganger og suspendert i vaskebuffer (0,2 ml).
Vurdering av Cell Opptak av Dox av konfokalmikroskopi
For confocal bildebehandling, Doxorubicin eller aptamer -Dox konjugatene ble inkubert med en LH86 celle monolag i en 35-mm glassbunn kulturskål (Mat Tek Corp.) i DMEM-medium ved 37 ° C i 1 time. Etter vasking en gang ved hjelp av media, ble friskt medium tilsatt til retter for ytterligere 3 timers inkubasjon ved 37 ° C. Deretter retter med cellene ble plassert over en 40 × Målet med et Olympus FV500-IX81 konfokal mikroskop (Olympus America Inc., Melville, New York). En 5-mW, 488 nm Ar + laser ble så brukt for eksitasjon av doxorubicin. Målet brukes til bildebehandling var et Olympus LC Plan F1 40X /0.60 ph 2 40 × objektiv.
MTS celleviabilitet analysen
kjemosensitivitet av LH86 til Dox eller aptamer-DOX-konjugater ble bestemt ved hjelp av CellTiter 96 celleproliferasjon analysen (Promega, Madison, WI, USA). I korthet ble en 100 ul alikvot av LH86-celler (5 x 10
4 celler /ml) ble podet i 96-brønners plater (
n
= 3) og tillatt å vokse over natten. Etterpå ble cellene behandlet med 100 pl av: 1) kontroll aptamer TD05-GC, 2) aptamer TLS11a-GC, 3) Dox, 4) TD05-GC-Dox fysisk konjugat (25:1 Doxorubicin til TD05-GC-molforhold) eller 5) TLS11a-GC-Dox fysisk konjugat (25:1 Doxorubicin til TLS11a molforhold) i 1 time, vasket og videre inkubert i friskt medium for totalt 48 timer. For måling cytotoksisitet, ble mediet fjernet fra hver brønn, og deretter CellTiter reagens (20 ul) og media (100 ul) ble tilsatt til hver brønn og inkubert i 3 timer. Ved hjelp av en plateleser (Tecan Safire mikroplateleser, AG, Sveits), ble absorpsjonen registrert ved 490 nm. Prosentandelen av cellelevedyktigheten ble bestemt ved å sammenligne Dox og aptamer-DOX-konjugatet-behandlede celler med den ubehandlede kontroll.
Hoechst 33258 Farging for apoptotiske celler
celle apoptose ble bestemt ved kjerne morfologi endring. LH86 celler i eksponentiell vekst ble plassert i en 48-brønns plate ved en sluttkonsentrasjon på 1,5 x 10
4 celler per brønn. Etter 12 timer ble cellene behandlet med forskjellige konsentrasjoner av TD05-GC-Dox fysisk konjugat (25:1 Doxorubicin til TD05-GC-molforhold) eller TLS11a-GC-Dox fysisk konjugat (TLS11a molforhold 25:1 Doxorubicin til) i 1 time, vasket og videre inkubert i friskt medium for totalt 48 timer. Deretter ble cellene vasket to ganger med PBS og farget med Hoechst 33258 fargeløsning i henhold til produsentens instruksjoner. Etter inkubering ved 37 ° C i 10 min, ble cellekjernen fragmentering /kondensasjon påvist ved fluorescens mikroskopi. Apoptotisk celledød ble bestemt ved å beregne antallet av apoptotiske celler med kondenserte kjerner i seks til åtte tilfeldig utvalgte områder. Resultatene viste representerer tre uavhengige eksperimenter.
Western blotting analyse
Celler ble høstet og vasket to ganger med fosfat-saltvannsbuffer. Cellepelletene ble resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende Nonidet P-40 (10 mM HEPES, pH 7,4, 2 mM EGTA, 0,5% Nonidet P-40, 1 mM NaF, 1 mM NAVO
4, 1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 1 mM ditiotreitol, 50 ug /ml trypsininhibitor, 10 ug /ml aprotinin og leupeptin) og inkubert på is i 30 min. Etter sentrifugering ved 12000 x g ved 4 ° C i 15 minutter, ble supernatanten overført til et nytt rør, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt. Ekvivalente prøver (20 ug protein) ble underkastet SDS-PAGE på 12% geler. Proteinene ble overført til nitrocellulosemembraner og probet med de angitte primære antistoffer (spaltet caspase-3-antistoff, Cell Signaling Technology, Inc.), etterfulgt av de passende sekundære antistoffer konjugert med pepperrot peroksidase (HRP, Santa Cruz Biotechnology, Inc.). Immunreaktive bånd ble påvist ved hjelp av forbedret chemiluminescence (ECL, Pierce). Molekyl størrelser av proteinene detektert ble bestemt ved sammenligning med prestained proteinmarkører (Bio-Rad). Alle band tettheter ble beregnet ved hjelp ImageJ programvare.
In vivo
Experiment
NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 mus ble kjøpt fra Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) og holder til i Dyreavdelingen ved Universitetet i Florida med institusjonell regulatorisk godkjenning (Institutional Animal Care og bruk Committee). Denne studien ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité med godkjenning ID IC00001331. Tretti NOD. Cg-Prkdc (SCID) IL2 mus ble subkutant injisert med 7 × 10
6
in vitro
-propagated LH86 celler. Når tumorene kan lett sees og måles, ble musene delt i tre grupper: (1) gruppe 1, ubehandlet; (2) gruppe 2, behandlet med gratis Dox; og (3) gruppe 3, behandlet med TLS11a-GC-DOX kompleks. Den Doxorubicin dosering ble holdt i samme i gruppene 2 og 3 ved 2 mg /kg. Alle behandlinger ble fortsatt i 11 dager. Legemidler ble injisert gjennom halevenen på dagene 1, 2, 3, 4, 5, 9, 10, og alle prøver ble samlet på dag 11. Tumor størrelse for hver mus ble målt hver annen dag. Hjerte, lunge, lever, nyre og tumor hos hver mus ble samlet på dag 11 og fikseres ved hjelp av 10% formalin i 24 timer ved romtemperatur, og deretter hematoxylin og eosin-farging (H & Co. E-farging) ble utført
.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Confocal bilder av aptamer flekker med dyrkede LH86 celler. Celler ble inkubert med aptamer konjugert med biotin, og bindingen arrangementet ble observert med AlexaFluor 633-konjugert streptavidin. Ikke-bindende sekvens TD05 viste bakgrunnen bindende. Aptamerer vise betydelig binding over bakgrunnssignalet
doi:. 10,1371 /journal.pone.0033434.s001 plakater (TIF)
Figur S2.
