Abstract
Bakgrunn
tumor suppressor homeodomain-samspill protein kinase- 2 (HIPK2) ved å fosforylere serin 46 (Ser46) er en viktig regulator av p53 apoptotisk funksjon. HIPK2 er også en transkripsjons co-repressor av hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) besøksforbud tumor angiogenese og chemoresistance. HIPK2 kan deregulert i svulster ved flere mekanismer, inkludert hypoksi. Her søkte vi å målrette hypoksi ved å gjenopprette HIPK2 funksjon og undertrykke HIF-1α, for å gi bevis for involvering av både HIPK2 og p53 motvirke hypoksi-indusert chemoresistance.
metodikk /hovedfunnene
ved eksponering av tykktarm og lunge kreftceller til hypoksi, enten ved lavt oksygen eller kobolt, ble HIPK2 funksjon svekket som åpner for økt HIF-1α uttrykk og hemme p53-apoptotiske respons på stoffet. Cobalt trykt HIPK2 rekruttering på HIF-1α promoter. Hypoksi indusert ekspresjon av p53 target MDM2 som nedregulerer HIPK2, og dermed MDM2 hemming av siRNA restaurert HIPK2 /p53Ser46 reaksjon på stoffet. Sink tilskudd til hypoksi-behandlede celler økte HIPK2 protein stabilitet og kjernefysisk akkumulering, fører til restaurering av HIPK2 binding til HIF-1α promoter, undertrykkelse av MDR1, BCL2, og VEGF gener, og aktivering av p53 apoptotiske respons på stoffet. Kombinasjon av sink og ADR sterkt undertrykket tumorvekst
in vivo
ved å hemme HIF-1 sti og oppregulering p53 apoptotiske målgener.
Konklusjon /Betydning
Vi viser her til første gang at hypoksi-indusert HIPK2 deregulering ble motvirket av sink som gjen HIPK2 undertrykkelse av HIF-1 sti og reaktivert p53 apoptotisk respons på narkotika, understreker den potensielle bruken av sink tilskudd i kombinasjon med cellegift for å ta hypoksi og forbedre svulst behandling.
Citation: Nardinocchi L, Puca R, Sacchi A, Rechavi G, Givol D, D’Orazi G (2009) Targeting Hypoksi i kreftceller ved å gjenopprette homeodomain Samhandle Protein-kinase 2 og p53 aktivitet og Undertrykke HIF-1α. PLoS ONE 4 (8): e6819. doi: 10,1371 /journal.pone.0006819
Redaktør: Mikhail V. Blagosklonny, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 02.07.2009; Godkjent: 03.08.2009; Publisert: 28 august 2009
Copyright: © 2009 Nardinocchi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av Grant fra Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) (GDO) og Flight Attendants Medical Research Institute (FAMRI) (GR); RP har vært støttet av et fellesskap fra den italienske Foundation for Cancer Research (Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro -FIRC. De bevilgende myndighet hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet.
konkurrerende interesser: forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Solide svulster kan overleve hypoksisk tilstand (høy celletetthet av en svulst begrenser tilgjengeligheten av oksygen. til celler) ved hjelp av beskyttende mekanismer inkludert aktivering av hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) en transkripsjonsfaktor som induserer bl.a. antiapoptotic BCL2, multiresistens (MDR), VEGF-genekspresjon, og omprogrammering av glukosemetabolismen som står for celleproliferasjon, angiogenese, og chemoresistance [1]. Videre demper hypoksi responsen av oncosuppressor p53 til cellulær skade [2]. p53-proteinet spiller viktige roller i vekstarrest, cellulær reparasjon og celledød, som minimerer forplantningen av maligne celler [3]. Funksjonen til p53 som en tumor suppressor er koblet til sin aktivitet som en transkripsjonsfaktor gjennom posttranslational modifikasjoner som tillater proteinet å unnslippe MDM2 kontroll, akkumuleres, og blir aktive [4]. P53-genet er mutert i ~ 50% av humane cancere, mens, i kreftformer som bærer villtype (wtp53), kan dens aktivitet bli svekket av andre mekanismer, inkludert deregulering av regulatoriske proteiner [5], [6].
homeodomen-veksel proteinkinase-2 (HIPK2) er en viktig regulator av p53-apoptotisk funksjon, slik vi har tidligere vist at HIPK2 fosforylerer p53 ved serin 46 (Ser46) etter kraftig DNA-skade, indusering av p53 bestemt apoptotiske transkripsjonen aktivitet [7] – [9]. Fosforylering på dette området er en sen hendelse etter alvorlig skade på DNA og spesifikt regulerer p53-indusert apoptose gjennom for eksempel oppregulering av p53AIP1 gen i stedet for cellesyklus arrestert beslektede gener og MDM2 genuttrykk [10], [11]. En stor autoregulerende, negativ feed-back løkke av p53 omfatter p53-avhengig induksjon MDM2 som i sin tur binder og inaktiverer p53 ved å kjøre det til proteasomal degradering [12] – [14]. I denne forbindelse har vi vist at HIPK2 nøytraliserer MDM2 hemming redde p53 transkripsjonen aktivitet og apoptotisk funksjon [15]. Derfor agenter som HIPK2 som kan øke aktive p53 i tumorceller ved hindre MDM2-p53 interaksjon kan ha terapeutisk nytte i sensibiliserende tumorceller til kjemo- eller radioterapi.
HIPK2 er også en transkripsjonen co- repressor ofte i multiprotein kompleks med andre co-repressors som Groucho og hystone deacetylase 1 (HDAC1) [16]. Vi har nylig funnet ut at HIPK2 co-undertrykker hypoksi-induserbar faktor-1α (HIF-1α) transkripsjonsfaktor besøksforbud HIF-1-indusert tumor angiogenese og chemoresistance [17]. Inhibering av HIF-1α aktivitet ved HIPK2 reduserer VEGF, MDR1, og BCL2 uttrykk og stimulerer medikament-indusert apoptose i p53-avhengig og-uavhengig måte [18]. Gitt sin sentrale rolle i målretting av celler mot apoptose på gentoksisk stress, har regulering av HIPK2 vært gjenstand for intens etterforskning i de siste årene. HIPK2 ble funnet downmodulated i skjoldbruskkjertel, bryst [19] og kolon-kreft [20] i forhold til de respektive normale vev; muterte innenfor det flekk retensjonssignal i humane akutt myeloblastisk leukemi og myelodysplastisk syndrom [21]; og delocalized i cytoplasma med høy mobilitet gruppe A1 (HMGA1) overekspresjon [22]. HIPK2 er en ustabil protein som er degradert via proteasome sti særlig nyere studier viste at HIPK2 kan downmodulated av p53-indusert MDM2 [23] og ved hypoksi-indusert Siah2 proteiner [24]. Vi har nylig vist at HIPK2 knockdown induserer p53 misfolding som kan tilbakestilles ved sinktilskudd [25], [26]. Derfor vil alle de forhold som fører til HIPK2 deregulering ende i en multifaktoriell reaksjon som fører til tumor chemoresistance ved sterkt å påvirke p53 transkripsjonen aktivitet og apoptose på den ene siden og HIF-1-aktivitet på den annen side. Derfor kan en forståelse av hvordan downregulated HIPK2 kan bli reaktivert føre til nye strategier for å både begrense HIF-1 sti og reetablere p53 aktivitet for å overvinne resistens. Dette er også i tråd med nyere arbeider som har vist at behandling av kreft ved anti-angiogene midler kan føre til hypoksi som velger for radio og narkotika motstand, og understreker behovet for å ta svulsten hypoksi i kreft [27].
sink er en viktig kofaktor for DNA-bindende aktivitet av p53, som noen p53-mutasjoner som forstyrre den sink-bindingssetet i p53 resultere i tap av DNA-binding [28]. Sink er et sporelement som er nødvendig for den normale funksjon av celler og er en kofaktor for strukturen og funksjonen av et bredt utvalg av cellulære proteiner, inkludert enzymer, transkripsjonsfaktorer, og strukturelle proteiner [29]. Dermed sink er en viktig forutsetning for utviklingen av mange signalprosesser i eukaryoter og deregulering av metabolismen kan indusere DNA-skade og kreftrisiko [30]. Behandling med sink ble vist å ha reell klinikken potensial, redusere tumorvekst og aggressivitet med begrenset biotoxicity, for eksempel i prostata kreft [31].
Formålet med undersøkelsen var å vurdere om hypoksi kan deregulere HIPK2- indusert p53 avhengige apoptotisk transkripsjonen aktivitet i respons til stoffet, og dermed bidra til chemoresistance og om sink kan motvirke dette HIPK2 /p53Ser46 hemming. Vi har funnet at eksponering av tumorceller til hypoksi, ved enten lav oksygen eller kobolt, hemmet p53Ser46 fosforylering og p53 apoptotisk transkripsjonen aktivitet i respons på medikamentet. Denne inhibering var følgen av HIPK2 nedregulering på grunn, i det minste delvis, til hypoksi-indusert oppregulering MDM2. På den annen side, kobolt hemmet HIPK2 rekruttering på HIF-1α promoter. Spesielt, sink tilskudd til hypoksi-behandlede celler motvirket hemming av HIPK2 la sitt atom opphopning som korrelert med HIF-1α downmodulation og undertrykkelse av HIF-1 sti og med restaurering av p53Ser46 apoptotisk transkripsjonen aktivitet i respons til stoffet. Til sammen disse resultatene viser at hypoksi-tilstanden kan påvirke HIPK2 /p53Ser46 vei, særlig viser vi her for første gang at sink kan nøytralisere hypoksi-indusert HIPK2 hemming. Siden svulster inneholder områder med hypoksiske forhold der wtp53 er inaktiv, disse resultatene støtter den potensielle bruken av sink tilskudd til kjemoterapi i behandling av svulster med ikke-fungerende wtp53 eller HIPK2.
Resultater
Cell eksponering kobolt opphever p53 apoptotiske-gentranskripsjon og reduserer HIPK2 rekruttering på HIF-1α promoter
Vi spurte om kobolt klorid (CoCl
2), som stabiliserer HIF-1α og induserer HIF-1 responsive gener med kinetikk lignes med hypoksi [32], kan påvirke legemiddel-indusert apoptotisk p53 gentranskripsjon. Som vist i figur 1A, kobolt sterkt avskaffet ADR-indusert PARP cleavage og Ser46 fosforylering. Cobalt alene indusert p53 nivåer, selv om det verken indusere Ser46 fosforylering eller PARP cleavage (figur 1A). P53-apoptotiske transkripsjonen aktivitet ble evaluert ved luciferase-assay. Som vist i figur 1B, ble den ADR-indusert p53AIP1-luc-aktivitet signifikant svekket av kobolt, mens kobolt alene ikke påvirker den, og
in vivo
analyse av mRNA-nivåer viste at medikament-indusert oppregulering av p53 apoptotiske målgener
Bax Hotell og
Puma
var sterkt svekket av kobolt (figur 1C), som vist også av uttrykket forholdet til GAPDH. Motsatt, vi hadde tidligere vist at kobolt kan indusere
MDR1
, og
BCL2
genuttrykk [18].
(A) RKO celler ble behandlet med CoCl
2 og ADR i 16 timer, alene eller i kombinasjon. Lik mengde av total celle-ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting med spesifikke antistoffer detektere Ser46 fosforylering og PARP-spaltning (piler: uspaltede og spaltede former); total p53 er også vist. Anti-tubulin ble anvendt som protein lasting kontroll. (B) RKO celler, stabilt transfektert med p53AIP1-Luc reporter, ble behandlet med CoCl
2 og ADR for 16 timer før luciferase aktivitet ble analysert. RLU: relative luciferase enhet.
Kolonner
, mener av tre uavhengige eksperimenter utført i to eksemplarer;
barer
, S.D. *
P
0,01. (C) Totalt mRNA ble reverstranskribert fra RKO celler behandlet med CoCl
2 og ADR alene eller i kombinasjon, i 16 timer for PCR-analyser av p53 målgener
Bax
og
Puma
. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. Expression-forholdet til GAPDH ble bestemt ved densitometrisk analyse av genekspresjon. *
P
. 0,01
Som hypoksi tilstand fremmer i hvert fall delvis HIPK2 protein degradering [24] vi spurte om kobolt var i stand til å ha tilsvarende effekt HIPK2 uttrykk og aktivitet. For dette formål ble HIPK2 proteinnivåer undersøkt i RKO og A549-celler behandlet med CoCl
2 i nærvær eller fravær av proteasominhibitor MG132. Som vist i figur 2A, kobolt downregulated HIPK2 proteinnivåene som kan bli reddet med MG132 behandling. Analyse av mRNA-ekspresjon viste at HIPK2 gentranskripsjon ikke ble påvirket av kobolt (figur 2B). Vi tenkte at ved å holde HIPK2 proteinnivået lavt, kan kobolt påvirke HIPK2 rekruttering på målet arrangører, og dermed påvirke HIPK2 co-repressor aktivitet. Til støtte for denne hypotesen, utførte vi ChIP analysen mens kromatin immunkomplekser ble immunopresipitert med anti-HIPK2 og anti-histondeacetylase 1 (HDAC1) antistoffer og PCR-analyse utført ved hjelp spesifikke primere flankerer HIF-1α promoter [17]. Som vist i figur 2C (venstre panel), den HIPK2 og HDAC1 rekruttering på
HIF-1α
promoteren var sterkt svekket av kobolt. Som en kontroll av HIPK2 bindende spesifisitet til
HIF-1α
promoter, brukte vi spesifikke primere som strekker seg over den menneskelige
GAPDH
promoter-regionen. Som forventet (figur 2C, panel til høyre), ingen
GAPDH
forsterkning ble observert etter kromatin immunoprecipitation med anti-HIPK2 og anti-HDAC1 antistoffer mens en klar PCR bånd ble påvist ved hjelp av genomisk DNA som templat. Til sammen viser disse resultatene at kobolt kan påvirke både p53 og HIPK2 aktivitet.
(A) RKO og A549-celler ble behandlet med kobolt i 16 timer i nærvær eller fravær av proteasominhibitor MG132 (40 umol /l 6 timer) og kjøretøyet DMSO. Lik mengde av total celle-ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting med spesifikt antistoff påvisning av endogene HIPK2 proteinnivåer; anti-Hsp70 ble anvendt som protein lasting kontroll. (B) Totalt mRNA ble revers transkribert fra RKO og A549 celle behandlet med kobolt for 16 timer for PCR-analyser av HIPK2 genuttrykk. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (C) Chromatin immunoprecipitation (chip) analyse utført med anti-HIPK2 og anti-HDAC1 antistoffer på RKO celler behandlet med kobolt for 8 og 16 timer. PCR-analyser ble utført på immunoutfelt DNA-prøver ved hjelp av spesifikke primere for menneske
HIF-1α
promoter. Forsterkning av
GAPDH
promoter (høyre panel) ble brukt som kontroll av HIPK2 bindende spesifisitet til
HIF-1α
promoter. En prøve som representerer lineær forsterkning av tilførte kromatin (Input) ble tatt med som kontroll. Tilleggskontroller inkludert immunoprecipitation utført med ikke-spesifikke immunglobuliner (Ingen Ab).
Hypoksi-indusert hemming av p53 transkripsjon aktivitet kan tilbakestilles ved MDM2 uttømming
HIPK2-mediert p53Ser46 fosforylering er indusert av alvorlige DNA-skade [7] – [9], som i en tilbakekoblingsreguleringssløyfe, styrker HIPK2 aktivitet gjennom en p53-mediert caspase-indusert mekanisme [33] og selektivt induserer apoptotiske gener og hemmer cellesyklus-stans-beslektet og MDM2 gener [10], [11]. På den annen side kan en ikke-alvorlig stress downregulate HIPK2 gjennom p53-indusert MDM2 oppregulering [23]. Derfor spurte vi om hypoksi kan fungere som ikke-alvorlig stress i stand til å aktivere p53-target MDM2 og dermed hemme HIPK2 og disponere for resistens. Semikvantitativ RT-PCR-analyser viste at kobolt samt lavt oksygen indusert oppregulering MDM2 (figur 3A). Deretter undersøkte vi om MDM2 var ansvarlig for hemming av p53 apoptotisk aktivitet. Analyse av p53 transkripsjonen aktivitet følgende kobolt behandling ble utført i 293-celler ko-transfektert med p53AIP1-luc reporter og enten HIPK2-flagg eller HIPK2-K1182R-Flag punkt mutant som ikke kan nedbrytes av MDM2 [23]. Som vist i figur 3B, ble HIPK2-indusert AIP1-luc-aktivitet betydelig redusert ved kobolt mens den K1182R-indusert AIP1-luc-aktivitet ikke ble endret. Western immunoblotting viste at HIPK2 ekspresjon ble redusert med kobolt mens ekspresjonen av nedbrytningsresistente K1182 mutant ikke ble påvirket (figur 3C). Etter avtale, også HIPK2-indusert Ser46 fosforylering ble redusert med kobolt, mens det ikke ble endret etter K1182 overekspresjon (figur 3C). Begge resultatene antydet en involvering av MDM2 i HIPK2 regulering som i sin tur påvirket p53Ser46 aktivitet. For å teste denne hypotese, ble RKO-celler utarmet av MDM2 funksjon av siRNA (figur 3D), og dette MDM2 uttømming var tilstrekkelig til å redde ADR-indusert fosforylering Ser46 og PARP-spaltning hemmet av kobolt (figur 3E og sammenligne med 1A). Videre MDM2 utarming motvirket kobolt-indusert hemming av p53AIP1-Luc aktivitetsnivået til ADR (figur 3F og sammenligne med 1B). Til sammen tyder disse data på at den hypoksi-indusert medikamentresistens var avhengige, i det minste delvis, ved oppregulering av MDM2 uttrykk som i sin tur inhibert HIPK2 /p53Ser46 apoptotisk aktivitet som respons på medikamentet.
(A) Totalt mRNA ble reverstranskribert fra RKO og A549 celle behandlet med kobolt eller 2% O
2 i 16 timer for PCR-analyser av MDM2 genekspresjon. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (B) 293-celler ble ko-transfektert med p53AIP1-luc reporter og HIPK2-Flag eller K1182R-Flag (MDM2 degradering-resistent mutant) ekspresjonsvektorer og 24 timer senere behandlet med CoCl
2 i 16 timer, før luciferase-aktivitet var analysert. RLU: relative luciferase enhet.
Kolonner
, mener av tre uavhengige eksperimenter utført i to eksemplarer;
barer
, S.D. *
P
0,01. (C) Cellene ble behandlet som i (B) og etter behandling like mengder av total-celleekstrakter ble underkastet Western-immunblotting ved å bruke de angitte antistoffer: anti-Flag (for å påvise ektopisk HIPK2-Flag uttrykk), anti-Ser46 og anti-p53- antistoffer. (D) RKO-celler ble transfektert med siMDM2 og 36 timer senere lik mengde av det totale celle-ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting med spesifikt anti-MDM2 antistoff. (E) RKO-celler ble transfektert med siMDM2 og 24 timer senere ble behandlet med CoCl
2 og ADR i 16 timer. Lik mengde av total celle-ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting med spesifikke antistoffer detektere p53Ser46 fosforylering og PARP-spaltning (piler viser spaltede og uspaltede former); total p53 er også vist. Anti-tubulin ble anvendt som protein lasting kontroll. (F) RKO celler, stabilt transfektert med p53AIP1-Luc reporter, ble transfektert med siMDM2 og 24 timer senere behandlet med CoCl
2 og ADR i 16 timer før luciferase aktivitet ble analysert. RLU: relative luciferase enhet.
Kolonner
, mener av tre uavhengige eksperimenter utført i to eksemplarer;
barer
, SD
Sink gjenoppretter ADR-indusert p53 apoptotiske-gentranskripsjon i kobolt-behandlede celler
Vi har nylig vist at HIPK2 uttømming er ansvarlig for p53 protein misfolding som kan tilbakestilles ved sinktilskudd [25], [26]. Derfor, vi hypotese her at hypoksi-indusert HIPK2 deregulering kan speile HIPK2 knockdown tilstand og dermed påvirke p53 DNA-bindende og transkripsjons aktiviteter. Vi har funnet at kobolt økt p53 reaktivitet til PAb240 antistoff (mutant, utfoldet p53 form) og redusert p53-reaktivitet til den Pab1620 antistoff (vill-type, brettet form) (figur 4A) som indikerer p53-protein misfolding, og derfor undersøkt hvorvidt sink supplementation var i stand til å gjenopprette wtp53 aktivitetsnivået til stoffet. Til dette formål evaluert vi først
in vivo
wtp53 DNA-bindende aktivitet ved hjelp ChIP analyse. RKO-celler ble behandlet med kobolt og ADR i nærvær eller fravær av sink og endogent p53 immunorecipitated med polyklonalt anti-p53-antistoff (FL393). Mengden av ko-utfelt p53-bindingselementer i pulspromotorer ble bestemt ved PCR. Resultatene viste at kobolt kraftig redusert p53 binding til arrangører av apoptotiske gener som
Puma Hotell og
DR5
i respons til ADR og at dette hemming ble sterkt tilbakestilt ved sinktilskudd (figur 4B). P53-spesifikk binding til
Puma Hotell og
DR5
arrangører ble bekreftet av
GAPDH
arrangøren forsterkning etter kromatin immunoprecipitation med anti-p53 antistoff (figur 4B). Således p53 apoptotisk transkripsjonen aktivitet spesifikt indusert ved ADR (Noxa-luc versus p21-luc), ble hemmet av kobolt og gjenopprettet ved sinktilskudd (figur 4C). Spesielt, sink alene ikke induserer p53 transkripsjonen aktivitet. Videre vurderte vi om HIPK2-indusert p53 transkripsjonen aktivitet hemmet av kobolt (figur 3B) kan gjenopprettes ved sink. For å oppnå dette målet, 293-celler ble ko-transfektert med p53AIP1-luc reporter og HIPK2 ekspresjonsvektor. Som vist i figur 4D, sink tilskudd fullstendig restaurert HIPK2-indusert p53AIP1-luc-aktivitet redusert med kobolt, mens behandling med kobolt eller sink alene induserte ikke p53AIP1 luciferase-aktivitet. I avtalen ble ADR-indusert p53 apoptotiske gentranskripsjon hemmet av kobolt (figur 4E, sammenlign spor 2 med spor 3) og restaurert av sink tilskudd (figur 4E, sammenlign spor 3 med 4) til de samme nivåene av ADR behandling (Figur 4E sammenligne spor 4 med kolonne 2). Spesielt, gjorde sink tilskudd til kobolt ikke indusere apoptotisk gentranskripsjon (figur 4E, spor 5). Til slutt ble apoptotisk celledød evaluert ved Western immunblotting som viser at inhibering av PARP-spaltning og Ser46 fosforylering av kobolt eksponering av ADR-behandlede celler (figur 4F, sammenlign spor 2 med spor 4) ble sterkt gjenopprettet av sink (figur 4F, sammenlign spor 4 med spor 5). Disse dataene tyder på at sink var i stand til å reaktivere den hypoksi-inhiberte endogene wtp53 DNA-bindende og apoptotiske transkripsjonelle aktiviteter som respons på medikamentet, ved å motvirke, i det minste delvis, det HIPK2 dereguleringen.
(A) RKO cellene ble behandlet med kobolt i 16 timer og lik mengde av det totale celleekstrakter ble immunopresipitert med konformasjon-spesifikk Pab1620 (for villtype, brettet p53 form) og Pab240 (for mutant, utfoldet p53-form) antistoff og analysert ved Western-immunblotting med anti- p53 polyklonale antistoff (FL393). De representative band fra minst to uavhengige forsøk er presentert, som viser økning av PAb240 reaktivitet og reduksjon av Pab1620 reaktivitet etter kobolt behandling. En ikke-spesifikk (N.S.) signal er vist som protein lasting kontroll. (B) Chromatin immunoutfelling (chip) analyse utført med anti-p53-antistoff på RKO celler eksponert for ZnCl
2 og CoCl
2 i 24 timer og Adriamycin i 16 timer. PCR-analyser ble utført på immunoutfelt DNA-prøver ved hjelp av spesifikke primere for p53 target
Puma Hotell og
DR5
arrangører. Forsterkning av
GAPDH
promoter (høyre panel) ble brukt som kontroll av p53 bindende spesifisitet til
Puma Hotell og
DR5
arrangører. En prøve som representerer lineær forsterkning av tilførte kromatin (Input) ble tatt med som kontroll. Tilleggskontroller inkludert immunoprecipitation utført med ikke-spesifikke immunglobuliner (Ingen ab). (C) RKO-celler ble transfektert med p21-luc og Noxa-Luc rapportører og 24 timer senere behandlet med ZnCl
2 og CoCl
2 etter henholdsvis 24 timer og Adriamycin i 16 timer, før luciferaseaktivitet ble analysert. Resultatene er normalisert til p-galaktosidase-aktivitet som vist gangers induksjon sammenlignet med ubehandlede celler;
barer
, S.D. (D) 293-celler ble ko-transfektert med p53AIP1-luc reporter og HIPK2-Flag ekspresjonsvektor og 24 timer senere behandlet med ZnCl
2 og CoCl
2 i 16 timer, før luciferaseaktivitet ble analysert. RLU: relative luciferase enhet.
Kolonner
, mener av tre uavhengige eksperimenter utført i to eksemplarer;
barer
, S.D. *
P
0,01. (E) Totalt mRNA ble revers transkribert fra RKO celler behandlet som i (C) for PCR-analyser av p53 målgener
Noxa Hotell og
Puma
. GAPDH ble benyttet som intern kontroll. (F) RKO celler ble behandlet med ZnCl
2 og CoCl
2 i 24 timer og ADR i 16 timer og lik mengde av den totale celle-ekstrakter analysert ved hjelp av Western-immunblotting med anti-PARP (piler viser den uspaltede og spaltet PARP ), anti-Ser46 og anti-p53-antistoff. Anti-Hsp70 ble brukt som protein lasting kontroll.
Sink går tilbake dysfunksjonell HIPK2 i hypoksi-behandlede celler
Neste vi søkt å vurdere om sink kan motvirke hypoksi-indusert HIPK2 downregulation og påvirke HIPK2 binding til kromatin. Som vist i figur 5A (venstre panel) kobolt-indusert HIPK2 protein nedregulering ble reddet av sink-tilskudd mens sink alene ikke endret HIPK2 nivåer. Omvendt, kobolt behandling oppregulert HIF-1α uttrykk og denne effekten ble robust falt av sink tilskudd (figur 5A, panel til høyre). Subcellulære fraksjonering viste at kobolt behandling redusert både cytoplasma og kjernefysiske HIPK2 atomnivå, selv om HIPK2 atomnivå ble sterkere påvirket av kobolt og at denne effekten ble tilbakestilt av sink tilskudd (figur 5B). Sink alene ikke påvirker HIPK2 nivåer (Figur 5B). Lignende resultater ble oppnådd med lavt oksygenbehandling (figur 5C). Vi analyserte neste HIPK2 katalytisk aktivitet etter kobolt behandling. Til dette formål, ble 293-celler transfektert med tom vektor eller flagg HIPK2-Flag-ekspresjonsvektoren i nærvær eller fravær av kobolt eller sink, etterfulgt av immunoutfelling av ektopisk HIPK2 med anti-Flag-antistoff og
in vitro kinaseanalyse
med den kjente HIPK2 fosforyleringen substrat myelin basisk protein (MBP) [7]. Som vist i figur 5D, ektopisk HIPK2 var fortsatt i stand til å fosforylere MBP etter behandlinger, noe som tyder på at hypoksi sannsynligvis ikke påvirker HIPK2 katalytisk aktivitet, i hvert fall i vår eksperimentelle tilstand.
(A, venstre panel) Subkonfluente RKO celler ble utsatt for CoCl
2 og ZnCl
2 alene eller i kombinasjon i 16 timer, og lik mengde av det totale celle-ekstrakter ble analysert ved hjelp av Western-immunblotting med spesifikt antistoff som viser endogen HIPK2 nivå. Anti-tubulin ble brukt som protein lasting kontroll (høyre panel). Lik mengde atom ekstrakter av RKO celler behandlet som ovenfor, ble analysert ved Western immunoblotting med spesifikke antistoffer oppdage HIF-1a nivåer. Anti-Hsp70 ble brukt som protein lasting kontroll. (B) RKO celler behandlet som i (A) ble lysert for nukleær og cytoplasmisk fraksjonering og analysert ved Western-immunblotting ved anvendelse av anti-HIPK2 antistoff. Anti-tubulin og anti-NFYB antistoffer ble brukt for protein lasting kontroll av cytoplasmiske og kjernefraksjoner, henholdsvis. (C) RKO og A549-celler ble behandlet med 2% O
2 i nærvær eller fravær av sink i 16 timer, og lik mengde av atom celle-ekstrakter analysert ved hjelp av Western-immunblotting med spesifikke antistoffer som detekterer HIF-1α og HIPK2 atomnivå . Anti-Hsp70 ble brukt som protein lasting kontroll. (D) Kinase analyse av ektopisk HIPK2 i 293-celler transfektert med tom flagget eller HIPK2-Flag ekspresjonsvektor ubehandlet eller behandlet med kobolt eller sink i 16 timer. Lik mengde av total celle-ekstrakter ble immunopresipitert ved bruk av anti-Flag-antistoff og analysert for kinase-aktivitet ved anvendelse av MBP som substrat. Lik ekspresjon av MBP-proteinet ble bekreftet ved comassie-farging av kinase assay. (E) Chromatin immunoutfelling (chip) analyse utført med anti-HIPK2 antistoff på RKO celler behandlet som i (A). PCR-analyser ble utført på immunoutfelt DNA-prøver ved hjelp av spesifikke primere for menneske
HIF-1α
promoter. Forsterkning av
GAPDH
promoter (høyre panel) ble brukt som kontroll av HIPK2 bindende spesifisitet til
HIF-1α
arrangøren En prøve som representerer lineær forsterkning av tilførte kromatin (Input) ble inkludert som kontroll. Tilleggskontroller inkludert immunoprecipitation utført med ikke-spesifikke immunglobuliner (Ingen ab). (F, øvre panel), ble totalt mRNA revers transkribert fra RKO celler behandlet med ZnCl
2 og CoCl
2 i 24 timer og ADR for 16 timer henholdsvis for PCR-analyser av HIF-1 målgener
BCL2
,
MDR1
, og
VEGF
. Ratio: uttrykket forholdet til GAPDH. (F, lavere nivå) densitometrisk analyse av genekspresjon plottet som uttrykket forholdet til GAPDH, brukt som intern kontroll. Elevens
t
test ble brukt for statistisk analyse av sammenligningen mellom verdiene av kobolt og kobolt pluss sink, og av CoCl
2 /ADR og CoCl
2 /ADR /ZnCl
2 som vist. *
P
0,01. (G) RKO-celler utarmet av HIPK2 funksjon av siHIPK2 ble behandlet med ZnCl
2 og CoCl
2 i 24 timer og ADR i 16 timer, henholdsvis, og total mRNA revers transkribert for PCR-analyser som i (F).
den motsatte effekten av hypoksi på HIPK2 og HIF-1α nivåer er forbundet gjennom repressor effekten av HIPK2 på
HIF-1α
promoter. Dermed blir kobolt-indusert bortfall av HIPK2 rekruttering på
HIF-1α
promoter ble sterkt tilbakestilt av sink (figur 5E). Den HIPK2 spesifikk binding til
HIF-1α
promoter ble bekreftet av
GAPDH
arrangøren forsterkning etter kromatin immunoprecipitation med anti-p53 antistoff. Derfor RT-PCR-analyse viste at kobolt-indusert
BCL-2
,
MDR1 Hotell og
VEGF
genekspresjon ble betydelig undertrykt av sink (figur 5FD, sammenligne CoCl
2 baner med CoCl
2 /ZnCl
2 baner), som også er vist ved uttrykket forholdet til GAPDH (figur 5F, nedre panel). Videre ADR behandling i kombinasjon med kobolt var ikke i stand til å hemme kobolt-indusert HIF-1 pathway (figur 5E, sammenligne COCI
2 baner med CoCl
2 /ADR baner) med mindre i kombinasjon med sink (figur 5F sammenligne COCI
2 /ADR baner med CoCl
2 /ADR /ZnCl
2 baner). Rollen HIPK2 i kobolt-indusert HIF-1 mål ble videre evaluert etter HIPK2 uttømming. Som vist i Figur 5G, basalnivået
MDR1 Hotell og
BCL2
genekspresjon var allerede høy i siHIPK2 celler, i samråd med våre tidligere resultater på HIPK2 repressor aktivitet av HIF-1α [17 ], [18], og kunne ikke bli undertrykt av sink behandling (Figur 5G og sammenligne med 5F). Virkningen av sink motvirke hypoksi resultat ble bestemt som en antioksidant, dvs. vitamin C, fikk hverken downmodulate HIF-1 målgener og heller ikke påvirkes medikament respons (data ikke vist). Til sammen disse resultatene viser at sink motvirket hypoksi-indusert HIPK2 downmodulation, utvinnes HIPK2 rekruttering til kromatin og førte til undertrykkelse av HIF-1 vei.
Sink forbedrer kjemoterapeutisk respons in vivo
Å evaluere den terapeutiske effekt av en kombinasjon av sink og kjemoterapi
in vivo
genererte vi tumorxenografter i atymiske nakne mus. Musene ble deretter forbehandlet med ZnCl
2 i 8 timer før ADR injeksjon og deretter behandlet hver dag med sink. Mus behandlet med ADR alene i løpet av 2 uker viste reduksjon av tumorvolumet på tilsvarende måte med de som ble behandlet med sink alene (figur 6A). Interessant, tilsetning av sink betydelig forbedret effekt av ADR fører til markert hemming av tumorveksten (adriamycin + sink
versus
Adriamycin:
P
0,01) (figur 6A og 6B).
