Abstract
invasjon og påfølgende metastaser er den viktigste årsaken til død av kreft, inkludert prostatakreft. Heri vi rapportere om potensielle svulst undertrykkende egenskaper Rab7, en GTPase som regulerer handel med lysosomer. Bevegelsen av lysosomer til celleoverflaten som respons på miljø signaler øker utskillelsen av proteinaser og celle invasjon. Vi fastslått at Troglitazone og andre medlemmer av tiazolidindion familien hemme celleoverflate rettet lysosome menneskehandel og cathepsin B sekresjon gjennom en Rab7 avhengig mekanisme. Videre ble Rab7 shRNA uttrykker celler funnet å være mer invasive
in vitro Hotell og
in vivo
. Økt invasivitet ble ledsaget av økt ekspresjon av c-Met-reseptoren og forlenget nedstrøms signalering, for derved å understøtter en rolle for Rab7 som en formidler av signaleringsnedregulering. Samlet utgjør disse resultatene antydet at Rab7 fungerer som en negativ regulator av prostata tumorvekst og invasjon, gir ytterligere bevis for sitt potensial som en tumor suppressor
Citation. Steffan JJ, Dykes SS, Coleman DT, Adams LK , Rogers D, Carroll JL, et al. (2014) Støtter en rolle for GTPase Rab7 i Prostate Cancer Progresjon. PLoS ONE 9 (2): e87882. doi: 10,1371 /journal.pone.0087882
Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australia
mottatt: 18. august 2013, Godkjent: 05.01.2014; Publisert: 05.02.2014
Copyright: © 2014 Steffan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble finansiert av National Institutes of Health gi NIH R01 CA104242. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har følgende konflikter: BJW er for tiden ansatt ved Astellas Pharma USA, Inc a. selskap med interesser i onkologi terapi; men dette sysselsettingen inntruffet etter manuskriptet ferdigstillelse og selskapets område av interesse representerer ikke en direkte konkurrerende interesse. Alle andre forfattere har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Dannelse av metastaser fra en invasiv primære svulsten er sentral hendelse i prosessen ledende til kreft-assosiert dødsfall. Dødeligheten for sent stadium prostata kreft (metastatisk sykdom) har ikke bedret seg betydelig i løpet av det siste tiåret; derfor er en forståelse av mekanismene bak tumorinvasjon og metastasering, og utvikling av terapi for å hindre tumorprogresjon presserende behov. Den hepatocytt vekstfaktor (HGF) -Met signaleringsaksen er en viktig regulator av tumorcelleinvasjon og metastase [1]. Ligand-induserte c-Met signalering er kjent for å indusere et epitelial-mesenkymale overgang (EMT) hvori epitelceller miste celle-celle adhesjon og innta en mer motile, mesenchymale fenotype [2]. Induksjonen av EMT er antatt å øke tumorcellemigrering og invasjon gjennom basalmembraner. I tillegg til Met-signalering, kan også andre faktorer i svulsten mikromiljøet som hypoksi, aerob glykolyse, og sure ekstracellulære pH (Phe) økt tumorcelle-invasjon [3], [4].
tumorinvasjon krever ofte sekresjon av proteolytiske enzymer, selv om noen former for cellemigrasjon /invasjon er protease-independen [5], [6]. Selv proteinase sekresjon kan skje via konstitutivt aktiv sekresjon vei, har store roller for lysosome-lokaliserte proteaser påvist i tumorcelle invasjon [7], [8]. Vi har tidligere vist at sure Phe og HGF indusere handel med lysosomer til celleoverflaten, noe som resulterer i økt cathepsin B sekresjon [9], [10]. Dette er viktig med henblikk på cathepsin B og D lokalisering detekteres i bryst og melanom-modell som reaksjon på Ras-transformasjon eller endringer i Phe [11], [12]. I tidligere publikasjoner, har vi vist at den romlige plasseringen av lysosomer i tumorceller er viktig for celle invasjon [10], [13]. Når lysosomer er plassert nærmere til celleoverflaten, en økning i utskilte proteaser og celle invasjon blir detektert; mens, når lysosomer er plassert nærmere den cellekjernen. (bort fra celleoverflaten, dvs. sammenstilt til cellekjernen) tumorceller utskiller færre proteinaser og er betydelig mindre invasiv
lysosomer er trafikkert hele celler langs mikrotubuler og /eller actin filamenter som anvender molekylære motor proteiner så som dyneins, kinesins, og /eller myosin-familiemedlemmer [14]. I tillegg er flere GTPases som RhoA, Rab7, Rab27, og ARF familiemedlemmer regulere motor protein aktivitet eller rekruttering, og dermed regulerer fordelingen av lysosomer og andre endocytiske vesikler [15], [16].
Rab7 er en regulator av intracellulær endocytic /membran trafficking og er involvert i mange sykdomstilstander, inkludert kreft og flere infeksjonssykdommer (anmeldt i [17]). Rab7, med en av sine effektorer, RILP (Rab7-samspill lysosomal protein), rekruttere dynein-dynactin motor komplekse til lysosomer tilrettelegge lysosome smugling langs mikrotubuli mot cellekjernen [18]. Videre, i tillegg til sin rolle føres i vesikkel-handel, Rab7 har nylig fått oppmerksomhet som en regulator av apoptose i respons til vekstfaktor uttak [19], og har blitt foreslått å virke som en tumor suppressor protein [20].
Inhibitorer av natrium-proton-vekslere (NHEs) har vist seg å være svært effektive i å forebygge celleoverflate rettet lysosomet trafikk, og reduserer dermed protease sekresjon og celle invasjon [9], [10], [13]. EIPA (5 – (
N
etyl-
N
isopropyl) -amiloride) har vist seg å forebygge surt Phe og HGF-indusert celleoverflaten styrt lysosome menneskehandel; mens, medlemmer av tiazolidindion familie av forbindelser som har vist seg å forhindre sure Phe-indusert celleoverflate-rettet lysosomet handel. Vår tidligere arbeid bestemt forbindelser troglitazon og EIPA både utnytte en Rab7 avhengig mekanisme for å indusere juxtanuclear lysosome aggregering (JLA) [13]. Troglitazon er en av flere medlemmer av tiazolidindion (TZD) familie av syntetiske høy affinitet ligander for transkripsjonsfaktor peroksisom proliferator-aktiverte reseptor-γ (PPAR- γ). Men disse forbindelsene, inkludert ciglitazon (CIG), rosiglitazon (Rosi, Avandia), og pioglitazon (Pio, Actos), utstillings PPAR- γ uavhengige effekter, og vårt laboratorium har vist potent effekt av troglitazon på sure Phe-indusert lysosome distribusjon å være uavhengig av PPAR- γ men krever Rab7 (TZDs anmeldt i [21]). Faktisk ble det nylig vist at lysosomer trafikk til celleoverflaten i celler som uttrykker Rab7 shRNA (uavhengig av ekstern stimulus) antyder at Rab7 er en negativ regulator av celleoverflate-rettede lysosomet handelen [10]. I tillegg Rab7 shRNA uttrykke celler utstilt økte nivåer av utskilte proteaser og var mer invasive
in vitro product: [10], [13].
Heri presenterer vi flere linjer med dokumentasjon som viser at Rab7 kan spille en undertrykkende rolle i tumorvekst og progresjon, noe som tyder for det første at Rab7 er en antatt tumor suppressor
in vivo
. Troglitazone nødvendig Rab7 å hindre HGF-indusert protease sekresjon og tumorcelle invasjon
in vitro.
I tillegg Rab7 shRNA uttrykker celler dannet større svulster
in vivo
, som viste økt spredning, redusert apoptose, og økt invasiv kapasitet til omkringliggende vev. Endelig shRNA mediert reduksjon av Rab7 ført til en økning i c-Met
in vitro Hotell og
in vivo
gir en mulig mekanisme for å ta høyde for disse endringene.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Ingen menneskelig vev ble brukt i denne studien. Alle dyrene som brukes i denne studien fikk human omsorg basert på retningslinjer fastsatt av American Veterinary Medical Association (AVMA) samt i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (Institutt for Forsøksdyr Research, Washington, DC ). Alle protokoller som involverer levende dyr er gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité LSU Health Sciences Senter-Shreveport. Dette settet med eksperimenter ble utført under godkjent protokoll P-07-059. Alle forsøk ble gjennomført for å redusere dyrs lidelser, for å redusere antall dyr som brukes, og for å utnytte alternativer til in vivo teknikker, hvis tilgjengelig.
Cell Culture
Den menneskelige prostatakreft cellelinje DU -145 ble kjøpt fra ATCC og vedlikeholdes i RPMI-1640 (Mediatech) med 10% FBS (Gemini bio-produkter) og 1% penicillin-streptomycin (Mediatech). Celler ble opprettholdt i en 37 ° C inkubator med 5% CO
2 og var sub-dyrket på å oppnå . 75% samløpet
Reagenser og antistoffer
Phalloidin, 1:100 ble kjøpt fra Molecular Probes. a-Tubulin antistoff, 1:1000, ble kjøpt fra Lab Vision. LAMP-1 antistoff (H4A3), 01:50, ble kjøpt fra utviklingsstudier hybrid Bank ved Universitetet i Iowa, USA. De følgende antistoffer ble benyttet for Western bloting: pMet, pakt, pErk1 /2, (1:1000), spaltet-caspase-3 (1-200) (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA), Rab7 (1:1000 ) (Sigma, St. Louis, MO, USA), c-Met (vevsprøver 1:500) (Abcam, Cambridge, MA, USA), c-Met (1:1000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Ki67 (01:50) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). Fluoroforen-konjugert sekundære antistoffer (1:100) ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch Laboratories (Westrgrove, PA, USA). IHC sekundære antistoffer (1:200) ble kjøpt fra Vector Labs (Burlingame, CA, USA). HGF (Calbiochem, San Diego, CA, USA) ble brukt på 33 ng /ml.
Utvinning av protein fra Frosne tumorprøver
Frosne tumorprøver ble først fortynnet i iskald RIPA buffer som inneholder Roche proteasehemmere cocktail (Indianapolis, Indiana, USA), NaF, og NaVO4 på en 1:05 ratio, masse og volum. Prøvene ble homogenisert manuelt ved hjelp av en morter, etterfulgt av kort ultralydbehandling, og plassert på is i 20 minutter med periodevis risting. Prøvene ble deretter sentrifugert ved 12000 g i 10 minutter for å fjerne uoppløselige rester. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt ved BCA-analyse og lik protein ble fortynnet i Laemmli-buffer og kokt i 10 minutter.
Cathepsin B Sekresjon Assay
analysen ble utført som tidligere beskrevet [9], [10] . HGF ble innført i kulturer i 18 timer ved 33 ng /ml.
immunfluorescens (mellomfrekvens) Farging og Mikros
I.F. mikroskopi ble utført som tidligere beskrevet [9], [10]. I korthet ble cellene fiksert med iskald 4% PFA for 20minutes. Cellene ble deretter vasket i PBS og deretter inkubert med anti-LAMPE-1 (H4A3-r Iowa State University Hybridom Bank) ved en fortynning i 1:100 BSP i en time ved romtemperatur. Cellene ble så vasket, og inkubert med 594 Dylight anti-mus (Jackson IR) ved en fortynning i 1:100 BSP i en time ved romtemperatur. Phalloidin ble deretter anvendt for å flekke aktin cytoskjelettet (phalloidin 488, Molecular Probes) og ble inkubert i 20 minutter ved 1:200 i BSP ved romtemperatur. Lysbilder ble montert med DAPI inneholder SlowFade gull reagens (Invitrogen S36938). Celler ble fotografert ved hjelp av et Olympus BX-50 mikroskopet med MetaMorph programvare. Bilder ble slått sammen ved hjelp ImageJ.
lysosome Distribusjon Analyse
lysosome distribusjon fra kjernen ble målt ved hjelp av LysoTracker programvare, en sjenerøs gave fra Meiyappan Solaiyappan (Johns Hopkins). Totalt 25 celler som spenner fra tre uavhengige eksperimenter ble analysert for hvert datasett.
Western Blot analyse
Western blot analyse ble utført som tidligere beskrevet [9].
lentiviral Levering av Short-hårnål RNA
korte hårnål RNA (shRNA) rettet mot Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCTGACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) ble levert inn DU145 prostatakreftceller (skape stabil Rab7 shRNA uttrykke celler) ved hjelp av Mission lentiviral Transduction Partikler (Sigma) i henhold til produsentens protokoll og som tidligere beskrevet [9]. Ikke Target shRNA uttrykker celler ble generert ved hjelp av samme metode med en kontroll vektor rettet mot noen kjente pattedyrgener (Sigma shc202V).
Invasion analysen
Invasion analysene ble utført som tidligere beskrevet [10], [1. 3]. HGF ble tilsatt i serumfritt medium til både den øvre og nedre kamre ved en konsentrasjon på 33 ng /ml. Resultater representerer gjennomsnittlig antall invaderte celler i fire synsfelt per tilstand fra tre uavhengige eksperimenter.
In vivo
Eksperimenter
Seks til åtte uker gamle SCID /bg mus ble injisert med 2 × 10
6 DU145 prostata kreftceller stabilt uttrykker enten egge (non-target, NT) shRNA eller shRNA rettet til Rab7 i 100 mL PBS subkutant (n = 6 NT shRNA; n = 7 Rab7 shRNA) . Svulster ble målbar etter dag 41 etter implantasjon og ble målt med digitale calipers to ganger per uke. Tumorvolumene ble beregnet ved ligningen: Volum = π /6 * * Lengde Bredde
2. Mus ble avlivet ved 104 dager etter implantasjon og tumorer ble kirurgisk fjernet og fiksert i 10 prosent formaldehyd eller frosset. Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjer fastsatt av LSUHSC-S Institutional Animal Care og bruk komité.
Immunohistochemistry
Immunohistochemistry ble utført ved hjelp av standard DAB teknikker. Kort sagt ble de formalinfikserte tumorer behandlet og innstøpt i parafin. Disse blokkene ble deretter seksjonert, deparaffinized, og rehydrert i xylen og gradert etanol vasker. Antigener ble avslørt med forvarmet antigen gjenfinning buffer i 15 minutter og deretter avkjølt. 0,3% H
2o
2 i metanol ble plassert på objektglass i 30 minutter for å blokkere endogen peroksyder, etterfulgt av et protein som (serum) blokk i 10 min. Primært antistoff ble deretter tilsatt i 1 time ved den angitte fortynning. Biotinylert sekundært antistoff (1:200) ble deretter tilsatt i 30 min. Biotin binding ble øket ved hjelp av ABC Elite-metoden (Vector Labs) i 30 min og flekker ble visualisert med DAB (Vector Labs) i 7 min. Lysbilder ble kontra med hematoksylin i 2 min.
Statistical Analysis
GraphPad Software, Prism 3.0 ble brukt til å utføre alle statistikker. Ett eller tosidige Mann-Whitney t-tester ble utført for å indikere statistisk signifikans. Alle grafene viser standardfeilen for gjennomsnittet (SEM).
Resultater
Troglitazone Hindrer HGF-indusert Cell Surface-rettet lysosome Trafficking, Cathepsin B sekresjon, og Cell Invasion
Vi har tidligere vist at HGF kan indusere celleoverflate-rettet handelen med lysosomer [10]. I tillegg har vi vist at Troglitazone forhindret sure Phe-indusert celleoverflate rettet lysosomet handelen [13]. For å bestemme om Troglitazone kan også hindre HGF-indusert celleoverflate-rettet lysosomet handel, DU145 prostatatumorceller ble ko-behandlet med 10 uM Troglitazone og 33 ng /mL HGF i 16 timer, hvoretter lysosomer ble visualisert ved mellomfrekvens mikroskopi ved bruk av LAMP1 (lysosom-assosiert membranprotein-1) som en tidligere etablert lysosomet markør [9]. Representant mellomfrekvens Bildene i figur 1A viser at HGF indusert handel med lysosomer til celleoverflaten som tidligere publisert og at Troglitazone ikke bare hindret HGF-indusert celleoverflaten styrt menneskehandel, men også indusert retrograd menneskehandel og sammenvoksing av lysosomer i tilknytning til cellekjerner. Lysosomer coalesced over microtubule organiserende senter (MTOC) i Troglitazone behandlede celler (data ikke vist [13]). Kvantifisering av lysosomet plassering etterhvert som avstanden fra cellekjernen (ved hjelp av tidligere beskrevne programvare [9], [22], figur 1B) viste at HGF forårsaket omfordeling av lysosomer mot celleoverflaten (bort fra cellekjernen) og Troglitazone hindret HGF indusert celleoverflaten styrt lysosome trafficking.
A) DU145 prostata kreftceller ble behandlet med 10 mm Troglitazone og /eller HGF over natten, etterfulgt av IF mikroskopi for å visualisere lysosomer (røde), aktin (grønn), og kjerner (blå). Troglitazon fører også til lysosomer for å klynge juxtanuclear til cellekjerner. B) Kvantitering av den romlige fordelingen av lysosomer er vist som midlere avstand fra individuelle cellekjerner for hver behandling tilstand. Feilfelt representerer s.e.m av 30 celler fra minst tre uavhengige forsøk. C) DU145-celler ble behandlet i 16 timer med Troglitazone og /eller HGF og mengden av Cathepsin B utskilt i kulturmediet ble detektert ved bruk av en cathepsin B aktivitetsanalyse (se metoder og materialer). D) DU145-celler ble sådd ut på Matrigel-belagte Transwell innsatser og lov til å invadere i 24 timer. Behandlinger ble tilsatt er angitt i både toppen og bunnen av innsatsen. * Statistisk signifikans (p 0,001) versus kontroll; ** Statistisk signifikans (p 0,01) sammenlignet med kontroll. Skala barer: 10 mikrometer
For å demonstrere en funksjonell konsekvens av lysosome menneskehandel, ble aktiviteten av cathepsin B utskilt i kulturmedier målt.. Økningen i katepsin B-aktivitet er direkte proporsjonal med mengden av cathepsin B utskilt fra tumorcellene [9]. Figur 1C viser at Troglitazone betydelig hindret HGF-indusert cathepsin B sekresjon. Til slutt ble Matrigel belagt Transwell inserts benyttes til å utføre
in vitro
invasjon analyser. Troglitazon vesentlig hindret invasjonen av HGF behandlede celler (figur 1D). Nedgangen i invasjonen var ikke på grunn av celledød (data ikke vist [10])
Medlemmer av tiazolidindion (TZD) Familie av forbindelser Forskjellig Hemme HGF-indusert Cell Surface-rettet lysosome Trafficking og Cell Invasion.
Troglitazone er medlem av tiazolidindion familien av forbindelser. Derfor testet vi muligheten for andre TZDs å hemme HGF-indusert celleoverflaten styrt lysosome trafficking og celle invasjon. Som vist i fig S1A og kvantifisert i fig S1B, ciglitazon og Rosiglitazon også hindret celleoverflate rettet lysosomal handelen; mens, Pioglitazone hadde ingen effekt. De ulike effekter av de tre TZDs på lysosome clustering ble rangert: Troglitazone ciglitazon = Rosiglitazon. Siden Pioglitazon hadde ingen effekt på lysosomet handel, sammenlignet vi effektene av Troglitazone og Pioglitazon på celle invasjon. Figur S1C viser at Troglitazone betydelig hemmet celle invasjon gjennom Matrigel belagt filtre; mens, Pioglitazone hadde ingen effekt på celle invasjon, noe som tyder på at den romlige plasseringen av lysosomer er en iboende viktig aspekt i tumorcelle invasjon.
Den Rab7 GTPase er nødvendig for forebygging av HGF-indusert Cell Surface-rettet lysosome trafficking, cathepsin B sekresjon, og Cell Invasion
Selv om vi har nylig innblandet Rab7 som en negativ regulator av lysosome menneskehandel, cathepsin B sekresjon, og celle invasjon [10], [13], vi har ikke demonstrert den rollen av Rab7 i sammenheng med Troglitazone og HGF. Derfor, DU145 celler som uttrykker Rab7 shRNA (Rab7 knockdown var 95% sammenlignet med en ikke-target (NT) shRNA uttrykkende cellelinje (figur 2C innfelt) [10]), ble behandlet med HGF eller Troglitazone i 16 timer. HVIS. mikroskopi (figur 2A) viste at Rab7 var nødvendig for Troglitazone å hindre HGF-indusert celleoverflaten styrt lysosome menneskehandel. I tillegg ble lysosomer i Rab7 shRNA uttrykkende celler funnet nærmere celleoverflaten, selv i fravær av HGF. Kvantifisering av nucleus-lysosome avstand (figur 2B) viser at lysosomer er betydelig lengre fra cellekjerner og at Troglitazone var ineffektive til å indusere juxtanuclear lysosome aggregering i Rab7 shRNA uttrykker celler.
A) mellomfrekvens mikroskopi ble utført på DU145 prostata kreftceller uttrykker enten en non-target (kryptert) shRNA eller en Rab7 styrt shRNA å visual lysosomer (rød), aktin (grønn), og kjerner (blå). Rab7 shRNA uttrykk hindrer Troglitazone-indusert juxtanuclear lysosome clustering og fører til lysosomene til trafikk til celleoverflaten uavhengig av HGF. B) Kvantitering av den romlige fordelingen av lysosomer er vist som midlere avstand fra individuelle cellekjerner for hver behandling tilstand. Feilfelt representerer s.e.m av 30 celler fra minst tre uavhengige forsøk. C) NT og Rab7 shRNA uttrykker DU145-celler ble behandlet i 24 timer med Troglitazone og /eller HGF og mengden av Cathepsin B utskilt i kulturmediet ble detektert ved bruk av en cathepsin B aktivitetsanalyse (se metoder og materialer). Cathepsin B sekresjon økes og Troglitazone ikke lenger forhindrer sekresjon i Rab7 knockdown cellene. Inset indikerer LAMP-en og Rab7 uttrykk i ikke-target (NT) eller Rab7 shRNA (KD) stabile cellelinjer ved hjelp av Western blot. D) NT og Rab7 shRNA uttrykker DU145 cellene ble sådd ut på Matrigel-belagte Transwell inserts og lov til å invadere i 24 timer. Behandlinger indikert ble tilsatt til både toppen og bunnen av innsatsen. * Statistisk signifikans (p 0,001) versus NT kontroll; ** Statistisk signifikans (p 0,01) sammenlignet med NT-kontroll. Skala barer: 10 mikrometer
I likhet med fordelingen av lysosomer, demonstrerte Rab7 shRNA uttrykker cellene økt cathepsin B sekresjon i fravær av HGF (figur 2C).. Videre Troglitazone var ute av stand til å hindre HGF-indusert cathepsin B sekresjon i celler som uttrykker Rab7 shRNA. Lignende resultater ble oppnådd for celle invasjon. Troglitazon forhindret HGF-induserte økning i tumorcelle invasjon i NT shRNA kontrollceller, men ikke i de Rab7 knockdown-celler (figur 2D). Videre Rab7 shRNA uttrykkende celler var signifikant mer invasive sammenlignet med NT shRNA-celler i fravær av en hvilken som helst stimulus. Tatt sammen disse dataene tyder på at jeg.) Rab7 uttrykk er nødvendig for Troglitazone å hindre HGF-indusert lysosome trafficking og ii.) Rab7 fungerer som en negativ regulator av celleoverflaten styrt lysosome trafficking, cathepsin B sekresjon, og tumorcelle invasjon.
Rab7 shRNA uttrykke Svulster vokse seg større på grunn av økt spredning og Redusert apoptotiske priser
Siden Rab7 shRNA uttrykker DU145 cellene var mer invasive
in vitro
, ble disse cellene injisert subkutan inn i hind flanken av SCID-mus og tumorvolum ble målt over tid for å bestemme hvilke, om noen, effekt Rab7 nedregulering hadde
in vivo
. Tumorer avledet fra Rab7 shRNA uttrykkende celler ble større enn de fra NT shRNA uttrykkende celler (figur 3A). Forskjellen ble signifikant (p 0,05) på dag 79 etter injeksjon og svært signifikant siste 79 dagene (p 0,001). Det er interessant å merke seg at økt spredning ikke ble oppdaget i Rab7 shRNA uttrykke celle
in vitro plakater (Figur S2). Etter at den største tumoren nådde 1,4 cm
3, alle musene avlivet og tumorene ble kirurgisk fjernet. De omkringliggende murine vev tilstøtende til tumorene ble også høstet på dette tidspunktet. Svulster ble deretter delt i to og enten ligge ti prosent formalin eller flash-frosset.
A) SCID /Bg-mus ble injisert med 2 x 10
6 NT shRNA (n = 6) eller Rab7 shRNA (n = 7) som uttrykker DU145-celler sc Svulster ble målbar etter dag 41, og ble målt via digitale calipers to ganger per uke. Mus ble ofret en gang den største svulsten nådde 1,4 cm
2. Data er uttrykt som kubikkmillimeter volum. Feilfelt representerer standardavvik 6 og 7 henholdsvis tumorer. * Statistisk signifikans (p 0,05) versus NT shRNA svulster; ** Statistisk signifikans (p 0,001) versus NT shRNA svulster. B) Immunhistokjemi ble utført på formaldehyd fast tumorvevet (se metoder og materialer). Celleproliferasjon ble vurdert ved hjelp av Ki-67 som en markør og apoptotiske celler ble visualisert ved hjelp Spaltet Caspase-3 som en markør. C) IHC ble kvantifisert ved å telle Ki-67 eller Spaltet Caspase-3-positive celler. Tre tilfeldige felt per svulst ble manuelt telles. Antallet positivt flekker celler ble fremstilt grafisk. * Statistisk signifikans (p 0,01) versus NT shRNA svulster; ** Statistisk signifikans (p 0,05) versus NT shRNA svulster. Skala barer: 100 mikrometer
Formalin faste svulster ble så seksjonert og innebygd i parafin for immunhistokjemisk (IHC) analyse.. Siden ble påvist en forskjell i tumorvekst, ble tumorsnitt farget med Ki-67 (en spredning markør) og spaltet Caspase-3 (en apoptotisk markør) og kontra med hematoksylin. Representative farging er vist i figur 3B. IHC-farging ble kvantifisert ved manuelt å telle Ki-67 eller Spaltet Caspase-3-fargede celler. Kvantifisering vist i figur 3C viser en signifikant (p 0,01) økning i Ki-67 positiv farging og signifikant (p 0,05) reduksjon i Spaltet Caspase-3-positiv farging, noe som tyder på at økningen i tumorvolum er på grunn av både økt proliferasjon og redusert apoptotiske priser.
Rab7 shRNA Uttrykke Svulster få økte Invasion og vevsremodelleringen
Parafin innebygd tumorsnitt ble farget med hematoksylin og eosin og visualisert ved to forskjellige forstørrelser. Som angitt ovenfor, under kirurgisk fjerning av tumorene ble de tilstøtende murine vev og hud intakt. Representative tverrsnitt av H E flekken er vist i figur 4. Kontroll (NT shRNA uttrykker) tumorer viser samlet vev integritet med et tynt lag av huden som ligger over et mye tenker lag av organiserte, intakt vev (tverrstripet celler, indikert ved piler). Noen tumorceller kan påvises invaderende inn i dette vevet lag i kontrolltumorer. I motsetning til dette Rab7 shRNA uttrykkende tumorer viste en mye mer aggressiv fenotype. Integriteten til det omgivende murine vev ble alvorlig kompromittert og en rekke tumorceller ble funnet utblandet innenfor den murine vev eller i de fleste tilfeller, ble den tverrstripet arkitekturen til det omgivende vev helt kompromittert. Derfor konkluderer vi at ikke bare var det Rab7 shRNA uttrykke svulster større, de hadde økt kapasitet til å fornye og invadere inn i omkringliggende vev
H . E farget subkutant tumor tverrsnitt med den omgivende murine vev og hud er vist ved siden av tumoren. Rab7 knockdown svulster displayet økt infiltrasjon i vevet lag som ligger under huden i forhold til å kontrollere svulster. I tillegg vevet viser økt lidelse og tap av integritet omgir Rab7 knockdown svulster. Skala:. 100 mikrometer
Rab7 mRNA nedregulert i Prostate Cancer epitelcelledifferensiering Biopsi, men ikke i de omkringliggende stromale celler, og heller ikke i BPH
Siden Rab7 nedregule økt tumorvekst
in vivo Hotell og økt invasiv kapasitet
in vitro
,
ONCOMINE
databasen ble søkt å bestemme differensial mRNA nivåer av Rab7 i menneskelig prostatakreft. Analyse av differensial regulering av Rab7 i prostata cancer viste seks datasettene som spenner over ni forskjellige prostatavev undergrupper. Som det fremgår av tabell 1, flere studier viste en signifikant gangers reduksjon i Rab7 mRNA-ekspresjon som strekker seg fra -2,501 til -1,128; imidlertid to studiene var usikre med en sonde påvise en økning og en andre probe påvise en nedgang på Rab7 mRNA i prostata tumorprøver, og en studie ble det ikke konstatert endring i Rab7 mRNA uttrykk. Videre har en analyse av PIN-lesjoner viste også en signifikant -1,939 gangers reduksjon i Rab7, mens to separate analyser av benign prostatahyperplasi (BPH) klarte ikke å vise en reduksjon i Rab7. Til sammen vises en trend der Rab7 er nedregulert tidlig i prostata svulst utvikling (PIN-lesjoner) og forblir nedregulert i løpet av tumorprogresjon, men er ikke nedregulert i gunstige forhold som BPH.
Rab7 knockdown fører til en økning i c-Met Levels
for å begynne å bestemme hvilke mekanismer som regulerer en økning i tumor spredning og invasjon i celler som inneholder redusert Rab7, vi undersøkte nivåer og aktivering av c-Met i vektor kontroll- og Rab7 shRNA uttrykker celler. Tilsetting av HGF å kontrollere celler resulterte i økt c-Met fosforylering og aktivering av nedstrøms signalveier, etterfulgt av en gradvis reduksjon i løpet av de neste timene. I motsetning til dette, tilsetning av HGF til Rab7 knockdown-celler resulterte i en mer robust økning av c-Met-fosforylering og en langsommere tap av aktivt Met og nedstrøms signaliseringspartnere over tid (figur 5A). I overensstemmelse med disse data, analyse av total c-Met-protein i kontroll og Rab7 knockdown celler indikerte at c-Met-nivåene var høyere i cellene med mindre Rab7 og at HGF-mediert tap av c-Met ble også svekket (figur 5B).
A) ikke-target (NT) vektorkontroll eller Rab7 shRNA uttrykk DU145-celler ble utsatt for HGF i de angitte tidsrom. Helcellelysater ble oppsamlet og c-Met, Akt, og Erk fosforylering ble påvist ved Western blotting. B) Celler ble behandlet med HGF for indictated tidsperioder og nivåer av total c-Met-protein ble bestemt ved Western blot-analyse. Densitometri fra tre uavhengige eksperimenter ble brukt for grafisk fremstilling av c-Met tap over tid. C) Celler ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av HGF i 30 minutter etterfulgt av Western blot-analyse av de angitte proteiner. D) Protein lysater av xenograft tumorer ble høstet og nivåene av total c-met og Rab7-protein ble påvist ved Western blot. Søylediagrammet representerer gjennomsnittet c-met og Rab7 uttrykk for sju svulster per behandlingsgruppe som bestemt ved densitometri av Western blot. * = P 0,0007 i forhold til NT shRNA Rab7. ** = P 0,03 i forhold til NT shRNA c-Met. Feil bar representerer SEM.
Siden c-Met nivåene var høyere i Rab7 knockdown celler, spådde vi at disse kreftcellene vil være mer lydhør overfor lavere konsentrasjoner av HGF. Som indikert i figur 5C, Rab7 knockdown-celler reagerte på lavere konsentrasjoner av HGF som målt ved aktivering av c-Met, Akt og Erk.
Til slutt, for å bestemme om c-Met-nivåene ble redusert i Rab7 knockdown mus xenograft protein fra fryst xenograft tumorvev ble høstet og forberedt for Western blot-analyse. Figur 5D viser at svulster dannes fra vektor kontroll DU145 cellene i gjennomsnitt inneholdt mer Rab7 og mindre c-Met enn svulster dannes fra Rab7 knockdown celler.
