Abstract
Genetisk konstruert bakterielle protein toksiner er attraktive systemer for levering av eksogene proteiner i cytosol av pattedyrceller. Den binære C2 toksin fra
C. botulinum
har dukket opp som kraftig levering kjøretøy, som hviler på sin binding /trans komponent C2IIa og den genmodifiserte adapter domene C2IN som fungerer sammen for å utløse celleopptak. P53 tumor suppressor protein har en viktig funksjon i å undertrykke karsinogenese og er ofte inaktivert av forskjellige mekanismer i humane tumorceller. Derfor har vi konstruert en C2IN-p53 fusjonsprotein, som blir internalisert inn i kreftceller ved C2IIa. For å oppnå dette, ble C2IN-p53 fusjonskonstrukt overexpressed i
E. coli
med god oppløselighet, renset ved hjelp av heparin-affinitetskromatografi og protein identitet ble bekreftet ved immunblotting. Vi viste at fusjonsproteinet er i stand til å binde til p53 konsensus-DNA med høy affinitet i et p53-spesifikk måte
in vitro
. Deretter ble internalisering av C2IN-p53 overvåket i HeLa-celler ved cellefraksjonering og immunoblot analyse, som viste en C2IIa-mediert translokasjon av fusjonsproteinet inn i cytosol. Opptaket ble også vist i A549 og Saos-2-celler med lignende effektivitet. Disse funnene ble ytterligere styrket av konfokal immunfluorescens analyser av C2IN-p53 /C2IIa behandlet HeLa og A549 celler, viser hovedsakelig cytoplasma lokalisering av fusjonskonstruksjon
Citation. Fahrer J, Rausch J, Barth H (2013) En Cell-perme~~POS=TRUNC Fusion Protein Basert på
Clostridium botulinum
C2 gift for levering av p53 Tumorsuppressor til kreftceller. PLoS ONE 8 (9): e72455. doi: 10,1371 /journal.pone.0072455
Redaktør: Mark Isalan, Senter for Genomisk forordning, Spania
mottatt: 02.06.2013; Godkjent: 18 juli 2013; Publisert: 05.09.2013
Copyright: © 2013 Fahrer et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av det medisinske fakultet ved Universitetet i Ulm (Bausteinprojekt L.SBN.0060 til JF) og en forsknings stipendium fra Experimental Medicine Program Ulm til JR. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
C2 toksin fra
Clostridium botulinum
er prototypen på binære aktin-ADP-ribosyleringsaktivitet giftstoffer [1] og består av enzymet komponent C2i, som mono-ADP-ribosylates G-aktin og separat binding /trans komponent C2II. C2II må gjennomgå proteolytisk spaltning ved dets N-terminale ende for å danne biologisk aktive C2IIa, mediere opptaket av C2i inn i vertscellen cytosol [1]. I oppløsning, danner C2IIa en heptamer betegnet som pre-pore og binder seg til sin reseptor som finnes på celleoverflaten av alle pattedyrcelletyper som ble testet så langt [2]. Etter montering med C2i, entrer C2i /C2IIa kompleks cellen ved clathrin endocytose i en PI3K- og Akt-avhengig måte [3], [4]. Som svar på den forsuring som forekommer i begynnelsen av endosomer, er C2IIa kastes en konformasjonell bryter, utløser dens innføring i den endosomale membran, hvor den danner et trans-membran pore [5]. Dette gjør det mulig for translokasjon av C2i inn i cytosol, noe som fremmes av vertscelle anstand som HSP90 og peptidyl-prolyl
cis /trans
Isomerases [6], [7]. Deretter C2i katalyserer kovalente overføring av ADP-ribose på G-aktin bruker NAD
+ som co-substrat [8]. Dette kovalent modifikasjon resulterer i en kollaps av aktin cytoskjelettet og til slutt utløser caspase-avhengig celledød [9].
På grunn av sine egenskaper, har det binære C2 toksinet blitt anvendt i mange studier som et allsidig leveringssystem fasilitets opptaket av eksogene proteiner i vertscelle cytosol [10]. Det N-terminale domenet til C2i (C2IN) binder til C2IIa og er avgjørende for C2IIa-formidlet internalisering, men omfatter ikke enzymet domenet som er ansvarlig for cytotoksiske virkninger. Derfor kan C2IN adapteren kobles til proteiner av interesse ved genetiske midler, etterfulgt av ekspresjon som rekombinante fusjonsproteiner. Tidligere C2IN har blitt smeltet til virulens faktor SpvB fra
Salmonella ente
å utløse sin intern i pattedyrceller [11]. En annen fremtredende eksempel involverer bakteriell C3 ADP-ribosyltransferase, en selektiv hemmer av Rho GTPase, som også ble uttrykt som C2IN fusjonsprotein og banet vei å belyse Rho-mediert signalering i eukaryote celler [10], [12]. Nylig C2IN har vært knyttet til den biotin-bindende protein streptavidin, genererer en allsidig pattedyr-avgivelsessystem for biotinmerkede (makro- molekyler) [13].
tumor suppressor protein p53 er en transkripsjonsfaktor som er aktivert i respons til forskjellige stimuli så som stress-genotoksiske fornærmelser og hypoksi [14]. p53 er en sentral aktør i vedlikehold av genomisk integritet og utøver anti-kreft aktivitet ved styrende cellecyklusprogresjonen og indusere apoptotisk celledød i alvorlig skadede celler. Det fungerer først og fremst som en transkripsjons induser av et bredt spekter av gener involvert i cellesyklus arrest og senescence, apoptose og DNA-reparasjon [15], men er også i stand til å utløse apoptose i en transkripsjon-uavhengig måte [16]. Av betydning er p53 funnet inaktivert i mange humane svulster på grunn av ervervede mutasjoner i sin avgjørende DNA-bindende domene [17] og økt proteolytisk degradering etter (poly) ubiquitinering [18]. På grunn av sin sentrale funksjoner i tumor suppresjon, er p53 i fokus for biomedisinske og klinisk forskning og mange strategier er blitt utviklet for å gjenopprette p53 i p53-manglende tumorceller [19]. En lovende metode tar sikte på levering av p53-genet i tumorceller ved forskjellige kjøretøy. Det har nylig blitt vist at polymere mikrosfærer som er lastet med chitosan-DNA-nanopartikler som bærer det humane p53-genet er effektivt internalisert inn i humane hepatomceller [20]. En annen studie rapporterte den samtidige opptak av p53-genet og det antineoplastiske middel doksorubicin via en hybrid nanopartikkel-systemet inn i HeLa-celler [21]. En ytterligere interessant strategi hviler på internalisering av p53 protein knyttet til (poly) peptider som letter sin opptaket. For dette formål har p53 blitt kondensert til gonadotropin-frigjørende hormon (GnRH), noe som gir mulighet for opptak av fusjonsproteinene til GnRH-positive tumorceller ved reseptor-formidlet endocytose [22]. Videre har vi vist meget nylig at biotin-konjugert p53-proteinet er internalisert i en ikke-kovalent måte av C2-streptavidin transportsystem [23].
Her vi rapporterer dannelsen av et fusjonsprotein, i hvilken menneskelig p53 var knyttet til adapteren domene C2IN av genteknologi, og dermed tilrettelegge for sin leveranse av C2IIa binding /trans enhet til kreftceller. Vi viser at det rekombinante C2IN-p53 fusjonsprotein viser spesifikk DNA-bindende aktivitet
in vitro
og demonstrere C2IIa-avhengige opptak av C2IN-p53 inn i cytosol av forskjellige kreftcellelinjer så som HeLa livmorhals carcinom og A549 lunge adenokarcinomceller.
Resultater
Genteknologi, uttrykk og rensing av GST-merket C2IN-p53
Menneske p53 cDNA ble klonet i ramme med adapteren domene C2IN for å generere ekspresjonsplasmidet p-GEX2T-C2IN-p53, som havner GST-merkede C2IN-p53 fusjonskonstruksjon (fig. 1A). Her er den C2IN domene medierer C2IIa-avhengige opptak av fusjonsproteinet i vertscellen cytosol, mens p53-delen er ment for å utøve antiproliferative virkninger på internalisering. Fusjonsproteinet ble senere overuttrykt ved 16 ° C i
E. coli-
Rosetta celler og tidsavhengig ekspresjon ble analysert ved Coomassie-farging og Western blotting (fig. 1B). Coomassie-farging avslørte et bånd rundt 97 kDa i henhold til den forventede molekylvekt på GST-C2IN-p53, som økte med tiden. I konsistens, immunoblot deteksjon med et monoklonalt antistoff rettet mot humant p53 vises også en voksende proteinbånd med lignende molekylvekt. Maksimal ekspresjon av fusjonsproteinet ble funnet etter 20 timer, men med noen ødeleggelse produkter. Uttrykk av konstruksjonen ved høyere temperatur (29 ° C) resulterte i høyere uttrykk nivåer på den enkle betydelig flere nedbrytingsprodukter (data ikke vist). Således bakteriekulturer høstet etter 20 timer ble lysert ved ultralydbehandling, og den erholdte lysat ble fylt på en anionbytterkolonne. GST-C2IN-p53 ble gjenvunnet i strømmen gjennom (data ikke vist) og deretter injisert på en heparin-Sepharose-kolonne. Den bundet GST-C2IN-p53 ble eluert med en saltgradient overvåket ved UV-absorbans, og fraksjoner oppsamlet ble vurdert for p53-innhold ved Western blotting (fig. 1C). GST-fusjonsprotein merket ble detektert hovedsakelig i fraksjonene C4-C6, som tilsvarer den tredje topp i det FPLC-kromatogrammet. Disse fraksjonene ble slått sammen og dialysert mot buffer med lavt saltinnhold, noe som resulterer i en gjennomsnittlig konsentrasjon på 250 ng fusjonsprotein /ml. Av notatet, affinitetsrensing av fusjonsproteinet ved glutation-sefarose var ikke mulig. I tillegg er trombin spaltning for å fjerne merket var ikke effektivt, hvorfor dette rensetrinnet ble utelatt.
A
. Scheme av GST-C2IN-p53 fusjonskonstruksjon.
B
. Tid løpet av GST-C2IN-p53 uttrykk i
E. coli
Rosetta. Prøver ble høstet etter tidspunkter indikert (0, 1, 3, 6 og 20 timer) og underkastet SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie-farging (øverst) eller Western blot-analyse ved å bruke en p53-antistoff (nederst). GST-C2IN-p53 er betegnet med en pil.
C
. Rensing av GST-C2IN-p53 fusjonsprotein ved heparin-affinitetskromatografi. GST-C2IN-p53 ble isolert fra fullcelle-ekstrakter av heparin-basert kromatografi og eluert med en lineær salt gradient som overvåket ved UV-absorbans. Deretter ble fraksjoner oppsamlet i løpet av affinitetskromatografi, karakterisert ved immunoblotanalyse med p53-antistoff.
Tatt sammen, en fusjonskonstruksjon som består av C2IN og p53 ble vellykket klonet, uttrykt og renset ved hjelp av heparin-affinitetskromatografi med tilstrekkelig utbytte .
In vitro
karakterisering av GST-C2IN-p53
Den isolerte rekombinante GST-C2IN-p53 ble først preget av Western blotting med anti-C2IN, anti-p53 og anti-GST-antistoffer (fig. 2A). Bortsett fra fusjonsproteinet, noen mindre nedbrytningsfragmenter var også synlig, men særlig etter lange eksponeringstider. Deretter ble den spesifikke DNA-bindende evnen til GST-C2IN-p53 bestemt
in vitro
ved hjelp av en elektroforetisk mobilitet skift-analyse (EMSA), siden dette er en viktig egenskap for sine transkripsjonsavhengige funksjoner. Denne analyse er basert på bindingen av p53 til en biotinylert oligonukleotid dupleks som inneholder konsensus-sekvens som finnes i det MDM2 promoter. Inkubering av denne duplex med GST-C2IN-p53 resulterte i dannelsen av høy molekylvekt-DNA /GST-C2IN-p53-komplekser på en konsentrasjonsavhengig måte, med forsvinning av den frie oligonukleotid allerede ved 250 ng og forekomsten av en spesifikk DNA -protein komplekset ved 500 ng fusjonsprotein. Samtidig, ble GST-C2IN-p53 påvist ved en anti-C2IN antistoff. Som kontroll, ble rekombinant C2IN (~26 kDa) inkludert, som ikke produsere noen synlig kompleks, for derved å underbygge den p53-avhengig DNA-binding av fusjonsproteinet. Det bør også nevnes at DNA-bindings av C2IN-p53 var lik den til villtype p53 (data ikke vist), som indikerer ingen tap av DNA-bindende aktivitet på grunn av genteknologi.
A.
Påvisning av forskjellige domener av fusjonsproteinet ved Western blotting. Økende mengder av GST-C2IN-p53 (50, 100 og 200 ng) ble separert ved elektroforese og deretter analysert ved Western blotting med forskjellige antistoffer (anti-C2IN, anti-p53, anti-GST).
B
. DNA-binding av renset GST-C2IN-p53. Økende mengder av GST-C2IN-p53 ble inkubert med en biotin-merket oligonukleotid dupleks som inneholder en p53-reagerende element (p53-RE). Complex formasjonen ble deretter overvåket av nativ PAGE etterfulgt av deteksjon med streptavidin-POD (Stv-POD). C2IN tjente som negativ kontroll, og ble visualisert ved en C2IN antistoff. Stjernen betegner en biotinrest, mens sirkelen representerer den GST-tag av fusjonsproteinet.
Til sammen ble identiteten til GST-C2IN-p53 bekreftet ved spesifikke antistoffer og fusjonsproteinet var aktive
in vitro
, som det utøves spesifikke DNA-bindende aktivitet.
C2IIa-mediert internalisering av GST-C2IN-p53 til kreftceller
Vi deretter adressert spørsmålet om enten GST-C2IN-p53 er internalisert inn i kreftceller via C2IIa. Innledende eksperimenter ble utført på HeLa-celler på grunn av deres sterkt reduserte ekspresjon av endogen p53 [24]. HeLa-cellene ble inkubert i forskjellige tidsrom med GST-C2IN-p53 pluss C2IIa og deretter underkastet digitonin-baserte cellefraksjonering. Immunoblot deteksjon med p53 antistoff avdekket en tidsavhengig økning av GST-C2IN-p53 i ekstraherte HeLa-celler (Fig. 3 A, venstre panel), som inneholder cellemembranbundne og internalisert protein bosatt i vesikler. GST-C2IN-p53 ble vist å translocate inn i cytosolen med et maksimum etter 5 t (fig. 3A, høyre panel), som også ble detektert ved en anti-C2IN (data ikke vist). Imidlertid GST-C2IN-p53 var ikke påvisbar i cytosol etter 24 timer (data ikke vist), som kan være en konsekvens av dens proteasomal degradering. Som en negativ kontroll ble cellene utfordret med GST-C2IN-p53 i fravær av C2IIa. Her, ble GST-C2IN-p53 påvist i ekstraherte celler, men ikke i cytosol, noe som kan være et resultat av ikke-spesifikk binding. Tidlig endosomet antigen 1 (EEA1), et markørprotein for tidlig endosomale vesikler [25] ble bare funnet i ekstraherte celler, men ikke i cytosol, noe som viser vellykket fremstilling av den cytosoliske fraksjonen uten kryss-kontaminering av tidlige endosomer (fig. 3A, topp panel).
A.
Opptak av C2IN-p53 i HeLa cervix carcinoma celler overvåkes av cellefraksjonering. HeLa-cellene ble inkubert med GST-C2IN-p53 og C2IIa i opp til 5 timer. Deretter ble digitonin-baserte cellefraksjonering utført og ekstrahert legemer, samt cytosoliske fraksjoner ble underkastet SDS-PAGE og påfølgende Western blotting. Internalisert GST-C2IN-p53 ble oppdaget av anti-p53. HSP90 ble oppdaget som lasting kontroll, mens EEA1 ble visualisert å utelukke en krysskontaminering av cytosoliske fraksjonen med tidlige endosomer.
B
. C2IIa avhengig internalisering av GST-C2IN-p53 inn A549 lunge adenokarsinom og Saos-2 osteosarkom-celler (
C
). Celler ble behandlet og bearbeidet som beskrevet ovenfor, bortsett fra at Rab5 ble detektert som markør for tidlig endosomer.
Som følge av disse resultatene, ytterligere cancercellelinjer inkludert A549 lunge adenokarsinom-celler (p53-wt) og Saos -2 osteosarkom celler (p53-negative) ble analysert. Den C2IIa avhengige levering av GST-C2IN-p53 inn i cytosol var sammenlignbar med det som ble observert i HeLa-celler (fig. 3B og C). Det bør nevnes at noen GST-C2IN-p53 var også påvisbar i utvunnet Saos-2-celler i fravær av C2IIa, som kan tilskrives en ikke-spesifikk binding til celleoverflaten og påfølgende pinocytose (Fig. 3C). Bare neglisjerbare mengder av fusjonsproteinet ble visualisert i digitonin-permeabilisert A549-celler i fravær av C2IIa, noe som indikerer den spesifikke C2IIa-avhengige opptak i disse cellene (fig. 3B). Vær oppmerksom på at påvisning av den lille GTPase Rab5, en etablert markør protein for tidlige endosomer [26], ble brukt som kvalitetskontroll for cytosol forberedelse.
Videre spesifisitet av opptak og subcellulære lokalisering av GST-C2IN -p53 ble analysert i større detalj ved konfokal immunofluorescens-mikroskopi av HeLa-celler ble behandlet i 5 timer med GST-C2IN-p53 i fravær eller nærvær av C2IIa. For å visualisere kjerner ble cellene kontra for PARP-1 og 0,75 mikrometer optiske delene ble kjøpt opp og evalueres for GST-C2IN-p53 ved hjelp av en C2IN antistoff. Bare meget små mengder av GST-C2IN-p53 ble funnet i fravær av C2IIa, som fremhever spesifisiteten av C2IIa-avhengige opptak. Hovedtyngden av internalisert GST-C2IN-p53 vises cytoplasma lokalisering, men ble også påvist i kjernen, hvor det samlokalisert med PARP-1 som dokumentert av gule flekker i det fusjonerte kanalen (Fig. 4A.). I tillegg fikk vi bekreftet det C2IIa avhengig levering av GST-C2IN-p53 i A549 celler, som viste en sammenlignbar intracellulær fordeling som observert i HeLa-celler (fig. 4B).
A
. Konfokalmikroskopi av GST-C2IN-p53 opptak i HeLa celler. Celler ble behandlet med GST-C2IN-p53 og C2IIa i 5 timer. Som kontroll ble cellene forblir ubehandlet eller inkuberes uten C2IIa. Deretter ble cellene fiksert, permeabilisert og farget for C2IN med et polyklonalt antistoff, etterfulgt av en Alexa 633-koblet sekundært antistoff (rød). PARP-1 ble detektert med et monoklonalt antistoff og etterfølgende farging av en Alexa 488-konjugert sekundært antistoff for å visualisere kjerner (grønn). Z-Stack bildene ble tatt opp i 0,75 mikrometer optiske seksjoner og behandles av ImageJ. Representative-bilder av dette er vist. Skala: 10 mikrometer.
B
. Levering av GST-C2IN-p53 i A549 celler. Celler ble behandlet og bearbeidet som beskrevet ovenfor. Z-Stack bildene ble kjøpt opp i 0,75 mikrometer optiske seksjoner og behandles av ImageJ. Representative-bilder av dette er vist. Skala:.. 10 mikrometer
I sammendraget, vi demonstrert at GST-C2IN-p53 er effektivt internalisert inn i cytosol av ulike kreftcellelinjer i et bestemt C2IIa avhengig måte
diskusjon
den foreliggende undersøkelse er avhengig av en genetisk konstruert fusjonsprotein basert på ikke-toksiske C2 toksin som leverer p53 tumor suppressor protein i cytosol av forskjellige kreftcellelinjer. Her, p53 ble klonet i ramme til adapteren domene C2IN som formidler interaksjonen med C2IIa binding /trans enhet, som fører til den etterfølgende cellulært opptak. Konstruksjonen ble uttrykt som GST-fusjonsprotein kodet og renset ved heparin-affinitetskromatografi. Imidlertid GST-tag ble vist å være mangelfull i glutation-binding, og kan ikke fjernes ved hjelp av trombin spaltning, som kan være på grunn av sterisk hindring som blokkerer tilgangen av trombin til sin spaltingssete. Men den resterende GST-gruppe ved den N-terminale ende av fusjonsproteinet hverken hindres p53-mediert DNA-binding av fusjonsproteinet
in vitro
, eller dets C2IIa-avhengige opptak inn i cytosol av målceller . Dette er i tråd med tidligere funn som viser at den N-terminale GST-tag gjør heller ikke hemme den effektive C2II-mediert levering av GST-C2i [27] eller at av GST-C2IN-C3lim fusjons toksin [28] inn i cytosol av HeLa celler. Dette er bemerkelsesverdig, ettersom den korrekte folding av p53 er essensiell for dens DNA-bindende aktivitet og er påvirket av en mengde faktorer, inkludert redoks-tilstanden [29] og andre [30].
En alternativ strategi involverer biotin-merking av rekombinant p53 og dets påfølgende konjugering til C2-streptavidin-transportøren, som ganske nylig demonstrert av vår gruppe [23]. Imidlertid kovalent binding av p53 til C2IN adapteren som er presentert her har en overlegen stabilitet i forhold til konjugering av biotin-p53 til C2IN-streptavidin på en ikke-kovalent måte, [23], som den hviler på en streptavidin-del med redusert biotin- bindingsaffiniteten [13], [31]. På den annen side gjør dette for intracellulær frigjøring av den biotin-merkede liganden,
f.eks
. ved konkurranse med endogent biotin.
Deretter vi demonstrert C2IIa-mediert opptak av den GST-C2IN-p53 fusjonsprotein i forskjellige cancercellelinjer, hvori den translokert inn i cytosol som bekreftet ved immunblot deteksjon ved celle fraksjonering. Dette er et interessant funn med tanke på at den tanslocation pore dannet av C2IIa i membraner av forsurede endosomal vesikler er ganske smal [32] og kan begrense translokasjon av GST-C2IN-p53. Derfor kan en delvis utfolding av fusjonsproteinet være nødvendig, som observert for andre C2IN-baserte fusjonspartnere [33]. Vi har ikke analysert på p53 funksjonaliteten av fusjonsproteinet i levende celler etter internalisering og kan således ikke utelukke at trans prosessen med antatte utfolding av C2IN-p53 kan ha påvirket sin funksjon som transkripsjonsfaktor, som må bli undersøkt i fremtidige studier . Ingen store forskjeller ble observert vedrørende cytosolic intern blant cellelinjene som ble testet. Av notatet, endogen p53 påvises verken i ekstraherte celler eller i cytosol av alle cellelinjene ved de innstillingene som brukes for Western blot analyse. Dette er ikke oppsiktsvekkende, siden HeLa og Saos-2-celler ble rapportert å vise svært lav opp til ikke målbare p53 protein nivåer [24], [34]. Videre har vi nylig vist endogent p53 i trykksvake A549 celler ved konfokalmikroskopi bare ved hjelp av høy laser intensitet [35] eller ved induksjon av DNA-skade etter doksorubicin (data ikke vist). Men noen uspesifikk binding av fusjonsproteinet i fravær av C2IIa ble avslørt i ekstrahert HeLa og Saos-2-celler. GST-C2IN-p53 akkumulert i cytosol etter 5 timer, men var ikke lenger påvisbar etter 24 timer (data ikke vist). I konsistens, har en cytosoliske degradering også blitt rapportert for andre C2IN-baserte fusjonsproteiner, slik som C2IN-C3 [36], C2IN-SpvB [37] og C2IN-streptavidin [38]. Ved intern inn HeLa og A549 celler GST-C2IN-p53 ble primært oppdaget i cytoplasma og mindre fremtredende i kjernen som observert av konfokal mikroskopi. Dette er i tråd med forestillingen om at p53 er funnet i cytoplasma i trykksvake celler på grunn av den Crm1 avhengige atom eksport i forbindelse med MDM2 [39], [40]. Men man må huske på at den subcellulære lokaliseringen av p53 er strengt regulert av et nettverk av posttranslasjonelle modifikasjoner og protein interaksjoner [41], som også kan bli påvirket av GST-tag eller C2IN-domenet.
på grunn av den allestedsnærværende ekspresjon av C2IIa-reseptoren på alle pattedyrceller som ble testet [42] kan GST-C2IN-p53 fusjonsprotein bli levert til et bredt spekter av tumorcellelinjer og primære celler. For å oppnå en målrettet levering, er det tenkelig å modifisere C2IIa binding /trans komponent. For dette formål, kan den C-terminale domene av C2IIa som samvirker med celleoverflatereseptor bli modifisert ved genetisk engineering, bevarer evnen til å C2IIa translocate C2IN inn i cytosol [43]. Den modifiserte C2IIa kan deretter bli kondensert med polypeptider så som epidermal vekstfaktor (EGF) eller somatostatin, som fremmer binding til EGF- eller somatastatin-reseptor som ofte overuttrykt på kreftceller [44], [45]. Denne strategien har blitt beskrevet for beskyttende antigen (PA), innbindings /trans del av de binære miltbrann giftstoffer som er nært knyttet til C2IIa. En mutert form for PA mangelfull i reseptoren anerkjennelse var C-terminalt smeltet til menneskelig EGF og regissert opptaket av LF og EF i EGF-reseptoren som bærer celler [46].
En potensiell scenario for
i vivo
administrering av C2IN-p53 på tumorterapi ville være en intratumoral injeksjon av fusjonsproteinet i kompleks med innfødt C2IIa eller C2IIa modifisert med målretting grupper som diskutert ovenfor. Denne strategi kan i utgangspunktet bli testet i mus xenotransplantater ble oppnådd etter injeksjon av HeLa-celler, og kan deretter oversettes til klinikken for behandling av faste tumorer. Men den selektive levering til kreftceller og utelukkelse av antatte immunogene effekter fremkalt av fusjonsproteinet er avgjørende forutsetninger for vellykket
in vivo
søknad.
I konklusjonen, vi har bygget et fusjonsprotein som beholdt sin p53-avhengig DNA-bindende aktivitet
in vitro Hotell og blir internalisert via sin C2IN domene i cytosol av ulike kreftcellelinjer ved hjelp av C2IIa binding /trans komponent.
Materialer og metoder
Kloning av C2IN-p53 fusjonsprotein
human p53 cDNA ble amplifisert ved PCR fra plasmid RcCMV-human p53, som var vennlig gitt av Dr. Michael Schwarz (University of Tübingen, Tyskland). For dette formål primerne p53-I (5′-GAATTCAGATCTGAGGAGCCGCAGTC-3 «) og p53-II (5′-GAATTCGGATCCTCAGTCTGAGTCAGG-3») ble anvendt som tillater innsetting av en
Bgl II
og en
Bam
H1 restriksjonssetet. Det oppnådde PCR-produkt ble deretter ligert inn i pCR-Blunt vektor ved hjelp av Zero Blunt PCR-kloningssettet (Invitrogen, Karlsruhe, Tyskland) og transformert inn i kompetente
E. coli
DH5a celler. PCR-p53 plasmid ble isolert og riktig forsterkning ble undersøkt ved DNA-sekvensering (GATC, Konstanz, Tyskland). Deretter ble isolert plasmid PCR p53 fordøyd med
Bgl
II og
Bam
H1 å frigjøre p53 cDNA og ligert inn plasmid pGEX2T-C2IN som var blitt linearisert med
Bam
H1. Etter transformasjon i kompetent
E. coli-celler,
riktig innsetting av p53 cDNA i det resulterende plasmid pGEX2T-C2IN-p53 ble kontrollert ved koloni-PCR, og restriksjonsenzymanalyse. Til slutt ble C2IN-p53 fusjonskonstrukt sekvensert med pGEX2T 5′- og 3′-seqencing primere (GATC, Konstanz, Tyskland).
Uttrykk og rensing av rekombinant C2IN-p53
den genererte C2IN-p53 fusjonskonstrukt ble overexpressed som GST-merket fusjonsprotein i
E. coli
Rosetta og renset til homogenitet ved affinitets-kromatografi. For dette formål,
E. coli-
Rosetta celler transformert med pGEX2T-C2IN-p53 ble dyrket til en optisk densitet på 0,6 og protein-ekspresjon ble indusert ved tilsetning av isopropyl-ß-D-tiogalaktopyranosid (IPTG). Bakterielle kulturer ble deretter inkubert i 20 timer ved 16 ° C og høstet ved sentrifugering. Cellelyse ble utført ved sonikering i en buffer inneholdende 0,1% Triton X-100, og cellerester ble sedimentert ved sentrifugering ved 20 000
g
i 15 minutter ved 4 ° C. Det klarede lysat ble applisert på en Q-Sepharose Fast Flow-kolonne (GE Healthcare, Munchen, Tyskland) og strømmer gjennom inneholdende GST-C2IN-p53 ble oppsamlet. Deretter ble prøven injisert på en heparin-Sepharose-kolonne (GE Healthcare Tyskland) og eluert med en lineær salt gradient varierende fra 0 til 1 M NaCl. Fraksjoner med GST-C2IN-p53 ble deretter slått sammen og dialysert mot en buffer bestående av 20 mM HEPES /KOH pH 7,4, 50 mM NaCl og 5 mM DTT. Protein identitet av isolert GST-C2IN-p53 ble bekreftet ved 10% SDS-PAGE og påfølgende Western blot analyse ved anvendelse av et polyklonalt C2IN antistoff dannet i kanin [10], et monoklonalt p53 antistoff (DO-1, Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland ) og en GST antistoff (BD Biosciences, Heidelberg, Tyskland), henholdsvis. For å analysere den tidsavhengige ekspresjon av GST-C2IN-p53, ble 100 ul alikvoter av bakteriekultur oppsamlet og underkastet 10% SDS-PAGE etterfulgt av Coomassie-farging og immunblotting som beskrevet ovenfor.
Ekspresjon og rensing av C2IN og C2IIa
C2IN (~26 kDa) og C2II (~81 kDa) ble uttrykt som GST-merkede proteiner i
E. coli BL21
og renset med glutation-affinitetskromatografi, som beskrevet tidligere [1], [10]. Etter isolering av proteinene, ble GST-delen fjernes ved hjelp av trombin-spaltning og C2II (~61 kDa) ble aktivert av trypsin fordøyelse for å gi C2IIa som angitt [1]. Renheten av proteinene ble analysert ved 12,5% SDS-PAGE og etterfølgende Coomassie-farging.
p53-DNA-bindingsanalysen
Den spesifikke DNA-binding av GST-merket C2IN-p53 ble bestemt ved en elektroforetisk mobilitet shift analyse (EMSA). For dette formål ble et oligonukleotid duplex huse et p53-bindingssete av MDM2-promoteren benyttet som tidligere beskrevet [47]. Binding av C2IN-p53 til oligonukleotid-dupleks resulterer i høymolekylære DNA-p53-komplekser med redusert elektroforetisk mobilitet. Økende mengder av GST-C2IN-p53 (0-2000 ng protein) ble for-inkubert i DNA-bindingsbuffer i 10 minutter etterfulgt av tilsetning av biotin-ende-merket oligonukleotid duplex (6 nM). Kompleksdannelse ble tillatt å skje i ytterligere 20 min før avslutning av reaksjonen ved tilsetning av EMSA loading buffer på is. Prøvene ble deretter separert ved 6% (w /v) nativ PAGE og overført på en positivt ladet nylonmembran (GE Healthcare, Munchen, Tyskland) ved semidry blotting. Deretter ble membranen løst i 60 minutter ved 90 ° C og blokkert med 2% (w /v) BSA i PBS-T. Gratis biotinylerte oligonukleotid duplex og DNA-C2IN-p53 komplekser ble påvist med streptavidin-peroksidase (1:15,000) ved hjelp av forbedret chemiluminescence.
SDS-PAGE og immunoblot analyse
Proteiner ble separert ved SDS PAGE og overført til en nitrocellulosemembran (Whatman, Dassel, Tyskland) i en våt-blot-kammer (GE Healthcare, München, Tyskland). Membranen ble blokkert med 5% (vekt /volum) fettfri tørrmelk i PBS som inneholdt Tween-20 [0,1% (v /v), PBS-T] i 1 time ved romtemperatur (RT). Deretter ble membranen inkubert med de respektive primære antistoff fortynnet i PBS-T i 1 time ved RT. Etter vasking av membranen 3 ganger med PBS-T, ble probet med det passende sekundære antistoff koplet til pepperrotperoksidase (Santa Cruz Biotechnology, Heidelberg, Tyskland) i 1 time. Etter ytterligere vasketrinn, ble proteiner oppdaget av chemiluminescence bruke Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrat (Millipore, Schwalbach, Tyskland).
Cell kultur
HeLa cervix karsinom og A549 lunge adenokarcinomceller ble opprettholdt på 37 ° C og 5% (v /v) CO
2 i minimalt essensielt medium (MEM) supplementert med 10% (v /v) varmeinaktivert føtalt kalveserum (FCS), L-glutamat (2 mM), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Saos-2-osteosarcom-celler ble opprettholdt i modifisert McCoys 5A medium supplert med 2 mM L-glutamin, 10% varme-inaktivert FCS og antibiotika. Celler ble rutinemessig trypsinert og reseeded tre ganger per uke.
Digitonin basert cellefraksjone
Cell fraksjonering av HeLa, A549 eller Saos-2-celler ble utført hovedsakelig som beskrevet tidligere [13], [ ,,,0],48]. I korthet ble cellene dyrket i 12-brønners plater over natten og behandles med et kompleks av GST-C2IN-p53 (2,5 ug /ml) og C2IIa (5 ug /ml) for de tidspunkter som er angitt. Som en kontroll ble celler ubehandlet eller inkubert med GST-C2IN-p53 i fravær av C2IIa. Mediet ble deretter suget av og cellene ble vasket 3 ganger med PBS.
