Abstract
Prostatakreft stilk-lignende celler (PCSCs) blir intenst forsket i stor grad på grunn av deres bidrag til prostata tumorigenesis men vår forståelse av PCSC biologi, inkludert deres kritiske stier, forblir ufullstendig forstått. Mens epidermal vekstfaktor (EGF) er mye brukt for å opprettholde PCSC celler in vitro, er viktigheten av EGF-avhengig signalisering og nedstrøms baner i PCSC selvfornyelse ikke godt karakterisert. Ved å undersøke DU145 sfære celler, en populasjon av prostatakreftceller med stamceller-lignende egenskaper, rapporterer vi her at epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) signalering spiller en avgjørende rolle i utbredelsen av DU145 PCSCs. Aktivering av EGFR-signalisering via tilsetning av EGF og ektopisk ekspresjon av et konstitutivt aktiv-EGFR-mutant (EGFRvIII) øket sfære formasjon. Motsatt, hemming av EGFR-signalering ved hjelp av EGFR-hemmere (AG1478 og PD168393) og knockdown av EGFR betydelig hemmet PCSC selvfornyelse. I samsvar med den MEK-ERK vei å være en viktig mål av EGFR signalering, aktivering av MEK-ERK vei bidro til EGFR-tilrettelagt PCSC forplantning. Modulering av EGFR signale påvirket ekstracellulære signalrelatert kinase (ERK) aktivering. Inhibering av ERK-aktivering gjennom flere metoder, deriblant behandling med MEK-inhibitor U0126, ektopisk ekspresjon av dominant-negative MEK1 (K97M), og knockdown av enten ERK1 og ERK2 resulterte i en sterk reduksjon i PCSC forplantning. Samlet gir denne studien tyder på at EGFR signale fremmer PCSC selvfornyelse, delvis ved å aktivere MEK-ERK veien
Citation. Rybak AP, Ingram AJ, Tang D (2013) Propagation of Human Prostate kreft Stilk-lignende celler skjer gjennom EGFR-mediert ERK Activation. PLoS ONE 8 (4): e61716. doi: 10,1371 /journal.pone.0061716
Redaktør: Dean G. Tang, The University of Texas M.D Anderson Cancer Center, USA
mottatt: 22 november 2012; Godkjent: 17 mars 2013; Publisert: 19 april 2013
Copyright: © 2013 Rybak et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av en bevilgning (RMS 79-71) fra den kanadiske Institutes of Health Research til DT og med økonomisk støtte fra St. Josefs Healthcare i Hamilton, ON, Canada, til Hamilton Senter for Kidney forskning (HCKR). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den vanligste mannlige malignitet og den nest største årsaken til kreft dødsfall hos menn i vestlige land [1], [2]. Under prosessen med prostata tumorigenesis, onkogene signalveier fremme utviklingen av hormonavhengig karsinomer for hormon ildfast prostatakreft (hrpc), den viktigste medvirkende faktor i prostata kreft dødsfall [3], [4]. Selv om den eksakte mekanismene som er ansvarlig for initiering og progresjon av prostatakreft fortsatt i stor grad ukjent, er prostata kreft stamceller lignende celler (PCSCs) ansett som å være kritisk i prostata tumorigenesis og dens utvikling mot hrpc sykdom [5] -. [7]
til tross for montering bevis som tyder på at det eksisterer PCSCs, identifisering av menneske PCSCs in vivo har vist seg å være en utfordrende oppgave. Denne utfordringen er i stor grad på grunn av den heterogene natur prostatakreft og de begrensede prøver fra kliniske kilder. Vår begrenset forståelse av PCSCs har også bidratt til manglende evne til å isolere og forplante PCSCs fra humane primære karsinomer. For å fremme kunnskapen om PCSCs, flere forskningsgrupper, inkludert våre, har beriket for PCSCs fra menneskelig prostata kreft cellelinjer. Dette skyldes i hovedsak demonstrasjonen at kreft stamceller (cscs) kan studeres ved hjelp av kula kultur analysen under serumfritt (SF) medie forhold. Denne analysen er blitt brukt til å utlede og forplante cscs fra hjernen [8], bryst [9], tykktarm [10] og prostatakreft-celler [11] – [16] in vitro. Enda viktigere, har kulen kulturen metode tillot forplantningen av prostatakreft stilk-lignende celler som viser CSC egenskapene til selvfornyelse og evnen til å initiere dannelse av tumorer in vivo [11], [12], [15], [17] .
Sphere kultur innebærer vanligvis forplanter seg stilk-lignende celler i SF media supplert med epidermal vekstfaktor (EGF) og basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF) [8] – [13]. Selv om nærværet av både EGF og bFGF tillater generering av kuler fra DU145-celler [11], [12], [17], om dette er den ideelle tilstand for generering sfære og PCSC vedlikehold for en lengre periode er fortsatt uklar. I vår siste undersøkelse, har vi vist at EGF spiller en avgjørende rolle i den langsiktige spredning av DU145 PCSCs, og at disse stilk-lignende celler var i stand til å initiere svulster med en betydelig forbedret evne til ikke-overvektige, diabetiker /alvorlig kombinert immunsvikt (NOD /SCID) mus [11]. Men rollen som EGFR signalering, sammen med sin nedstrøms trasé som er nødvendig for DU145 PCSC forplantning gjenstår å bli karakterisert.
I vårt arbeid med å fremme denne kunnskapen, vi viser her at EGFR-ERK forbindelse spiller en viktig rolle i spredning av DU145 PCSCs. Selv om disse PCSCs er i stand til å forplante seg i fravær av eksogent EGF, er aktivering av EGFR-signalisering kritisk for opprettholdelsen av DU145 PCSCs som eksperimentell manipulasjon av EGFR-signalisering påvirkede DU145 PCSC forplantning. I tillegg modulering av EGFR-signalering i DU145 PCSCs dypt berørt ERK-aktivering. Videre inhibering av ERK-aktivering ved bruk av en MEK-inhibitor, ektopisk ekspresjon av dominant-negative MEK1 (K97M), og knockdown av endogent ERK1 og ERK2, kollektivt redusert spredning av DU145 PCSCs. Samlet utgjør disse resultatene markere et bidrag på MEK-ERK signal for EGFR-medierte PCSCs selvfornyelse.
Materialer og metoder
Cell Kultur og utbredelse DU145 PCSCs
DU145 humane prostatakreftceller og 293T humane embryonale nyreceller ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA), og ble dyrket i henhold til ATCC instruksjoner.
DU145 humane prostata cancer stilk-lignende celler ble isolert og propagert som tidligere er publisert [11]. Kort, DU145 monolagcellene ble enzymatisk-dissosiert til enkeltceller ved hjelp av fenol rød-fri TrypLE Express løsning (Life Technologies, Calsbad, CA, USA) og 40 mikrometer celle siler (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA), og deretter resuspendert ved en sub-klonal (5-celler /ul) tetthet i serumfritt (SF) medium (DMEM /F12 på en 03:01 blanding) (Life Technologies) inneholdende 0,4% bovint serumalbumin (BSA) (Bioshop Canada Inc., Burlington, ON, Canada) og 0,2 × B27 mangel Vitamin A (Life Technologies) i T75 kolber (15 ml totalt volum) utpekt for suspensjon cellekultur (Sarstedt Inc., Newton, NC, USA). Ved undersøkelse av virkningen av EGF-behandling på sfære dannelse, ble rekombinant EGF (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tilsatt ved en konsentrasjon på 10 eller 20 ng /ml. Typiske kuler dannet i 10 til 12 dager. Sphere cellene ble sub-dyrket ved enzymatisk dissosiasjon, anstrengt, og deretter resuspendert i ovennevnte medium på sub-klonale tetthet.
Sphere Dannelse Analyser
For å vurdere dannelsen av primære kuler, DU145 celler fra sub-sammenflytende (~80%) monolagskulturer ble resuspendert i den ovenfor angitte SF medier ved en tetthet på 2,5 x 10
3-celler i individuelle brønner i en 24-brønners dyrkingsplate (3 brønner pr behandling) (Corning, Corning , NY, USA). Celler ble sådd ut i et volum på 0,5 ml /brønn, i motsetning til 1 ml /brønn som tidligere er publisert [11]. Kulene som ble dannet etter 12 dager med kultur ble talt opp. For å måle den kuledannende kapasitet av sekundære eller etablerte kuler, sfærer ble cellene individuelt ved enzymatisk dissosiasjon, anstrengt, og deretter sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
2 eller 1 x 10
3 celler /brønn i 24 -vel plater (3 brønner pr behandling), med mindre annet er angitt. Kulene som ble dannet ble telt etter 12 dager med kultur.
plasmider og virusproduksjon
EGFRvIII /pLNCX ble vennlig levert av Dr. Khalid Al-Nedawi (Hamilton Centre for Kidney Research, Hamilton, ON, Canada). EGFR (K721A) /pLHCX ble vennlig levert av Dr. Joan Krepinsky (Hamilton Centre for Kidney Research). Konstruksjon av MEK1 (K97M) /pLHCX har tidligere blitt beskrevet [18]. Short-hårnål ERK1 og ERK2 målretting (shERK1 og shERK2, henholdsvis) vektorer ble konstruert ved annealing og delkloning de tidligere publiserte targeting sekvenser (ERK1: GCCATGAGAGATGTCTACA; ERK2: GAGGATTGAAGTAGAACAG) [19] som en hårnål inn i pRIH retroviral vektor, ifølge vår publiserte betingelser [18]. Den kort hårnål kontroll (shLacZ) vektor inneholder en sekvens målretting
Escherichia coli
β-galaktosidase (shLacZ målsekvens: GCAGTTATCTGGAAGATCA). Høye titre av tom vektor (EV) /pLNCX, EGFRvIII /pLNCX, EV /pLHCX, EGFR (K721A) /pLHCX, MEK1 (K97M) /pLHCX, shLacZ /pRIH, shERK1 /pRIH og shERK2 /pRIH retrovirus ble produsert ved hjelp av 293T celler som tidligere beskrevet [18]. DU145 celler ble deretter infisert med det spesifikke retrovirus, og infiserte celler ble selektert i hygromycin (0,5 mg /ml; Life Technologies) for pLHCX og pRIH-baserte infeksjoner, eller G418 (1 mg /ml; Sigma-Aldrich) for pLNCX basert infeksjoner. Ektopisk EGFRvIII og MEK1 (K97M) uttrykk, eller knockdown av endogent ERK1 eller ERK2, ble bekreftet av Western blot analyse.
Kort hårnål EGFR targeting lentiviral vektorer ble kjøpt fra Sigma-Aldrich, med målretting sekvenser (shEGFR1 : GCTGCTCTGAAATCTCCTTTA; shEGFR2: GCCACAAAGCAGTGAATTTAT) klonet som en hårnål i pLKO.1 vektoren, mens en ikke-spesifikk shRNA (plasmid 1864; Addgene, Cambridge, MA, USA) ble anvendt som en kontroll (shCTRL). Produksjon av shEGFR og shCTRL lentivirus ble utført av co-trans hver shRNA plasmid (10 mikrogram) med plasmider (10 mikrogram hver) som er nødvendige for tredje generasjon lentiviral produksjon (pRSV-REV, pCMV-VSV-G, pMDLg /pRRE) [ ,,,0],20], vennlig levert av Dr. Bryan E. Strauss (University of São Paulo School of Medicine, São Paulo, Brasil), inn 293T celler ved hjelp av kalsiumfosfat metoden. Seksti timer (h) etter transfeksjon, supernatantene inneholdende VSV-G pseudotyped, replikasjons-inkompetente lentivirale partikler ble oppsamlet, filtrert gjennom et 0,45 um filter og sentrifugert i 2 timer ved 48 000 g. Virale pelleter ble resuspendert i 1 ml av media inneholdende 10 ug /ml polybrene (Sigma-Aldrich) og tilsatt til monolaget celler i 2 timer i en fuktet 37 ° C inkubator med periodisk blanding ved 20 minutters intervaller, for å tillate celleinfeksjon. Infeksjon ble valgt med puromycin. (1 ug /ml; Sigma-Aldrich)
For infeksjon av kule cellene ble shEGFR2 og shCTRL lentivirus pelletene ble resuspendert i 2 ml serumfritt medium inneholdende 0,4% BSA, 0.2 x B27 (som mangler A-vitamin) og 10 ug /ml polybren og tilsatt til individualisert (3 x 10
5) -celler i 2 timer i en fuktet 37 ° C inkubator med periodisk blanding ved 20 minutters intervaller, for å muliggjøre celle infeksjon. Sphere celler ble deretter sådd ut ved en tetthet på 10
4 celler /ml i T75-kolber og utformet for suspensjonscellekultur (Sarstedt Inc.). Puromycin (1 pg /ml) ble tilsatt til sfæren kulturene ved 48 timer etter infeksjon.
forankrings-uavhengig vekst Assay
DU145 sfære cellekulturer ble platet ut i individuelle brønner i seks-brønns plater ved en tetthet på 10
4 celler /brønn som tidligere beskrevet [11]. Etter 8 uker, ble fase kontrast tatt i 5 tilfeldige felt per brønn med Zeiss Axiovert 200 M mikroskop (AxioVision 3.1 software) på 25X forstørrelse, og koloniene består av ≥50 celler ble talt opp. Fase kontrast ble senere behandlet ved hjelp av Coreldraw Graphics Suite X4 programvare (Corel, Ottawa, ON, Canada).
EGFR og MEK Hemming Studier
EGFR-hemmere AG1478 og PD168393 (Calbiochem, Darmstadt, Hessen, Tyskland) og MEK-inhibitor U0126 (Promega, Madison, WI, USA) ble oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO, Sigma-Aldrich) og benyttet ved de konsentrasjoner som indikert. DMSO ble administrert med et identisk volum som en kontroll (mock-behandling). EGFR-inhibitor (AG1478 eller PD168393), MEK (U0126) eller DMSO (mock) behandling ble administrert på tidspunktet for såing sfære celler. Sfære formasjon ble kvantifisert som tidligere angitt. Inhibering av EGFR og MEK1 kinase-aktivitet (bestemt ved hjelp av EGFR og ERK1 /2 fosforylering status, respektivt) ble bekreftet ved Western blot-analyse.
antistoff-baserte EGFR funksjon blokkerende eksperimenter på kule-celler ble utført som beskrevet tidligere [21]. I korthet, azid-fri EGFR blokkerende monoklonalt muse (Ab-1, klon 528) antistoff (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) eller mus IgG2a isotype kontroll-antistoff (R 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
DU145 Spheres Spredd i fravær av eksogene mitogener Vis EGFR Signal Activation
Vi har tidligere rapportert at mens EGF supplementation betydelig fremmet generering og forplantning av DU145 kuler, ble dannelsen av sfærer ikke krever tilsetning av eksogent EGF [11] som tyder på at EGFR-signalisering kan bli aktivert i fravær av eksogent EGF. For å undersøke denne mulighet, har vi generert bobler fra DU145-celler i fravær (-EGF) og nærvær av EGF (10 eller 20 ng /ml EGF, 10EGF eller 20EGF, henholdsvis) og deretter formeres disse etablerte kuler i tre passasjer, i henhold til identiske tilstander der primær sfærer ble generert, før evaluere sin sfære dannende kapasitet. Kuler som genereres i den -EGF media tilstand kan opprettholdes på en ensartet måte i minst tre passasjer. Videre er evnen til å generere og opprettholde kuler i den -EGF tilstand (figur 1A) antyder at forplantning i henhold til EGF-fritt (også uten tilsetning av andre ytre vekstfaktorer) mediebetingelser er en iboende egenskap ved DU145 PCSCs. Denne mulighet er støttet av det faktum at antallet kuler opprettholdes etter utsåing 5 x 10
2-celler /brønn ble omtrent halvparten av det formert etter utsåing 1 x 10
3 celler /brønn (figur 1A). Videre er denne muligheten også i tråd med vår siste observasjon at -EGF kuler har blitt dyrket i -EGF medier for mer enn 15 påfølgende passasjer i konsistent måte som vist i figur 1A, da dette manuskriptet ble utarbeidet (data ikke vist). Selv om EGF forbedret sfære forplantning i forhold til kule celler dyrket i media -EGF (10EGF og 20EGF i forhold til -EGF), 20EGF ikke lenger stimulere sfære antall i forhold til 10EGF behandling. Dette tyder på at en EGF-indusert terskel finnes (figur 1A).
A) EGF øker sfære dannelsen uavhengig av cellen seeding tetthet. DU145 sfærer ble samlet og holdt i serum-fritt medium inneholdende 0,4% BSA og 0,2 x B27 (SF), og supplert med eller uten EGF (10 eller 20 ng /ml; 10EGF eller 20EGF, henholdsvis) i tre passasjer å etablere EGF- gratis (-EGF) og EGF-stimulert sfære kulturer før eksperimentering. Sphere celler ble sådd ut ved en tetthet på 5 x 10
2 og 1 x 10
3 celler /brønn (1 x 10
3 og 2 x 10
3 celler /ml, henholdsvis) i 24 -vel plater (tre gjentak per behandling). Seks forsøk ble utført. Spheres opprettholdt i EGF-supplert SF media skjerm forbedret sfære tall i forhold til -EGF sfære kulturer. Spheres opprettholdt i SF medier som inneholder 10 ng /trenger ml EGF ikke vise flere økninger i sfæren dannende kapasitet. B) Behandling av -EGF kuler med økende konsentrasjoner av EGF (+ 10EGF eller + 20EGF, henholdsvis) øket sfære formasjon, og C) forbedret aktivering av EGFR-signalisering (EGFR fosforylering ved Tyr1068; EGFR-P). Sphere tall vises som gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige forsøk. (*
p
0,05 i forhold til den respektive -EGF media tilstand; tosidige uavhengig Student
t
-test)
for å undersøke hvorvidt kuler generert og vedlikeholdes i -EGF media tilstanden svare på EGFR signal aktivering, vi har kultivert etablert, EGF-frie kuler i nærvær av eksogene EGF. Ikke bare gjorde disse EGF-fri sfære celler svare på eksogene EGF behandling når sådd ved sub-klonale tettheter av 5 × 10
2 og 1 x 10
3 celler /brønn (1 × 10
3 og 2 x 10
3 celler /ml, henholdsvis) (figur 1B), men de kan også svare til EGF til samme nivå som disse sfærer som genereres og opprettholdes i EGF-inneholdende medium (sammenlikne figur 1B med figur 1A). Disse observasjoner tyder på at i fravær av eksogent EGF, kan kulene være i stand til å aktivere EGFR-signalering. Til støtte for denne mulighet, fosforylering av EGFR ved tyrosin (Y) 1068 (EGFR-P), et vanlig brukt surrogatmarkør for EGFR signal aktivering [22], ble lett detektert i -EGF og + EGF (10EGF og 20EGF) sfære cellene (figur 1C). Til sammen ovennevnte observasjoner støtter oppfatningen om at EGFR-signalering spiller en viktig rolle i utbredelsen av DU145 PCSCs.
Tvungen EGFR Signal Activation Renders DU145 PCSCs Non-respondere på EGF Behandling
For ytterligere fastslå rollen til EGFR signal aktivering i DU145 PCSCs, konstitutivt aktiv EGFR-mutant, variant EGFR III (EGFRvIII) [23], ble overuttrykt i DU145 monolayer-celler (figur 2A). EGFRvIII-uttrykke celler vises forhøyede nivåer av Tyr1068 fosforylering (EGFR-P) og ERK-aktivering (Thr202 /Tyr204 fosforylering på ERK1 /2; ERK1 /2-P) i SF media (figur 2A), som viser at svangerskap utenfor EGFRvIII uttrykk resulterte i konstituerende EGFR signalering. I forhold til tom vektor (EV) omsatte DU145 cellene, DU145 EGFRvIII-uttrykkende celler generert mer primære kuler i -EGF media (figur 2B). Videre EGF tilskudd fremmet generasjon av primære kuler fra DU145 EV celler, men ikke EGFRvIII-uttrykkende celler (figur 2B). Imidlertid EGFRvIII-uttrykkende celler som kan danne sfæriske kuler i primær -EGF medier på et tilsvarende nivå som DU145 EV sfæriske celler dyrket i nærvær av eksogent EGF (figur 2B). Derfor DU145 EGFRvIII-uttrykker cellene har en sammenlignbar kapasitet for primær sfære generasjon som DU145 EV celler stimulert med rekombinant EGF (figur 2B). Lignende observasjoner ble også oppnådd i sfære forplantning (det vil si produksjon av sekundære kuler ved poding av 10
3 celler /brønn) (figur 2C). Sammen er disse resultatene støtter vår hypotese om at EGFR-signalering bidrar til utbredelsen av DU145 PCSCs
A) Western blot analyse av EGFRvIII uttrykk og aktivering (Tyr1068 fosforylering,. EGFR-P) i DU145 forelder (monolags) celler dyrket i serum-supplert (10% FBS) og serum-fri (SF) media. EGFRvIII uttrykk i DU145 cellene aktiverer ERK signalering. ERK-aktivering ble bestemt ved å undersøke fosforylering av ERK1 og ERK2-proteiner ved Thr202 og Tyr204 rester, henholdsvis (ERK1 /2-P). B) Primær (1 °) og C), sekundær (2 °) sfære formasjon følgende EGFRvIII ekspresjon i DU145-celler sammenlignet med tom vektor (EV) kontrollceller. Celler ble sådd ut i serum-fritt medium inneholdende 0,4% BSA, 0,2 x B27 og mangler eksogene vekstfaktorer (-EGF), eller med EGF supplert (10 ng /ml; 10EGF), ved en tetthet på 2,5 x 10
3 (1 ° sfære dannelse) eller 1 x 10
3 celler /brønn (2 ° sfære dannelse) i 24-brønners plater (0,5 ml /brønn; tre replikater per behandling). Forsøk ble utført i tre eksemplarer. Sphere tall vises som gjennomsnitt ± SEM (
p
verdier for de angitte sammenligninger ble innhentet av to-tailed uavhengig Student
t
-test).
EGFR-blokkaden Reduserer selvfornyelse kapasitet av DU145 PCSCs
for ytterligere å undersøke kravet om EGFR-signalering i forplantning (selvfornyelse) av DU145 PCSCs, undersøkte vi effekten av EGFR signal hemming på sfære vedlikehold. Sfære-celler ble behandlet med økende konsentrasjoner av AG1478 (Tyrphostin), en selektiv inhibitor av EGFR (ErbB1) kinase-aktivitet som virker ved å binde den i sin inaktive form [24]. AG1478 behandling ble undersøkt etter 24 timer etter behandling, som EGF behandling oppnås de høyeste nivåene i EGFR-P i sfæren cellene på dette tidspunkt (fig S1). AG1478 behandling reduserte EGFR aktivering i en doseavhengig måte i sfære celler, med og uten tilsetting av eksogent EGF (figur 3A). Videre AG1478 doseavhengig redusert sfære forplantning, som det antall sfærer som genereres fra etablerte sfære cellekulturer ble redusert med AG1478 behandling, uavhengig av om eksogent EGF var til stede (figur 3B). Lignende observasjoner ble også oppnådd ved anvendelse av EGFR-inhibitor PD168393 [25] (figur 3C). Dette viser at hemming av EGFR signale blokkerer selvfornyelse kapasitet på DU145 PCSCs.
A) Western blot analyse av helcellelysater etter 24 timers behandling av DU145 kuler med DMSO (D) eller økende konsentrasjoner av AG1478 ( 0,1-20 pM konsentrasjonsområde), i nærvær eller fravær av eksogent EGF (10 ng /ml; 10EGF). Sfære dannelse av EGF-fritt sfære-celler ble hemmet etter behandling med EGFR-inhibitorer B) AG1478 eller C) PD168393 ved forskjellige doser i nærvær (10EGF) eller fravær (-EGF) av eksogent EGF (10 ng /ml). Sphere celler ble sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn (0,5 ml /brønn; tre replikater per behandling). EGFR-inhibitor (AG1478 eller PD168393) eller DMSO (mock) behandling ble administrert på tidspunktet for såing. Kuler som ble dannet ble regnet 12 dager etter såing. Sphere tall vises som gjennomsnitt ± SEM (
p
verdier for de angitte sammenligninger ble innhentet av to-tailed uavhengig Student
t
-test).
For ytterligere å adressere om tap av EGFR-signalering påvirker evnen til DU145 PCSCs å opprettholde seg selv, DU145 monolagcellene ble infisert med shRNA konstruerer rettet mot EGFR. Disse konstruksjonene effektivt slått ned EGFR, med svakt variasjoner i nivåene av EGFR knockdown innenfor de respektive stabile cellelinjer (figur 4A). Den shEGFR konstruere # 2 (shEGFR2) oppnådde et større knockdown enn shEGFR1 (95% vs 70%, henholdsvis) (figur 4A). Stabile EGFR knockdown cellelinjer kunne opprettholdes i fullstendig media. Imidlertid ektopisk ekspresjon av EGFR (K721A), en EGFR-mutant som mangler protein-tyrosin-kinase-aktivitet [26], resulterte i celledød og hindret dannelsen av en stabil cellelinje (data ikke vist). Ved å bruke disse stabile EGFR knockdown cellelinjer, var vi i stand til å vise at EGFR knockdown i DU145 cellene redusert sin kapasitet til å generere primære kuler i forhold til shCTRL celler (figur 4B). Evnen til EGFR knockdown å påvirke sfære vedlikehold ble også undersøkt. Stabil EGFR knockdown i sfæren celler (figur 4C) redusert antall påfølgende sfærer dannet i -EGF media tilstand (figur 4D).
A) DU145 monolagcellene ble infisert med EGFR shRNA lentiviral konstruksjoner og valgt med puromycin for å generere stabile cellelinjer. Western blot-analyse av forskjellige EGFR knockdown (shEGFR) celler ble utført for å evaluere EGFR knockdown effektivitet i forhold til den ikke-spesifikke shRNA kontroll (shCTRL) cellelinje. B) Stabil EGFR knockdown cellene danner færre primær (1 °) kuler i forhold til shCTRL celler. Celler ble sådd ut ved en tetthet på 2,5 x 10
3 celler /brønn (0,5 ml /brønn; tre replikater per behandling). Sphere tall vises som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter (*
p
0,05 i forhold til den respektive -EGF media betingelse for hver cellelinje, to-halet Student uavhengig
t
-test). C) Effektiv EGFR knockdown i etablerte DU145 kuler kan også oppnås. Celler fra EGF-fri (-EGF) kuler ble infisert med shCTRL og shEGFR2 lentivirus. Tap av EGFR protein uttrykk reduserer D) antall DU145 sfærer dyrket under EGF-frie medie forhold betydelig. EGFR knockdown (shEGFR2) og shCTRL sfæriske celler ble sådd ut ved en tetthet på 1 x 10
3 celler /brønn (tre replikater per cellelinje). Antallet kuler som ble dannet, ble tellet 12 dager etter såing. Sphere nummer vises som gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige forsøk (**
p
0,01; tosidige uavhengig Student
t
-test). E) EGFR knockdown i DU145 sfære cellene betydelig redusert in vitro forankringsuavhengig vekst. Det totale antall kolonier i 5 tilfeldig felt (ved 25X forstørrelse) ble tellet og representert som gjennomsnitt ± S.E.M. av tre uavhengige forsøk (**
p
0,01; tosidige uavhengig Student
t
-test). Representative fase kontrast av kolonier vises på 50X forstørrelse (innfelt). Scale bar er lik 100 mikrometer
Et viktig trekk ved cellulær transformasjon in vitro, som tett korrelerer med in vivo tumorigenicity hos immunsupprimerte mus [27] -. [29], er evnen til tumorigene celler å forplante i henhold til forankrings-uavhengig betingelser. For å møte om tapet av EGFR uttrykk påvirker forankringsuavhengig vekst av DU145 PCSCs, ble etablert EGFR knockdown sfære celler sådd i serum-supplert, myk agar-holdige medier. EGFR knockdown i sfæren celler resulterte i færre myke agar kolonier i forhold til shCTRL sfære cellene under differensierende (serum-supplert ie.) Forhold (figur 4E). Til sammen viste vi at EGFR-signalering er avgjørende for å opprettholde DU145 PCSC forplantning, som er konsistent med den observerte reduksjonen i myke agar-koloni tallene følgende EGFR knockdown.
MEK-ERK Signa Regulerer selvfornyelse Egenskaper av DU145 PCSCs
etter demonstrasjonen som EGFR signalering er viktig i produksjon og vedlikehold av PCSCs, vi videre undersøkt nedstrøms mekanismene som er ansvarlig for den observerte EGFR aktivitet. EGFR-signalisering er godt kjent for å initiere signaleringshendelser som involverer aktivering av PI3K-AKT og Raf-MEK-ERK (mitogen aktivert proteinkinaser; MAPK) trasé [30]. I tillegg har EGFR-signalisering er vist å aktivere signal transduser og aktivator av transkripsjons- (STAT proteiner) [31], spesielt STAT3-mediert signalisering [32]. Aktivering av STAT3 omfatter fosforylering ved Tyr705 [33], og STAT3 har vist seg å være aktivert i prostata-kreft [34], [35]. Vårt tidligere arbeid har foreslått at i vårt system, andre nedstrøms signaliseringsproteiner, snarere enn AKT, må være kritisk for EGF-forsterket DU145 sfære formasjon [11]. Mens AKT kan bidra til DU145 sfære forplantning, har vi ytterligere utvidet på vår forrige rapport for å undersøke bidrag av ERK veien mot EGFR-avhengig spredning av DU145 PCSCs.
I dette arbeidet, var vi i stand til å vise at EGF stimulering av EGF-fritt DU145 sfæriske celler resulterte i ERK-aktivering, men ikke STAT3 aktivering, i en tidsavhengig måte (figur S1). Videre er MEK-inhibitor, U0126 [36], doseavhengig redusert selvfornyelse kapasitet på DU145 PCSCs (figur 5A). Som forventet, U0126 hemmet ERK-aktivering i DU145 PCSCs (figur S2). For å konsolidere resultatene implicating MEK-ERK signal i DU145 PCSC forplantning, har vi uttrykt dominerende negative MEK1 (K97M) [37] i DU145 cellene (Figur 5B). MEK1 (K97M) celler viste redusert ERK-aktivering sammenlignet med tom vektor (EV) kontrollceller følgende FBS-stimulering (10%) av serum-belastede celler (Figur 5B). I forhold til EV-celler, viste MEK1 (K97M) celler en betydelig reduksjon i å generere primære Kuler (figur 5C). Til støtte for MEK-ERK signal å være kritisk til EGFR-medierte generasjon av DU145 PCSCs, eksogene EGF var ute av stand til ytterligere å styrke primær sfære dannelsen av MEK1 (K97M) celler (figur 5C).
A) Hemming av ERK
