Abstract
Mål
For å utforske de viktigste regulatoriske gener assosiert med lungekreft for å redusere forekomst og fremgang gjennom stanse disse viktige gener.
Metoder
for å identifisere de viktigste regulatoriske gener involvert i lungekreft, utførte vi en kombinasjon av genet matrise og bioinformatikk analyser for å sammenligne gentranskripsjon profiler i tre monoklonale cellestammer med høy, middels eller lav metastatiske evner, som ble skilt fra SPC -A-1sci og SPC-A-1-cellelinjer ved begrensende fortynning monoclone assay. Vi deretter analysert disse genene «biologiske aktiviteter ved å slå ned sine uttrykk i SPC-A-1sci celler ved hjelp av siRNA og lenti-viral shRNA vektorer, etterfulgt av bestemmelser av invasjonen og migrasjon egenskapene til de resulterende cellelinjer in vitro samt deres potensial for å indusere forekomst og metastasering av lungekreft in vivo. For å undersøke den kliniske relevansen av disse funnene, analyserte vi uttrykket nivåer av de identifiserte gener i humane lungekreft vev (n = 135) og matchet tilstøtende normalt vev ved immunhistokjemisk (IHC) farging.
Resultater
Tre monoklonale cellestammer preget med høy, middels eller lav metastatiske evner ble vellykket valgt. Gene array og bioinformatikk analyser antydet at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 var sentrale gener involvert i lungekreft. Knockdown av disse genene trykkes human lunge-cancercelleinvasjon og metastaser in vitro og in vivo. Klinisk prøveanalyser indikerte at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 protein uttrykk nivåer var høyere hos lungekreftpasienter, sammenlignet med ikke-kreft tilstøtende vev, og korrelert med lymfatisk metastaser.
Konklusjoner
Vi har bekreftet at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 spilt viktige roller i forekomst og metastasering av lungekreft, og dermed gitt viktige ledetråder for å forstå den molekylære mekanismen for metastaser og bidra til terapeutisk behandling av lungekreft
Citation. Wang XM, Li J, Yan MX, Liu L, Jia DS, Geng Q, et al. (2013) Integrative Analyser Identifisere osteopontin, LAMB3 og ITGB1 som Kritiske Pro-metastatisk gener for lungekreft. PLoS ONE 8 (2): e55714. doi: 10,1371 /journal.pone.0055714
Redaktør: Xin Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kina
mottatt: 12. august 2012; Godkjent: 29 desember 2012; Publisert: 18 februar 2013
Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Key Basic Research Program of China (2009CB521803), og «action plan for innovasjon» av Shanghai Science and Technology fond (10140902400). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Lungekreft fortsetter å være den ledende årsak til kreft dødsfall i verden (
1 million dødsfall per år på verdensbasis) [1] – [2]. Metastase er et tegn og funksjon av ondartet lungekreft og er også den viktigste årsaken til lungekreft dødsfall og behandlingssvikt [3]. Selv om over hundre års intenst arbeid har fokusert på å undersøke metastatisk prosess, de molekylære mekanismene til rette for progresjon fra carcinoma in situ til metastaserende fortsatt i stor grad unnvikende. Det er sikkert, er imidlertid at metastase en dynamisk og progressiv flertrinnsprosess. Flere forskjellige trinnene er merkbar i den biologiske kaskade av metastaser: tap av mobilnettet vedheft, økt bevegelighet og invasivitet, oppføring og overlevelse i sirkulasjon, spre seg til nytt vev og eventuell kolonisering av et fjernt område [4]. Betydelige Landmark studier har vist at bare visse subpopulasjoner av en primærtumor har invasive og metastatiske potensiale til å gjennomgå full metastatiske prosess av invasjon, intravasation og ekstravasasjon [5] – [6]. Emerging fra disse studiene ble to begrepene grunnleggende for vår kreft leksikon: «metastatisk subpopulasjoner» og «metastatisk ineffektivitet» [7]. Dermed vil en studie av de ulike genuttrykk profiler mellom metastatiske subpopulasjoner og metastatisk ineffektivitet av genet chip-teknologi avdekke kritiske gener som er involvert i kreftmetastaser.
I vårt tidligere arbeid, vi etablert en meget inngripende celle underlinjen (SPC -A-1sci) og en svakt invasiv celle sublinje (SPC-A-1) ved in vivo-seleksjon i NOD /SCID-mus [8]. Disse cellelinjer tilgjengelig en passende modell for å studere den metastatiske mekanisme for lungekreft. Her har vi ytterligere separert 2 monoklonalt cellestammer fra SPC-A-1sci cellelinje og et monoklonalt cellestamme fra SPC-A-1 (foreldrecellelinje) som kjennetegnes med høy, middels eller lav metastatiske evner, henholdsvis ved å begrense fortynning monoclone analysen. Vi utførte gen-chip kombinert med bioinformatikk analyser på disse tre stammer.
Ifølge genet matrise resultater, fant vi 2277 oppregulert og 2257 nedregulert gener mellom de tre cellestammer. Den bioinformatikk Analysen avdekket flere detaljer om de viktige funksjoner, veier, uttrykksfulle tendenser og signalstrømmer av disse forskjellige gener. Den resulterende kurve som fra signal-strømningsmodell angitt viktige regulatoriske roller for SPP1 (eller osteopontin), LAMB3, MAPK1, og juni i den metastasering av SPC-A-1sci cellelinje.
Tidligere har det vært rapportert at cellene endrer sin celle-celle adhesjon egenskaper, omorganisere ekstracellulære matriks (ECM) miljø, og omorganisere sine cytoskeletons til rette for migrasjon og invasion.A mye bevis har indikert at osteopontin lettere å feste celler til ECM gjennom binding til flere typer av integriner (ints), forbedret ekspresjon og aktivitet av MMP-2, og fremmet tumorvekst og metastase gjennom aktivering av overlevelsesreaksjonsveier [9] – [13]. Laminin også fremmet celle adhesjon og migrasjon ved å samhandle med ints [14] – [16]. Her har vi bekreftet at knock-down av osteopontin, LAMB3 og ITGB1 redusert metastasering av SPC-A-1sci cellelinje gjennom en serie forsøk både in vitro og in vivo. Disse funnene har bekreftet at osteopontin, LAMB3, og ITGB1 spilt viktige roller i metastasering av lungekreft og gir verdifulle ledetråder for studiet av metastatisk mekanisme for lungekreft.
Materialer og metoder
etikk Uttalelse
Alle dyreforsøk protokollene som brukes i denne studien ble godkjent av Shanghai Medical Experimental Animal Care-kommisjonen på Shanghai Jiaotong University (godkjenning ID ShCI-12-023).
Cellelinjer linjer~~POS=HEADCOMP
Den menneskelige lunge adeno-karsinom cellelinje SPC-A-en er hentet fra Cellular Institute of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Denne cellelinjen ble opprinnelig isolert fra de kirurgiske eksemplarer av en kinesisk mann med avansert lunge adeno-karsinom av Shanghai Chest Hospital og Cellular Institute of Chinese Academy of Science i 1980 [17]. Den menneskelige høy metastatisk lungekreft cellelinje SPC-A-1sci ble etablert av Yao Ming (Shanghai Jiaotong University, Shanghai Cancer Institute) [8]. Begge linjer ble dyrket i DMEM medium inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum ved 37? C, 5% CO
2.
begrensende fortynning Monoclone Isolering
SPC-A -1sci celler ble trypsinisert og resuspendert i DMEM i en konsentrasjon på 100 celler per 10 ml, hvorav 0,1 ml ble tilsatt til hver brønn i 96-brønners plater som allerede inneholder 0,1 ml 10% FBS DMEM. To uker senere ble hver brønn observert under et mikroskop, og 20 monoklonale stammer av SPC-A-1sci-celler ble selektert og propagert.
Microarray Data Analysis
Total RNA fra hver cellelinje var høstes ved hjelp Trizol reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Total RNA ble sendt til Shanghai Bioteknologi Co, Ltd (Shanghai, Kina). Total RNA ble hybridisert på Affymetrix U133 pluss 2,0 array (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) og behandlet i henhold til Affymetrix tekniske protokoller. Statistiske algoritmer ble brukt i analysen av Genechip uttrykk data.
Bioinformatikk Analyse
Gene ontologi (GO) analyse.
GÅ analyse ble brukt for å analysere de viktigste funksjonene i forskjellig uttrykt gener i henhold til Gene ontologi, nøkkelen funksjonell klassifisering av NCBI. Vanligvis Fishers eksakte test og χ
2 test ble brukt til å klassifisere GO kategorien, og den falske funnraten (FDR) ble beregnet til å korrigere
P
-verdi, med en mindre FDR som tilsvarer en mindre feil i å bedømme
P
-verdi. FDR ble definert som, der N
κrefers til antall Fishers test
P
-verdier mindre enn χ
2 test
P
-verdier. Vi beregnet
P
-verdier for GO klassifiseringer av hvert forskjellig uttrykt gen. Berikelse er et mål på betydningen av funksjon: som berikelse øker, er den tilsvarende funksjon mer spesifikk, som hjelper oss å identifisere de GOs i forsøket med mer konkrete funksjonsbeskrivelser. Innenfor hver signifikant kategori, ble anrikning (Re) gitt ved:, hvor n
f
er antall differensial gener innenfor bestemt kategori,
n
er det totale antall gener innenfor samme kategori,
N
f
er antall differensielt uttrykte gener i hele microarray, og
N
er det totale antall gener i microarray [18] – [21].
Go-kart.
The Go-kart, et samspill nettverk av de betydelige GOs av forskjellig uttrykte gener, ble bygget i henhold til Gene Ontologi klassifikasjoner for å identifisere samspill mellom de betydelige GOs direkte og systemisk. Dette kartet potensielt oppsummerer de funksjonelle interaksjoner av differensielt uttrykte gener under sykdomstilstander [22] – [24]
hovedbane analyse
På lignende måte ble sti-analyse anvendt for å bestemme vesentlige veier av.. de differensielt uttrykte gener i henhold til KEGG, Biocarta og Reatome. Igjen, benyttet vi den Fishers eksakte test og χ
2 test for å velge de betydelige trasé, og terskelen for signifikans ble definert av
P
-verdi og FDR. Den berikelse ble beregnet i henhold til ligning beskrevet over [19], [21].
Bane-Net.
En bane-Net ble bygget for å direkte og systematisk identifisere samspill mellom de store veier av forskjellig uttrykte gener i henhold til samspill mellom trasé av KEGG database. Det ga en oppsummering av veien interaksjoner av forskjellig uttrykt gener under sykdomstilstander og bistått i å finne ut hvorfor en bestemt bane ble aktivert [23].
Signal-flow
Ekstern mobil stimulus påvirker celle atferd og gjenspeiles i protein interaksjons og genuttrykk kinetikk. Vi utledes derfor en dynamisk gennettverk, beregnet i henhold til folden uttrykket av gener og deres interaksjoner i trasé. Relasjoner av genuttrykk data ble utledet ved hjelp av en kontinuerlig tid tilbakevendende nevrale nettverk (CTRNN) som en abstrakt dynamisk modell for gennettverk mediermobil beslutningen om å migrere på en ekstern stimulans. Modellen beskriver den gjensidige påvirkning av gener og deres stimulus respons som dynamiske elementer, uavhengig av hvordan en slik interaksjon eller stimulering realiseres i konkrete biologiske termer. Den CTRNN modellen er vanligvis beskrevet som, hvor betegner tidskonstanten, betegner ekstern inngang,
betegner vekten av genet
j
inn genet
i
, betegner forskyvningen av genet
j
betegner sigmoid aktiveringsfunksjonen, og betegner genet
i
uttrykk verdi på
t
tid punkt. Ved hjelp av denne genetiske algoritmen, vi estimert modellparametere [25]
siRNA Transfeksjon
siRNA oligonukleotider med følgende sekvenser ble syntetisert av selskap (Jima, Shanghai, Kina). Negativ kontroll siRNA, følelse : 5′-UUC UCC GAA CGU HiG ACG Utt-3 «og antisense: 5′-ACG UGA CAC Guu CGG AGA Att-3′; osteopontin siRNA, sense: 5»-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 «og antisense: 5′-AGA AUC AUC UUC AGA august G-3′; LAMB3 siRNA, sense: 5»-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 «og antisense: 5′-AGA AUC AUC UUC AGA august G-3′; ITGB1 siRNA, følelse: 5»-CCA UUC UGA UGA AUC UGA U-3 «og antisense: 5′-AUC AGA UUC AUC AGA august G-3». Levering av siRNAs ble oppnådd ved hjelp LipofectAMINE 2000 reagens (Invitrogen, Burlington, ON) i henhold til produsentens instruksjoner. I korthet, 3 x 10
5-celler /brønn ble sådd ut i 6-brønns plater, dyrket over natt for å oppnå 50-70% konfluens, vaskes deretter med DMEM uten serum og antibiotika. LipofectAMINE 2000 reagens og siRNA ble blandet og tilsatt til cellene ved sluttkonsentrasjoner på 5 pl /brønn og 2,5 ug /brønn, henholdsvis, fulgt av inkubering ved 37 ° C i 48 timer.
Fremstilling av proteinekstrakter
Proteiner fra de dyrkede SPC-A-1sci cellelinjer som mottok siRNA behandlinger ble høstet og slått sammen fra 10 brønner av to seks-brønns plater. Alle proteinekstraksjon prosedyrer ble utført på is. I korthet ble cellene vasket med kald PBS, skraping av celleskraper, og deretter overført til 1,5 ml rør og lysert med 200 ul iskald lyseringsbuffer per rør. Etter en 40-minutters inkubering på is, ble homogenatene sentrifugert ved 12.000 g i 10 min ved 4 ° C. Supernatantene ble samlet etter centrifugation.All proteinekstrakter ble lagret ved -20 ° C.
Western Blot analyse
Ved hjelp av det totale protein isolert ovenfor. SDS-PAGE (12%) geler ble kjørt og deretter overført til nitrocellulosemembraner ved 4? C. Membranene ble blokkert i PBS inneholdende 5% melk i 2 timer, etterfulgt av tilsetning av primære antistoffer mot osteopontin (1:400), ITGB1 (1:500), LAMB3 (1:500), og β-aktin (1: 15000) Primære antistoffer ble inkubert over natten ved 4 ° C, etterfulgt av inkubasjon med passende HRP-konjugerte sekundære antistoffer ved romtemperatur i 1,5 timer. Membranene ble deretter vasket med PBST (150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 8,0, 0,05% Tween-20), og spesifikke proteiner ble påvist ved anvendelse av HRP-systemet.
Sanntids kvantitativ PCR-analyse
Total RNA fra de dyrkede SPC-A-1sci cellelinjer som fikk siRNA behandlinger ble høstet ved hjelp Trizol reagens i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble oppnådd ved bruk av revers transkripsjon Reagenser (Takara) og følge produsentens instruksjoner. Real-time PCR-analyse ble utført på en 7300 Real-Time PCR System med SDS RQ Study programvare (Applied Biosystems) i henhold til produsentens instruksjoner. cDNA maler ble kombinert med SYBR Grønn premix inneholder Rox (Takara) til å utføre de kvantitative PCR reaksjoner. Primerne anvendt for kvantitativ PCR var som følger: osteopontin frem: 5′-GACAGCCAGGACTCCATT-3 «; osteopontin omvendt: 5»-GATGTCAGGTCTGCGAAA -3 «; LAMB3 frem: 5»-AGGCAAGAACTGTGAGCG-3 «; LAMB3 omvendt: 5»-GGGTTGGCGTAGGTGAGT-3 «; ITGB1 frem: 5»-AATGTAACCAACCGTAGC-3 «; ITGB1 omvendt: 5»-CAGGTCCATAAGGTAGTAGA-3 «; p-aktin frem: 5»-AGTGTGACGTGGACATCCGCAAAG-3 «; p-aktin omvendt: 5»-ATCCACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3 «. Genekspresjon ble normalisert til p-aktin. Alle reaksjoner ble kjørt i tre eksemplarer.
Ripe sårtilheling analysen
Den ripe ville healing Analysen ble utført med liten endring fra det som tidligere er beskrevet [26]. Celler ble dyrket til tilnærmet 90% konfluens i 24-brønners plater deretter sultet i lavt serum-medium (1% FBS i DMEM) over natten. En rett ripe i cellemonolaget ble gjort ved å bruke en 200 ul pipette for å simulere et sår. Cellene ble vasket med PBS, og dyrket med 1% FBS i DMEM i ytterligere 24 timer. Tre bilder per brønn ble deretter samlet fra tilfeldige felt ved hjelp av en CKX41 mikroskop (Olympus, Japan). Prosentandelen av sårede område som var fylt ble beregnet som følger: {(bety såret bredde – midlere gjenværende bredde) /bety såret bredde} x 100 (%)
migrering og invasjon Assays
. celle migrering og invasjon analyser ble utført ved bruk av 6,5 mm-trans-brønners kamre (8 um porestørrelse, Corning) som beskrevet tidligere, med noen modifikasjoner [27]. Celler ble sådd på 100.000 celler per brønn i trans-brønn kamre og Matrigel-belagte trans-brønn kamre for migrasjon og invasjon analyser. Brønnene ble vasket med PBS etter 24 timer for begge analyser. Cellene som hadde migrert og invaderte til basal side av membranen ble fiksert og farget med H E eller krystallfiolett, visualisert og fotografert med et CKX41 mikroskop ved 400 x forstørrelse og et DP20 Imaging System (Olympus, Japan). Bilder av tre tilfeldige felt fra tre replikere brønnene ble oppnådd, og antall celler som hadde migrert og invadert ble regnet.
shRNA Eksperimenter
lenti-viral shRNA vektor ble bygget som tidligere beskrevet [28]. Kort fortalt ble negativ kontroll, osteopontin, LAMB3 og ITGB1 shRNA subklonet inn i
Mlu
I /
Cla
I områder av pLVTHM vektor (Addgene) ved hjelp av følgende oligonukleotider: 5′-CGCGTCGTAGCGACTAAACACATCAATTttc aagagaAATTGATGTGTTTAGTCGCTATTTTTTGGAAT -3 «og 5′-CGATTCCAAAAAATAGCGACTAAACACATCAATTtctcttgaaAATTGATGTGTTTAGTCGCTACGA-3′ for den negative kontrollen, 5»-CGTCGGCCATGACCACATGGACGATTTT
CAAGAG
AAATCGTCCATGTGGTCATGGCTTTTTTGGAAT-3 «og 5» CGATTCCAAAAAAGCCATGACCACATGGACGATTT
CTCTTG
AAAATCGTCCATGTGGTCATGGCCGA-3 «for osteopontin, 5’CGCGTCGCCCGGATCCTAGATGCAAAGA
TTCAAGAGA
TCTTTGCATCTAGGATCCGGGTTTTTTGGAAT-3 «og 5’CGATTCCAAAAAACCCGGATCCTAGATGCAAAGA
TCTCTTGAA
TCTTTGCATCTAGGATCCGGGCGA-3′ for LAMB3 og 5′-CGCGTCGGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT
TCAAGAG
ATGAAACTTCGGATCTGTACACTTTTTTGGAAT-3 «og 5’CGATTCCAAAAAAGTGTACAGATCCGAAGTTTCAT
CTCTTGA
ATGAAACTTCGGATCTGTACACCGA -3 «for ITGB1. Lenti-virus generering og infeksjon av SPC-A-1sci celler ble utført som beskrevet ovenfor.
Animal Experiments
fem til seks uker gamle hann nakne mus ble opprettholdt under bestemte pathogen- gratis (SPF) forhold. Musene ble manipulert og plassert i henhold til protokoller godkjent av Shanghai Medical Experimental Animal Care kommisjonen. For å analysere in vivo metastatiske evner av SPC-A-1sci celler med banket ut osteopontin, laminin β3 eller integrin β1, 2,0 x 10
6 SPC-A-1sci-celler ble injisert inn i halevenen til nakne mus. Ti uker senere ble alle musene avlivet, og lungene ble fjernet og bearbeidet for standard histologiske undersøkelser etter fiksering i 10% formalin. De faste prøver ble innleiret i parafin, og tre ikke-sekvensiell seriesnitt ble erholdt per dyr. Seksjonene ble farget med H . E og analysert for forekomst av metastaser
Menneskelige NSCLC Vev
Pasientprøver i denne studien ble innhentet etter informert samtykke, ifølge en etablert protokoll godkjent av etikkomiteen av Shanghai Jiao Tong University School. De data som ikke inneholder noen informasjon som kan føre til identifikasjon av pasientene. Matchet par (n = 135) av lungekreft vev og tilstøtende noncancerous vev ble brukt til bygging av en vev microarray (Shanghai biochip Co, Ltd Shanghai, Kina) som tidligere beskrevet (34). Immunhistokjemisk farging ble utført for å påvise ekspresjon av osteopontin, LAMB3, og ITGB1 i lungekreft vev og passet ikke-cancervev. De primære antistoffer mot osteopontin, LAMB3, og ITGB1 ble oppnådd fra Sigma (1:250), Santa Cruz (01:50), og Abgent (01:50). Anledninger ble målt ved prosentandelen av positive celler med følgende fargeintensitetene: mindre enn 5% mottok «0»; 5-24% scoret «1»; 25-49% scoret «2»; 50-74% scoret «3»; og mer enn 74% scoret «4».
Statistical Analysis
Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SD. Sammenligninger av kvantitative data ble analysert ved Student
t-
test mellom to grupper (tosidig;
P
0,05 ble betraktet som signifikant). Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne kvalitative variabler. Analyser ble utført med SAS 9.0 for Windows.
Resultater
forskjellige stammer av SPC-A-1sci cellelinje vise ulike metastatisk Potentials
I vårt tidligere arbeid, en høyt metastatisk lungecancer-cellelinje (kalt SPC-A-1sci) ble etablert fra den dårlig metastatisk human lunge-cancercellelinje SPC-A-1 til og med tre sykluser med in vivo markering. Den betydelig høyere metastatisk potensial av SPC-A-1sci cellelinje i forhold til den SPC-A-1 linje er blitt påvist ved en rekke eksperimenter in vivo og in vitro. For å utforske årsakene til den høye metastatisk potensial av cellelinje SPC-A-1sci, vi videre oppnås de monoklonale cellestammer SPC-A-1sci H og SPC-A-1sci m fra SPC-A-1sci celler, og det monoklonale SPC -A-1L cellestamme fra SPC-A-1 cellelinje ved begrensende fortynning klonal assay, som beskrevet tidligere, med små modifikasjoner (figur 1A).
(A) Morfologi av fem monoklonale cellestammer er valgt fra SPC-A-1sci og SPC-A-1-cellelinjer ved begrensende fortynningsanalyse. Foreldre SPC-A-1sci celler og SPC-A-1sci H og SPC-A-1sci M cellestammer alle utstillings spin form. (B) motilitet aktiviteter SPC-A1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 og SPC-A1 L-celler ble bestemt av ripe sårheling analyser. (C) Invasion analyser av SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 og SPC-A1 L-celler (400 × forstørrelse). (D) Migrasjons analyser av SPC-A-1sci, SPC-A1sci H, SPC-A1sci M, SPC-A-1 og SPC-A1L celler (400 × forstørrelse). Tre uavhengige eksperimenter ble utført; Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001
For å utforske de metastatiske potensialer av SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM og SPC-A-1L , ripe sårtilheling (figur 1B) og migrasjon og invasjon ble utført (figur 1C, D). Resultatene viste at de tre monoklonale cellestammer presentert markert forskjellige metastatiske potensialer; SPC-A-1sci H hadde et metastatisk potensiale som ligner på SPC-A-1sci, SPC-A-L hadde et metastatisk potensiale som ligner på SPC-A-1, og SPC-A-1sciM hadde en mellomliggende metastatisk potensial.
bioinformatiske analyser av Monoklonale Cell Stammer med høy, middels og lav metastatisk Potentials
Først identifiserte vi gener forskjellig uttrykt av minst todelt i SPC-A-1sciH, SPC-A-1sciM celler henholdsvis sammen til SPC-A-1L celler. Vi fant at totalt 4534 gener ble uttrykt forskjellig som krysset av SPC-A-1sciH vs. SPC-A-1L og SPC-A-1sciM vs. SPC-A-1L. Av disse genene, ble 2277 gener oppregulert, og 2257 gener ble nedregulert.
For mer presist identifisere viktige gener relatert til lungekreft metastaser, ble bioinformatiske analyse anvendt for å analysere de funksjonelle og sti forskjeller mellom SPC-A- 1sciM vs SPC-A-1L og SPC-A-1sciH vs henholdsvis SPC-A-1L, (figurer S1, S2). Resultatene presenteres i Go-kartet avslørte interaksjoner og henvisninger til de vesentlige funksjonene til de forskjellig uttrykte gener. Med en terskel
P
-verdi 0,0001, fra den funksjonelle analysen av oppregulert differensielt uttrykte gener, fant vi at betydelige funksjoner ble hovedsakelig knyttet hemidesmosome montering, positiv regulering av erytrocytt differensiering, vesikkel organisasjon, synaptogenesis, microtubuli og cytoskjelettet organisering og regulering, cellesyklus arrest og regulering, celle adhesjon og endocytose, transkripsjon DNA, inaktivering av MAPK aktivitet, protein aminosyre defosforylering og intracellulær protein transport. Cellular spredning, differensiering og apoptose ble også påvirket, ledsaget av tilsvarende immunrespons og betennelser funksjoner. Samtidig er de fleste av de ned-regulert differensielt uttrykte gener hadde funksjoner i celleformering inkludert: DNA-replikasjon og regulering i løpet av mitose, spindel organisasjon, sentrosomen duplisering og cellesyklus kontrollpunkt, nukleotid og negativ regulering av epitelcelleproliferasjon så vel som svar på DNA-skade stimulans gjennom DNA-reparasjon og rekombinasjon, kromatin montering eller demontering, karbohydrater, lipider og aminosyre metabolisme og andre.
Fra pathway analyse og bane-Net, kom vi til den konklusjon at opp -regulated gener hovedsakelig delta i MAPK signalveien, Wnt signalveien, JAK-STAT signalveien, TGF-beta signalveien, og celle adhesjon. Identifiserte gener påvirker også evnen til cellen for å endre sin cytoskjelett og polaritet og er involvert i forekomsten, migrasjon og metabolisme av tumorer. I mellomtiden, nedregulert gener hovedsakelig deltatt i mismatch reparasjon og homolog rekombinasjon eller var assosiert med PPAR, TGF-beta, og p53 signalveier, ECM-reseptor interaksjoner og mange metabolske veier (terskel
P
-verdi . 0,001) (figur S3, S4)
i henhold til den betydelige reaksjonsveier er identifisert ovenfor og interaksjonene mellom de differensielt uttrykte gener som er involvert i banene (i henhold til KEGG databasen), en signal-strømningsmodell var bygget. En kvantitativ regulering nettverk, er det beregnet av et nettverk ved hjelp av signal intensiteter av forskjellig uttrykt gener. Bestemmes ut fra vektforskjellen mellom 2 genene og de gener som hvert gen er forbundet med, status for SPP1, LAMB3, MAPK1 og juni som viktige regulatorer ble vist (figur 2). Uttrykket nivåer av osteopontin, LAMB3, og ITGB1 ble målt ved QRT-PCR, og resultatene var overensstemmende med genekspresjonsprofiler. Uttrykket nivåer av osteopontin, LAMB3 og ITGB1 var høyere i de SPC-A-1sci H og SPC-A-1sci M cellelinjer enn i SPC-A-1 L-cellelinje (figur S5).
Signal-strømningsmodell av differensial genekspresjon forening. Den prikk representerer genet og retningen av linjen representerer retningen av reguleringen. Tallet på linjen er regulering vekt: jo større vekt, jo tykkere linje og sterkere regulatoriske evne. Pilen målet formen på linjen representerer aktivering regulering.
SPC-A-1sci celler transfektert med siRNA mot osteopontin, LAMB3, og ITGB1 Vis lav migrasjon og invasjon In Vitro
for å utforske rollene til osteopontin, LAMB3 og ITGB1 i metastasering av lungekreft, transfektert vi SPC-A-1sci celler med siRNA-osteopontin, siRNA-LAMB3 eller siRNA-ITGB1 og utførte migrasjon og invasjon analyser. RT-PCR og Western blot analyse viste effektiv knock-down av osteopontin, LAMB3, og ITGB1 i SPC-A-1sci celler (figur 3A, B). SPC-A-1sci celler transfektert med enten siRNA-osteopontin, siRNA-LAMB3 eller siRNA-ITGB1 vises betydelig lavere migrasjon og invasjon evner sammenlignet med foreldrenes cellelinje SPC-A-en sci (figur 3C, D). Deretter ble osteopontin mRNA og protein uttrykk nivåer målt i SPC-A-1sci som transfektert med siRNA mot LAMB3 og ITGB1 viste resultatene knock-down av LAMB3 og ITGB1 uttrykk nivåer hadde ingen innflytelse på OPN protein uttrykk. LAMB3 og ITGB1 hadde de samme resultatene (Tall S6a, B). For å bestemme forholdet mellom osteopontin, LAMB3 og ITGB1, transfektert vi SPC-A-1sci celler med siRNA-osteopontin + siRNA-LAMB3, siRNA-osteopontin + siRNA-ITGB1, siRNA-ITGB1 + siRNA-LAMB3 og siRNA-osteopontin + siRNA-LAMB3 + siRNA-ITGB1, migrasjonen og invasjon evnen som disse cellene ko-transfektert med to eller flere siRNA ble signifikant redusert sammenlignet med invasjon og migrering evne av cellene ko-transfektert med en siRNA ((fig S6 C, D, E). resultatene indikerer en trans-regulering rolle osteopontin, LAMB3 og ITGB1 i lungekreft metastaser.
(A) RT-PCR ble utført og viste effektivt knock-down uttrykks mediert av siRNA-osteopontin, siRNA-LAMB3 og siRNA-ITGB1. (B) Western blot viste redusert uttrykk av osteopontin, LAMB3 og ITGB1. (C og D) Migrasjon og invasjon analyser av SPC-A-1sci, SPC-A1sci /siRNA-osteopontin, SPC-A-1sci /. siRNA-LAMB3 og SPC-A1sci /siRNA-ITGB1 (400 x forstørrelse) Tre uavhengige eksperimenter ble utført; resultatene er uttrykt som gjennomsnitt + SD; * P 0,05, ** P 0,01, *** P. 0,001
Knock-down av osteopontin, LAMB3, og ITGB1 I SPC-A-1sci Cells ført til lav metastatisk potensial i vivo
for ytterligere å avsløre om osteopontin, LAMB3 og ITGB1 er involvert i metastasering av lungekreft in vivo, 4-6 uker gamle kvinnelige nakne mus ble randomnly delt inn i 4 grupper og fikk halevenen injeksjon av 2 × 10
6 SPC-A-1sci celler transfektert med shRNA-negativ kontroll, shRNA-osteopontin, shRNA-LAMB3 eller shRNA-ITGB1. Ti uker senere, lungene ble samlet for immunhistokjemisk analyse (figur 4)
Representative histologiske bilder av mus lungene inspisert for tilstedeværelsen av mikroskopiske lesjoner (20 ×, øvre, 400 ×, lavere). Ti uker etter Tail vein injeksjoner med SPC-A-1sci-celler som stabilt uttrykker shRNAs mot negativ kontroll (shRNA-NC, venstre 1), osteopontin (shRNA-osteopontin, venstre 2), laminin β3 (shRNA-LAMB3, rett 2), og inte β1 ( shRNA-ITGB1, rett 1).
Vi har også regnet ut mus med lungekreft metastaser og metastatisk noder i hver gruppe. Som vist i tabell 1, ble noen få lungemetastaser nodal detektert i mus injisert med SPC-A-1sci celler transfektert med shRNA-osteopontin, shRNA-LAMB3 eller shRNA-ITGB1. I motsetning til dette, lungemetastaser var tydelige i mus injisert med negative kontrollceller. Derfor er det tydelig at osteopontin, LAMB3 og ITGB1 spiller viktige roller i metastatisk prosessen med lungekreft cellelinje SPC-A-1sci.
osteopontin LAMB3 og ITGB1 uttrykk nivåer i Lung Cancer Are assosiert med avanserte kliniske Stage, Histologisk Grade, og lymfeknutemetastase
for å validere effekten av osteopontin, LAMB3 og ITGB1 uttrykk i lungekreft, vi sammenlignet sine uttrykk nivåer i humane lungekreft vev (n = 135) og matchet tilstøtende normalt vev ved immunhistokjemisk (IHC) farging.
