Abstract
Formål
For å belyse hvilken rolle biologiske og kliniske betydningen av avvikende promoter hypermethylation (PH) i eggstokkreft (OC).
Experimental design
PH
PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1, FKBP4 Hotell og
VGF
ble vurdert ved kvantitativ metylering spesifikk PCR (QMSP) i et treningssett. Vi valgte to gener (
VGF Hotell og
PGP9.5
) for videre QMSP analyse i et større uavhengig validering (IV) satt med tilgjengelige kliniske data. Biologisk relevansen av
VGF
genet ble også vurdert.
Resultater
PH frekvens for
PGP9.5 Hotell og
VGF
var 85 % (316/372) og henholdsvis 43% (158/366) i IV sett av prøver mens ingen PH ble observert i kontroller. I 372 OC tilfeller med tilgjengelige oppfølging,
PGP9.5 Hotell og
VGF
PH var korrelert med bedre pasientens overlevelse [Hazard ratio (HR) for total overlevelse (OS) var 0,59 (95% konfidensintervall (KI) = 0,42 til 0,84, p = 0,004), og 0,73 (95% KI = henholdsvis 0,55 til 0,97, p = 0,028), og for sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) var 0,57 (95% KI 0,39 til 0,82, p = 0,003) og 0,72 (95% KI 0,54 til 0,96, p = 0,027). I multivariat analyse,
VGF
PH forble en uavhengig prognostisk faktor for OS (HR 0,61, 95% KI 0,43 til 0,86, p 0,005) og DSS (HR 0,58, 95% KI 0,41 til 0,83, p 0,003 ). Videre
PGP9.5
PH var signifikant korrelert med lavere grad, tidlig stadium svulster, og med fravær av restsykdom. Tvunget uttrykk for
VGF
i OC cellelinjer hemmet cellevekst.
Konklusjoner
Våre resultater tyder på at
VGF Hotell og
PGP9.5
PH er potensielle biomarkører for ovarialcancer. Bekreftende kohorter med longitudinell oppfølging er nødvendig i fremtidige studier for å definere den kliniske effekten av
VGF Hotell og
PGP9.5
PH før klinisk anvendelse
Citation. Brait M , Maldonado L, Noordhuis M, Begum S, Loyo M, Poeta ML, et al. (2013) Association of Arrangøren metylering av
VGF Hotell og
PGP9.5
med eggstokkreft Progresjon. PLoS ONE 8 (9): e70878. doi: 10,1371 /journal.pone.0070878
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 18 januar 2013; Godkjent: 24 juni 2013; Publisert: 27.09.2013
Copyright: © 2013 Brait et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Karriereutvikling prisen til Dr. Hoque fra Specialized Program for fremragende forskning stipend P50 CA098252 (PI: TC Wu). Dr. Hoque og Dr. Begum støttes av en ung Clinical Scientist Award fra Flight Attendant Medical Research Institute. Dr. Marchionni er støttet av National Institutes of Health-National Cancer Institute stipend P30CA006973. M.G. Noordhuis er en mottaker av tilskudd fra den nederlandske Cancer Society og Jo Kolk studiefonds. Virkemiddelapparatet hadde ingen rolle i utformingen av studien, datainnsamling, analyse, tolkning av resultatene, utarbeidelse av manuskriptet, eller beslutningen om å sende inn manuskript for publisering
Konkurrerende interesser. Vi har følgende interesser. Under en lisensavtale mellom Oncomethylome Sciences, SA (nå MDxHealth) og Johns Hopkins University, er D.S. rett til en andel av royalty mottatt av universitetet på salg av diagnostiske produkter som er beskrevet i denne artikkelen. D.S. eier Oncomethylome Sciences, SA lager, (nå MDxHealth) som er underlagt visse restriksjoner under Universitetet politikk. D.S. er en betalt konsulent for Oncomethylome Sciences, SA (nå MDxHealth) og er en betalt medlem av selskapets Scientific Advisory Board. A. van der Zee var en betalt konsulent for MDxHealth (Tidligere Oncomethylome Sciences SA). Forfatter MOH er en PLoS ONE Editorial styremedlem. Det er en patentsøknad som inneholder noen av de data som skal publiseres her i denne artikkelen: WO201 /099489, EP2401408A2 – Eggstokkreft Methylome. Det er ingen ytterligere patenter, produkter under utvikling eller markedsført produkter å erklære. Dette endrer ikke vår tilslutning til alle de PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Eggstokkreft (OC) er den nest vanligste gynekologisk kreft og den ledende dødsårsaken blant gynekologisk kreft på verdensbasis [1]. 22,240 nye tilfeller ble anslått for 2013 i USA, som fører til 14,030 dødsfall fra denne krefttypen [2]. Median alder for pasienter med OC er 60 år, og gjennomsnittlig levetid risiko for å utvikle OC hos kvinner er ca 1 i 70 [3]. Sytti prosent av pasienter med OC har avansert sykdom (stadium III eller IV) ved diagnosetidspunktet, med en 5-års overlevelse på 15 til 20% til tross for aggressiv behandling [4], i forhold til de tidlige stadium pasienter med overlevelse mer enn 90% [3]. OC er vanligvis behandlet med platinabasert kjemoterapi og ofte går igjen på grunn av ervervet platina motstand. Den første kliniske responsen på platinabaserte legemidler er veldig avgjørende for utfallet for pasienter med OC. Pasienter med tumorer som demonstrerer in vitro ekstrem resistens til platina ble funnet å være en betydelig øket risiko for progresjon og død når de behandles med standard-platinabaserte regimer [5]. Det er derfor av stor betydning for å identifisere nyttige prediktive markører som indikerer platina følsomhet. Disse kan gi bedre behandling valg for en
st linjen av behandling, muligens gir bedre resultat for platina resistente pasienter. Bestemmelse av egnede markører for å forutse responsen på standard kjemoterapeutiske eller nyere biologiske midler vil muliggjøre bedre kontroll og herdehastigheter for OC, så vel som valg av adjuvant terapi eller identifikasjon av pasienter som egner seg for spesifikke kliniske forsøk. Videre er evnen til å forutsi OC utfall etter kirurgisk reseksjon kritisk for klinikere, som det ville påvirke bruken av adjuvant kjemoterapi og strålingsterapi. En uavhengig prognostisk indikator på OC overlevelse vil derfor være uvurderlig for leger og pasienter i valg av behandlingsalternativene.
Det er kjent at genetiske (endringer i DNA-sekvensen som slettinger, presiseringer og mutasjoner) og epigenetiske endringer (definert som arvelige endringer i genekspresjon som oppstår uten endringer i DNA-sekvensen) bidrar til utvikling og progresjon av tumorceller [6]. De vanligste epigenetiske hendelser omfatter DNA metylering og histon acetylering [7], blir DNA metylering muligens den mest studerte aspekter av epigenetikk med hensyn til kreftutvikling, og hovedfokus for farmakologiske intervensjoner i kliniske studier. Det refererer til tilsetningen av en metylgruppe i 5-karbon stilling av cytosin ringen for å danne 5-metylcytosin (5mC), men bare på cytosines som foran en guanosin i DNA-sekvensen, kjent som CpG-dinukleotid [8]. Det er CpG-rike regioner som er kjent som CpG-øyer som vanligvis strekker seg over 5’end region (promoter, ikke-translatert område og ekson 1) av mange gener med tumor suppressor aktivitet og er vanligvis unmethylated i normale celler [9]. Det humane genom i denne normale celler ikke er metylert jevnt, inneholdende unmethylated segmenter avbrutt av denaturert regioner [10], mens kreftceller metylering mønstre er endret, omgår global DNA hypometylering [11], så vel som hypermethylation av visse CpG øyer [8] . Avvikende CpG øy hypermethylation (særlig i tumorsuppressorgener «promotor), så vel som histon-modifisering fører til inaktivering og transkripsjonelle genet Slå, er et vanlig fenomen i humane kreftceller, og sannsynligvis en av de tidligste begivenheter i karsinogenese [7]. Spesielt promoter hypermethylation (PH) er en hyppig mekanisme for inaktivering av tumorsuppressorgener (TSGs) [7], [8] og pH av visse kreftrelaterte gener ble funnet å være assosiert med terapeutisk respons og utfallet av sykdommen [12 ], [13].
i denne studien analyserte vi PH av 13 gener
(PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1
,
VGF, FKBP4)
av kvantitativ fluorogent sanntid metylering spesifikk PCR (QMSP) i et treningssett og endelig testet to gener (
VGF Hotell og
PGP9.5
) i en uavhengig validering satt til å vurdere om det er noen sammenslutning av PH av disse to gener med noen kliniske faktorer, inklusive samlede utfallet av pasienten. Videre studerte vi den funksjonelle rollen VGF som en anti-tumorigen molekylet i OC avledet cellelinjer.
Materialer og metoder
Study kohorten
Training Set.
for å kunne komponere det første settet av prøver hentet vi prøver på ovarial tumor vev fra vår vev arkiv, samlet inn fra 33 pasienter med epitelial OC som gjennomgikk terapeutisk kirurgi ved The Johns Hopkins University School of Medicine. Vi fikk også prøver fra 24 pasienter med OC som gjennomgikk kirurgi ved University Campus Bio-Medico, Roma Italia. For å bli inkludert i kohorten, en kvalifisert pasient måtte ha en bekreftet diagnose av OC og en tilstrekkelig mengde av arkivert svulst materiale for DNA-ekstraksjon. Prøvene ble bevart i parafin, og et sett av bakker (10 pm tykkelse) ble tatt fra hver blokk. Den demografiske og kliniske opplysninger ble innhentet fra datastyrte svulst registret på The Johns Hopkins Healthcare System eller fra registeret ved Institutt for obstetrikk og gynekologi ved Universitetet Campus Bio-Medico i Roma, Italia. Svulstene ble klassifisert i henhold til FIGO staging system [14]. Fra Johns Hopkins pasienter (33), 16 pasienter presentert med tidlig fase sykdom (15 fase I og en scene II) og 17 med langt fremskreden sykdom (14 stadium III og 3-trinns IV). Alle prøvene var epitelial eggstokkreft karsinom med en serøs-papillær histologi. Fra 24 pasienter fra Italia, 10 hadde tidlig stadium sykdom (6 med stadium I, og 4 med stadium II), 13 hadde avansert sykdom (12 med fase III, og en med stadium IV) og en hadde ukjent scenen. Atten pasientene hadde epitelial eggstokkreft karsinom (serøs, endometrioid, mucinous, plateepitel, udifferensiert), ett med bakterie celle tumor, fire presenteres med sekundær (metastatisk) svulster, og en pasient hadde ukjent histologi. Den normale eggstokkepitelet vev ble oppnådd fra 13 pasienter som gjennomgikk profylaktisk kirurgi for noen godartet tilstand Hospital San Jose Tec de Monterrey i Mexico. En detaljert oversikt over treningssettet av pasienter er tilgjengelig i tabell 1 (A).
Uavhengig Validation (IV) Set.
Vi har analysert en uavhengig validering sett for de mest lovende gener. Dette uavhengig sett besto av 372 ovarietumorer, 17 borderline tumorer og 18 på eggstokkene cystadenomas (alle bevart som Dypfryst prøver). Disse pasientene ble operert ved University Medical Center Groningen, Groningen (UMCG), Nederland. Den demografiske og kliniske opplysninger ble hentet fra registeret ved Institutt for gynekologisk onkologi, UMCG, Nederland. En detaljert oversikt over de demografiske og clinicopathological parametrene av disse prøvene er vist i tabell 1 (B).
Godkjenning for forskning som omfatter mennesker ble hentet fra The Johns Hopkins-universitetet institusjonelle gjennomgang boards. Denne studien kvalifisert for unntak i henhold til det amerikanske Department of Health and Human Services politikk for beskyttelse av mennesker [45 CFR 46,101 (b)]. IRB retningslinjene ble fulgt ved hver av institusjonene. Alle menneskelige materialer som brukes i studien fra Institutt for obstetrikk og gynekologi ved Universitetet Campus Bio-Medico i Roma, Italia, ble samlet i henhold til retningslinjene i kommune Etisk komité Campus Bio-Medico av Roma. Retningslinjene for etikkomiteen Local, som er i standard kompatibel med den italienske Protection datamyndighetene bestemmer at prøver innsamlet retrospektivt fra Avdeling for patologi (formalinfiksert, parafininnebygd vev) trenger ikke å ha noen godkjenning og er fritatt fra å skaffe skriftlig informert samtykke. Ifølge italienske databeskyttelse Tilsynets regler (https://www.garanteprivacy.it/web/guest/home_en~~number=plural doc web n 1884019), er italienske Institusjoner misligholdt autorisert til å bruke prøvene og de tilsvarende kliniske data inkludert i studien. Alle prøver samlet inn fra Hospital San Jose Tec de Monterrey, Monterrey, Mexico ble samlet inn etter de etiske komiteens regler. Ifølge retningslinjene fra meksikansk lov for helseforskning (Reglamento de la Ley General de Salud en Materia de INVESTIGACION para la Salud, artikkel 23
rd, 2
nd tittel, en
Kapittel st: retrospektive studier anses som ikke-risikostudier og derfor ikke krever et skriftlig informert samtykke fra deltakerne eller Etisk Komité godkjenning. prøver fra Mexico var fra arkiverte prøver (formalinfiksert, parafininnebygd vev) og ble hentet fra sykehusenes patologi arkiv . for pasientene hentet fra UMCG i Nederland, pasienter ga informert samtykke til innsamling og lagring av vevsprøver i en vev bank for fremtidig forskning. Alle relevante pasientdata ble hentet ut og overført til en anonym, passordbeskyttet, database. den . pasientenes identitet ble beskyttet av studiespesifikke, unike pasientkoder og deres sanne identitet ble bare kjent for to dedikerte data ledere Ifølge nederlandske forskrifter, disse forholdsreglene medførte ikke lenger Institutional Review board godkjenning var nødvendig (http: //www.federa .org /). Alle pasientenes data ble avidentifisert for forskerne i alle 4 institusjoner.
Gene Utvalg
I denne studien har vi valgt totalt 13 gener til å analysere sin metylering status (ved hjelp QMSP ) av en kandidat genet tilnærming. Gener ble valgt på grunnlag av deres spesifikke kreft metylering i OC og /eller andre faste krefttyper. Genene utvalgte var:
PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
MGMT
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1, VGF Hotell og
FKBP4
. En detaljert oversikt over informasjon om disse genene er tilgjengelig i tabell S1 i File S1.
Basert på endringer i ovennevnte gener i kreft (nærmere omtalt i diskusjonen delen), vi analysert alle disse 13 genene i en opplæring sett av prøver og valgte to gener (
VGF Hotell og
PGP9.5
) for videre analyse av et stort godt kommenterte uavhengig sett av prøver. Utvalgskriteriene av genene som skal testes i den uavhengige valideringssettet var: a) Metylering frekvens i tumorprøver i treningssettet; b) Metylering frekvens i normale prøver; C) Novelty av genet for OC; D) Kjent funksjoner av hvert gen av litteratur /PubMed søk.
DNA-ekstraksjon
Etter første pasient de-identifikasjon, alle originale OC histologiske lysbilder ble anmeldt for å bekrefte diagnosen av en senior patolog. En representant blokken ble hentet for DNA-ekstraksjon. Histologiske lysbilder fra formalinfiksert, parafininnebygd vev ble tatt. Objektglassene ble microdissected for å oppnå 70% neoplastiske celler. Den microdissected normal eggløsnings epitel ble isolert fra ovarievev resected under en operasjon, noe som bekrefter etterpå fravær av enhver ondartet og /eller pre-maligne prosess i vevet. DNA ble ekstrahert ved bruk av fenol-ekstraksjon choloroform protokoll etterfulgt av etanolutfelling, som tidligere beskrevet [15]. For UMCG prøvene, ble DNA isolert ved hjelp av standard salt-kloroformekstraksjon og isopropanol utfelling. Utfelt DNA ble resuspendert i Tris-EDTA-buffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Genomisk DNA ble forsterket i en multipleks PCR i henhold til BIOMED-to-protokollen, for å sjekke DNA kvalitet [16].
Sodium Bisulfite Behandling
DNA ekstrahert fra primære svulster og normal eggstokkepitelet var kastet natriumbisulfitt behandling, som omformer unmethylated cytosinrestene til uracil residuer, som tidligere beskrevet [17]. For dette ble EpiTect Bisulfite kit (Cat No. 59104, QIAGEN Inc., Valencia, CA) som brukes i henhold til produsentens instruksjoner. For UMCG prøvene ble sulfitt behandling utført med EZ DNA metylering kit i henhold til produsentens protokoll (zymogen, BaseClear, Leiden, Nederland). Etter behandling, ble DNA lagret ved -80 ° C inntil den ble brukt.
Metylering Analyse
Bisulfite-behandlede DNA ble anvendt som et templat for fluorescens-baserte real-time PCR, som beskrevet tidligere [ ,,,0],17]. Amplifiseringsreaksjoner ble utført i triplikat i et sluttvolum på 20 ul som inneholdt 3 mL av bisulfitt-modifisert DNA; 600 nM konsentrasjoner av forover og revers primere; 200 nM sonde; 0,6 U av platina Taq polymerase (Invitrogen, Frederick, MD); 200 pM konsentrasjoner av hver av dATP, dCTP, dGTP og dTTP; og 6,7 mM MgCl
2. Primere og prober ble laget spesielt forsterke arrangører av de 13 gener av interesse og formidler av en referanse genet,
ACTB
; primer og probe sekvenser og annealing temperaturer er gitt i tabell S2 i File S1. Amplifikasjoner ble utført ved anvendelse av følgende profil: 95 ° C i 3 minutter, etterfulgt av 50 sykluser ved 95 ° C i 15 sekunder og 60 ° C i 1 minutt. Amplifiseringsreaksjoner ble utført i 384-brønns plater i en 7900HT sekvensdetektoren (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Beverly, MA) og ble analysert ved hjelp av en sekvens detektorsystem (SDS 2,4; Applied Biosystems). Hver plate inkludert pasient DNA-prøver, positive (
in vitro
metylert leukocytter DNA) og negative (normal leukocytter DNA eller DNA fra en kjent unmethylated cellelinje) kontroller, og flere vann mellomrom. Leukocytt DNA fra en frisk person ble metylert
in vitro
med overflødig SSSI metyltransferase (New England Biolabs Inc., Beverly, MA) for å generere helt denaturert DNA, og seriefortynninger (90 til 0,009 ng) av dette DNA var brukes til å konstruere en kalibreringskurve for hver plate. Alle prøvene var innenfor analysens utvalg av sensitivitet og reproduserbarhet basert på forsterkning av intern referansestandard (terskel syklus [CT] verdi for
ACTB
av 40). Det relative nivå av metylert DNA for hvert gen i hver prøve ble bestemt som et forhold mellom metylering spesifikk PCR-amplifikert gen i
ACTB product: (referanse-genet) og deretter multiplisert med 1000 for lettere tabulering (middelverdi av tre paralleller av gen av interesse delt på [gjennomsnittlige verdien av tre paralleller av
ACTB
] × 1000). Prøvene ble kategorisert som unmethylated eller metylert basert på følsomheten til analysen.
VGF
, bisulfitt sekvensanalyse ble også utført for å bekrefte den metylering status i cellelinjer avledet fra eggstokk-kreft (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP, 2008 og 2008 C13) og fra normal eggstokk overflaten epitel (OSE) cellelinjer (OSE2A, OSE2B og OSE7). Bisulfitt behandlede DNA ble amplifisert for 5′-regionen som er inkludert i det minste et parti av CpG øya i løpet av 1 kb av det foreslåtte transkripsjonsstartsetet (TSS), som vurderer det samme område som de QMSP primere og probe. Primerne ble utformet for ikke å inneholde CpG områder, og vurderer den behandlede bisulfitt-sekvensen, for å forsterke området uavhengig av metylering status, tillater oss å observere det uten en reaksjon skjevhet. Den primere sekvens var: Videre 5′-TTTGTTTTTGTTAGGGGGTTGTT-3 «og 5′- Omvendt AACACCAATAAAAACTAATACTA-3». PCR-produktene ble renset på gel ved hjelp av QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA) ifølge produsentens instruksjoner. Hver forsterket DNA-prøve ble sekvensert av Applied Biosystems 3700 DNA analyser ved hjelp av forover eller bakover primere og BD terminator fargestoff (Applied Biosystems, Foster City, CA). Tre uavhengige reaksjoner ble kjørt for å bekrefte de observerte data.
Statistical Analysis
Statistisk analyse ble utført med IBM SPSS statistikk 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). For hvert gen en metylering terskel (cut-off) over den høyeste verdien i kontrollgruppen ble brukt til å oppnå 100% spesifisitet i treningssettet og de samme cut-off verdiene ble søkt om
VGF Hotell og
PGP9.5
i uavhengig validering sett, analyse ble også utført med en cutoff i 75
th persentil av metylering verdier. Forskjeller i metylering forhold mellom normale og kreft ble vurdert av Fishers eksakte test. Videre hypermethylation for hvert gen ble også sammenlignet mellom kreft og normalt ved Mann-Whitney U-test. Korrelasjoner av metylering nivåer av gener ble vurdert med Spearman korrelasjonskoeffisienter. Sammenhengen mellom hypermethylation og klinisk-patologiske egenskaper ble vurdert ved logistisk regresjon, chi-kvadrat og Fishers eksakte tester, som passer. Total overlevelse (OS) ble definert som tiden fra diagnose til død av enhver årsak eller siste oppfølging besøk i live. Sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) ble definert som tidsrommet fra diagnose til død som følge av OC. Forskjeller i OS og DSS ifølge clinicopathological egenskaper og metylering av gener ble analysert ved hjelp av Cox regresjonsanalyse. Alle vesentlige variabler med en
P-verdi
0,05 i univariat analyse ble inkludert i multivariat analyse.
P verdi
s av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Alle
P-verdier
er tosidig.
5-aza-2′-deoxycytidine behandling av celler og revers transkripsjon-PCR og real-time revers transkripsjon-PCR
Vi seeded (tetthet: 1 x 10
6) seks eggstokkreft cellelinjer (IGROV, IGROV CP, A2780, A2780 CP, 2008 og 2008 C13) linjer i sine respektive kulturmediet og holdt dem i 24 timer før behandling av dem med 5 uM 5-aza-2′-deoksycytidin (5-aza-dC; Sigma) i 5 til 7 dager. Vi har fornyet medium inneholdende 5-aza-dC hver 24. time i løpet av behandlingen. Vi behandlet kontrollceller (uekte behandlet) på samme måte, uten tilsetning av 5-aza-dC. Vi behandlet også 5-aza-DC i kombinasjon med trichostatin A (TSA, Sigma, St. Louis, MO), en histon deacecetylase inhibitor, og TSA alene. Stamløsninger av 5-aza-dC ble oppløst i fosfatbuffer saltvann PBS (pH 7,5). Vi forberedte total RNA ved hjelp Qiazol (Qiagen Inc. Valencia, CA), etter produsentens anvisninger.
Revers transkripsjon-PCR (RT-PCR)
cDNA syntetisert ved hjelp Hevet III (Invitrogen, Rednings Technologies, Carlsbad, CA), med en første mengde av 1 ug av RNA, etter at den standard-protokoll. RT-PCR ble utført som beskrevet tidligere [18]. En mikroliter av hver cDNA ble anvendt for sanntids RT-PCR ved anvendelse av spesifikke primere og Taqman probe for genet av interesse. Amplifikasjoner ble utført i 384-brønns plater i en 7900HT Sequence Detector System (Applied Biosystems, Foster City, CA). Uttrykket av gener i forhold til glyseraldehyd-3-fosfat dehydrogenase (GAPDH) ble beregnet basert på terskelen syklus (Ct) som 2
-Δ (ΔCt), hvor A C
t = C
t, gen- C
t, GAPDH og Δ (A C
t) = A C
t, aZA-A C
t, M (M, mock behandling, aza, 5-aza-dC behandling) [19] .
Colony fokus analysen
Vi sammenlignet metylering profil og uttrykk for
VGF
i 3 normale eggstokkene overflaten epitel (OSE) cellelinjer (OSE2A, OSE2B og OSE7) og 3 par isogene OC cellelinjer (A2780 og A2780CP 2008 og 2008C13, og IGROV og IGROV CP) forskjellige i forhold til cisplatin følsomhet. Vi deretter utført fokus dannelse analyse for VGF bruke to cellelinjer (2008 og 2008C13) som var denaturert og ikke uttrykk for
VGF.
OC cellelinjer 2008 og 2008C13 ble sådd i 10 cm retter og transfektert med VGF uttrykk vektor (pCMV6-AC-VGF-GFP) og tom vektor (pCMV6-AC-GFP) (Origene, Rockville, MD). Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene delt inn i flere retter. Fra neste dag ble cellene dyrket i 2 uker i medium inneholdende 400 ug /ml og 30 ug /ml G418 (Cellgro, Manassas, VA) for henholdsvis 2008 og 2008C13. Etter 2 uker ble cellene vasket to ganger med PBS, fiksert med 25% eddiksyre og 75% metanol ved romtemperatur i 10 minutter og deretter beiset med 0,1% krystallfiolett. Kolonier ble tellet, og antallet kolonier pr fatet var i gjennomsnitt fra tre uavhengige eksperimenter (kolonier 2 mm i diameter ble betraktet som positive). For å bekrefte uttrykk for VGF, ble cellene høstet 48 timer etter transfeksjon og western blot analyse ble utført, utnytte VGF antistoff (Santa Cruz, California), normalisert ved p-aktin nivåer (antistoff fra Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).
Resultater
Generelt metylering frekvens på OC Prøver og Normale Eggstokk Prøver (Training Set)
Tretten gener (
PGP9.5
,
HIC1
,
AIM1
,
APC
,
PAK3
,
KIF1A
,
CCNA1
,
ESR1
,
SSBP2, GSTP1
,
MGMT, VGF Hotell og
FKBP4
) ble analysert for PH hjelp QMSP i to ulike sett av prøver. De observerte metylering frekvenser for hvert gen for treningssettet er oppsummert i tabell 2A. Kort, i treningssett (total), var de hyppigst denaturert gener var:
PGP9.5
,
HIC1
,
ESR1 og VGF
. Den observerte hyppigheten av metylering i dette settet var 19% (11/57) for
ESR1
, 67% (38/57) for
HIC1
, 28% (16/57) for
PGP9.5 Hotell og 37% (21/57) for
VGF
. Hver av de sistnevnte 4-genene var signifikant mer metylert i OC enn normalt (p = 0,05 for hvert gen). Kombinere alle 4 gener analysert i treningssettet, observerer vi metylering i minst ett av de 4 genene i 81% (46/57) av OC prøvene, med en spesifisitet på 100%.
dette settet av tumorprøver ble analysert for genet forhåndsutvelgelse formål. For å maksimere spesifisitet, ble en empirisk cut-off-verdi som er bestemt over den høyeste verdien i kontrollgruppen for hvert gen. Cut-off verdien av hvert gen er vist i tabell 2A.
Association mellom DNA-metylering endringer og clinicopathological faktorer i opplæringen satt
Vi sammenlignet metylering status av to gener (
PGP9.5 Hotell og
VGF
) i 57 OC prøver av treningen satt til demografiske og clinicopathological parametere som alder, stadium, histologisk type klasse, røyking og alkoholforbruk historie av pasientene, ved logis regresjonsanalyse.
VGF
metylering var hyppigere til stede i tidligere trinn (trinn I og II) av OC i forhold til slutten av trinn (trinn III og IV) av tumorer [14/26 (54%) versus 6/30 (20 %) denaturert] (Odds ratio, OR = 0,21, 95C.I. [0,07 til 0,7],
p
verdi = 0,011). Korrelasjoner med alle andre clinicopathologic parametere var ikke signifikant med metylering av noen av de andre gener (tabell 3A).
Metylering hyppigheten av
VGF Hotell og
PGP9.5
i uavhengig validering (IV) sett av prøver og clinicopathological korrelasjons
Basert på tilgjengeligheten av prøver og nyheten av gener for OC og metylering frekvenser i treningssettet, vi valgte 2 gener (
VGF
og
PGP9.5
) for å teste i en uavhengig kohort av prøver som består av 372 karsinom, 18 borderline tumorer og 17 cystadenomas. Begge
VGF Hotell og
PGP9.5
metylering viste en kreft bestemt mønster, med 43% og 85% frekvens henholdsvis i tumorer, mens 0% i normaler, som tidligere nevnt (tabell 2B) ( Figur 1). Interessant høy metylering frekvens ble observert for begge gener i borderline tumorer og cystadenoma (tabell 2B) (figur 1).
Beregning av
PGP9.5
eller
VGF
genet til
p-aktin
forholdstall var basert på fluorescensemisjonen intensitetsverdiene for begge gener oppnådd ved kvantitativ metylering-spesifikke real-time PCR-analyse. De oppnådde forhold ble multiplisert med 1000 for enklere tabulation. Nullverdier er angitt i den nederste delen av grafen, viser mengden av prøvene, da de ikke kan plottes på riktig måte på en loggskala. (A)
PGP9.5
metylering verdier i normale prøver (0/13, 0%), cystadenomas (12/17, 71%), borderline tumorer (18/18, 100%) og ovarietumorer ( 316/372, 85%). (B) metylering av
PGP9.5
hele histologiske typer (O.R = 0,24, 95% C.I. [0.14-0.40],
p
. 0,001). (C)
PGP9.5
metylering var signifikant korrelert med lavere grad (O.R = 0,24, 95% CI [0,14 til 0,40],
p
= 0,012). (D)
PGP9.5
metylering var signifikant korrelert med fravær av restsykdom (lavere enn 2 cm) (OR = 0,41, 95% CI [0,24 til 0,68],
p
= 0,001) . (E)
PGP9.5
metylering var signifikant korrelert med tidlig stadium av svulster (OR = 0,26, 95% CI [0,16 til 0,45]
p
. 0,001 (E)
VGF
metylering verdier og frekvenser i normale prøver (0/13, 0%), cystadenomas (5/16, 31%), borderline tumorer (6/18, 33%) og ovarietumorer (158/366, 43 %).
i den uavhengige valideringssett, bruker univariat logistisk regresjonsanalyse, vi sammenlignet metylering status for
VGF Hotell og
PGP9.5
til demografiske og clinicopathological parametere som alder, stadium, histologisk type klasse, og tilstedeværelse av restsykdom etter operasjonen.
PGP9.5
metylering (med cutoff over 75. persentil av metylering ratio) var signifikant korrelert med lavere grad og tidlig stadium av svulster (OR = 0,52, 95% CI [0,31 til 0,86],
p
= 0,012) og (OR = 0,27, 95% CI [0,16 til 0,45],
p
0,001), henholdsvis, så vel som med fravær av restsykdom (OR = 0,41, 95% CI [0,24 til 0,68],
p
= 0,001) og histologisk type (non-serøs) (OR = 0,24, 95% CI [0,14 til 0,40],
p
0,001) (Tabell 3B) (figur 1). Et sammendrag av metylering av
VGF Hotell og
PGP9.5
med clinicopathological korrelasjon i uavhengig validering sett er vist i tabell 3B.
Alle de 372 tilfeller av ovarialcancer av uavhengig validering sett var tilgjengelige for oppfølging analyse. Vi brukte Cox Proporsjonal Hazard modell for å forutsi total overlevelse (OS) og sykdomsspesifikk overlevelse (DSS) av disse 372 pasientene i forbindelse med PH
PGP9.5 Hotell og
VGF
. Median oppfølging for disse pasientene var 30 måneder, alt fra 1 til 234 måneder. I samsvar med tidligere observasjon, av en univariat cox regresjonsanalyse, fant vi korrelasjon av dårlig overlevelse med senere stadium (III /IV) av tumor (Hazard Ratio (HR) 8,22, 95% CI [4,91 til 13,76], p 0,001), og tilstedeværelse av restsykdom (HR 4,73, 95% CI [3,47 til 6,44], p 0,001) (tabell 4). Tabell S1. Tabell S2.
