Abstract
peroksisomproliferatoraktiverende aktivert reseptor gamma (PPARy) er en kjernefysisk reseptor som spiller en vesentlig rolle i celle-proliferasjon, apoptose og inflammasjon. Det er over-uttrykt i mange typer kreft, inkludert tykktarm, mage, bryst og lungekreft, noe som tyder på at regulering av PPARy kan påvirke kreft patogenesen. Her, ved hjelp av en proteomikk tilnærming, identifiserer vi PTB-forbundet spleising faktor (PSF) som en roman PPARy-samspill protein og vise at PSF er involvert i flere viktige regulatoriske trinn av tykktarmskreft celleproliferasjon. For å undersøke sammenhengen mellom PSF og PPARy i tykktarmskreft, vi evaluert effekten av PSF uttrykk i DLD-en og HT-29 tykktarm kreft cellelinjer som uttrykker lave og høye nivåer av PPARy henholdsvis PSF påvirket evnen til PPARy å binde og uttrykk for PSF siRNA undertrykte betydelig spredning av tykktarmskreftceller. Videre PSF knockdown indusert apoptose via aktivering av kaspase-3. Interessant, DLD-1-celler var mer utsatt for PSF knockdown-indusert celledød enn HT-29-celler. Våre data antyder at stiften er en viktig regulator av celledød som spiller kritiske roller i overlevelse og vekst av tykktarmskreftceller. PSF-PPARy akse kan spille en rolle i kontrollen av kolorektal kreftutvikling. Til sammen er den første til å beskrive effekten av PSF på celleproliferasjon, tumorvekst, og cellesignalisering forbundet med PPARy denne studien
Citation. Tsukahara T, Haniu H, Matsuda Y (2013) PTB-Associated spleising Factor (PSF) Er en PPARy-Binding Protein og Vekst Regulator av Colon kreft celler. PLoS ONE 8 (3): e58749. doi: 10,1371 /journal.pone.0058749
Redaktør: Klaus Roemer, Universitetet i Saarland Medical School, Tyskland
mottatt: 04.12.2012; Godkjent: 05.02.2013; Publisert: 13 mars 2013
Copyright: © 2013 Tsukahara et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Grants-i-Aid for Scientific Research (C) 22591482 (til Tamotsu Tsukahara) fra Japan Society for Promotion of Science og Grants-in-Aid fra Takeda Science Foundation (til Tamotsu Tsukahara) og Astellas fundament for forskning på metabolske forstyrrelser (til Tamotsu Tsukahara). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Tykktarmskreft kreft~~POS=HEADCOMP fortsetter å være et stort folkehelseproblem. På verdensbasis er ca 1 million nye tilfeller av tykktarmskreft diagnostisert hvert år, med nesten 500 000 dødsfall som følge av denne sykdommen hvert år [1]. De fleste av disse dødsfall forekommer som en konsekvens av sen diagnose. Selv om tykktarmskreft utvikles i kolon og rektum vev, kan kreftcellene spre seg til andre deler av kroppen, slik som lever, ben, hjerne og lunge, og danner en ny tumor. Fordi metastatisk tykktarmskreft er forbundet med høy dødelighet [2] – [3], er progresjon til metastase det kritiske punktet i tykktarm kreft overlevelse. Foreløpig kjemoterapeutiske midler er de viktigste verktøyene for behandling av tykktarmskreft. Men de fleste av disse stoffene er ikke-spesifikke eller blir mindre effektiv som tumorceller skaffe multimedikamentresistens. Derfor er nye terapeutiske muligheter for å redusere tykktarmskreft dødelighet
PPARy er medlem av atom reseptor super-familien, hvis medlemmer aktivere mål gentranskripsjon i en ligand-avhengig måte [4] -. [5] . Aktivering av PPARy av tiazolidindioner (TZDs) fører til en endret metabolisme i fettvev, skjelettmuskelceller, og leveren som samlet fører til insulin sensibilisering [6]. PPARy uttrykk er økt i mange typer kreft, inkludert tykktarm, lunge, bryst og magekreft, noe som tyder på at regulering av PPARy kan påvirke kreft patogenesen [7], [8]. Selv om PPARy uttrykkes i signifikante nivåer i humane tarmkreftceller og vev [8], er fremdeles kontroversiell rollen av PPARy-aktivering i tykktarmskreft [9]. Videre er rollen til PPARy-aktivering i kreft generelt er fortsatt uklar. En rekke av høy affinitet syntetiske agonister finnes for PPARy, inkludert rosiglitazon og troglitazon. Det er blitt rapportert at disse agonister hemme proliferasjonen av en rekke forskjellige humane kreftceller. Imidlertid er virkningsmekanismen i de fleste tilfeller peker på reseptor-uavhengig effekter [10]. Flere studier beskriver muligheten for en PPARa /γ agonist, TZD18, for å indusere glioblastoma celletoksisitet i en reseptor-uavhengig måte [11]. Denne forbindelsen induserte apoptose gjennom cellesyklus arrest. Den apoptotiske hendelsene ble mediert ved nedregulering av Bcl-2, oppregulering av Bax, og aktiveringen av caspase-3. Disse resultatene tyder på at TZDs kan indusere apoptose uavhengig av PPARy-aktivering, først og fremst ved å aktivere den indre apoptotiske reaksjonsvei.
PTB-assosiert faktor spleising (PSF) er et multifunksjonelt protein som er involvert i transkripsjon regulering, pre-mRNA prosessering, og DNA-reparasjon [12]. En av de mest tallrike kjerneproteiner, den består av en enkelt polypeptidkjede på ca. 76 kDa (bestemt ved natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese [SDS-PAGE]) [13]. Aminoenden er rikt på prolin og glutaminrester. PSF har flere bindende funksjoner. En ny studie viste at PSF hører til en familie av antatte tumor-suppressor-proteiner som inneholder en RNA-bindende domene (RBD) og et DNA-bindende domene (DBD) [14]. DBD binder og undertrykker transkripsjonen av gener som har en PSF-bindingssete [14], [15]. Således er PSF et meget komplekst protein som kan være en viktig komponent i den transkripsjonelle undertrykkelse av mange forskjellige gener som involverer ulike mekanismer. Nylig har Wang et al. rapporterte at stiften har en sentral rolle i den reversible reguleringen av pattedyrcelleformering og tumorigenesis [16]. Endring i uttrykket av PSF og dets bindingspartnere kan ha potensial som en terapeutisk strategi mot kreft [17]. Men hvordan de ulike aktivitetene til PSF er regulert i tykktarm kreft celler er ennå ikke klart. Vi antok at PSF samhandler med PPARy. Derfor er målet med denne studien var å var å skaffe bevis for en direkte interaksjon mellom PSF og PPARy i kolon kreftutvikling. Våre resultater viste at PPARy samhandler direkte med PSF. For å undersøke de PPARy-avhengige virkninger av PSF, vi også sammenlignet HT-29 cellelinjen, i hvilken PPARy er sterkt uttrykt, med den DLD-1 cellelinjen, i hvilken PPARy er dårlig uttrykt under PSF knockdown betingelser. Differensial proteomic mønstre av de to cellelinjer ble bestemt ved LC-MS /MS-analyse. Nivået av PPARy i tykktarmen vev er lik eller større enn det i fettvev [18]. Denne observasjonen antyder den spesielle rollen PPARy i tykktarmen, noe som reflekteres i en del av celle- eller vev-spesifikke uttrykk av reseptoren [19]. Proteinene forskjellig regulert i de to cellelinjene gi oss en bedre forståelse av de involverte i tykktarmskreft hendelser.
Materialer og metoder
Material
Mus monoklonalt anti-PSF antistoff (sc-271796), kanin polyklonale anti-PPARy antistoff (sc-7196), geitepolyklonalt anti-VDAC2 antistoff (sc-32059), mus monoklonalt anti-β-actin antistoff (sc-47778), PSF siRNA (SC- 38304), og kontroll siRNA (sc-37007) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA). Syklisk fosfatidinsyre (CPA) og lysofosfatidisk syre (LPA) ble kjøpt fra Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL, USA). Den Checkmate ™ /Flexi® Vector pattedyr To-hybridsystem ble kjøpt fra Promega (Madison, WI, USA).
Plasmid Construction
Full-lengde human PSF cDNA (GenBank ™, BC051192) ble kjøpt fra IMAGE Clone Consortium (BILDE nummer: 5262885). PCR-primere ble utformet for å omfatte hele den åpne leserammen til PSF.
Kpn
jeg og
Xho
I overheng ble lagt i den forstand og antisensprimere hhv. Sekvensen til den forstand primeren var: 5′-GTAAGGTACCATGTCTCGGGATCGGTTCCGGAGTCGTG-3 «(
Kpn
-setet er understreket). Sekvensen av antisense-primeren var: 5′-CACGCTCGAGCTAAAATCGGGGTTTTTTGTTTGGGCCTTCG-3 «(
Xhol
-setet er understreket). En 2124-bp PCR-produktet ble forsterket ved hjelp Tks Gflex ™ DNA polymerase (Takara, Shiga, Japan), renset, fordøyd med
Kpn
I /
Xho
jeg, og settes inn i en pcDNA3. 1 (+) vektor (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). For pattedyr to-hybrid analysen, full-lengde PSF og PPARγ1 (
SGF
I /
PME
I) ble generert ved PCR og klonet inn i pFN11A eller pFN10A vektor av sjakkmatt ™ /Flexi® Vector pattedyr To-hybridsystem (Promega) på
SGF
jeg og
PME
jeg sider. Sekvensen av PSF forstand primeren var: 5′- CATAGCGATCGCCATGTCTCGGGATCGGTTCCGGAGTCGTG-3 «(
SGF
-setet er understreket). Sekvensen av PSF antisens primer var: 5’CGCGGTTTAAACCTAAAATCGGGGTTTTTT GTTTGGGCC-3 «(
PME
Jeg nettstedet er understreket). Sekvensen av den forstand primer PPARy var: 5’CAGTGCGATCGCCATGACCATGGTTGACACAGAGATGCCATTC-3 «(
SGF
Jeg nettstedet er understreket). Sekvensen av PPARy antisense-primeren var: 5′- GCGCGTTTAAACCTAGTACAAGTCCTTGTAGATCTCCTG-3 «(
PME
-setet er understreket). De PSF delesjonsmutanter (150-707, 290-707, 370-707, 450-707 og 662-707) var generøse gaver fra Dr. Xuesens Dong (University of British Columbia, Institutt for Urologiske Sciences, British Columbia, Canada) . Alle sekvensene ble bekreftet ved hjelp av en DNA-analyser (ABI modell 3730xl) og BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
Cell Culture
human tykktarmskreft HT-29 cellelinjen ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VS, USA). DLD-1 menneskelige adenokarcinomceller ble innhentet fra helsevitenskap Forskning Resources Bank (Osaka, Japan). Celler ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM; Nakarai Tesque, Kyoto, Japan) eller RPMI 1640 medium (Nakarai Tesque) inneholdende 10% (v /v) føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin, 10 ug /ml streptomycin, og 2,5 mikrogram /ml Plasmocin ™ (Nakarai Tesuque) ved 37 ° C i en fuktet inkubator med 5% CO
2.
Utarbeidelse av subcellulære fraksjoner
ne- PER Cellefraksjonering Kit (Pierce Bioteknologi, Rockford, IL, USA) ble anvendt for å isolere den nukleære fraksjonen fra celler, i henhold til produsentens instruksjoner. Etter den cytoplasmiske fraksjon ble utskilt, ble den nukleære fraksjonen utsatt for en kort sentrifugering (1000 x
g
, 10 sek), og grenseflaten ble fjernet for å redusere cytoplasmiske forurensning.
Trekk-down Assay med en Metal Affinity Resin
Hexahistidine (6 × Hans) -tagged PPARy fusjonsproteiner eller tomme vektor kontroller ble uttrykt i BL-21 (DE3) celler. Transform BL-21-celler ble indusert med 0,5 mM isopropyl-1-β-D-galaktopyranosid (IPTG) (Invitrogen) i 12 timer ved 25 ° C og oppsamlet ved sentrifugering. Deretter ble 1 ml av supernatanten ble inkubert med 20 ul av Talon metall affinitet harpiks (Takara) ved 4 ° C i 1 time i lyseringsbuffer. Harpiksen ble vasket 5 ganger med vaskebuffer (20 mM MES pH 7,4, 150 mM NaCl), og proteinene ble eluert med 150 mM imidazol i vaskebuffer. Mengden av PPARy ble kvantifisert ved hjelp av Protein Kvantifisering Kit-Rapid (Dojindo, Kumamoto, Japan). For rullegardin analysen, renset 6 x His-tagget PPARy (1 ug) ble blandet med nukleære ekstrakter fra HT-29 celler i 50 ul bindingsbuffer inneholdende 20 mM MES, pH 7,4 og 150 mM NaCl; TALON harpiks ble deretter tilsatt. Etter inkubasjon i 2 timer ved 4 ° C, ble harpiksene vasket 5 ganger med 500 ul vaskebuffer inneholdende 20 mM MES, pH 7,4 og 100 mM NaCl.
i-gel Fordøyelse og Protein Identification ved MALDI-TOF MS
i-gel fordøyelse av gelbåndene ble utført som tidligere beskrevet [20]. I korthet proteinflekker, som ble skåret ut fra gelen, ble de-farget med 100 mM ammoniumbikarbonat i 50% acetonitril. Gelstykkene ble tørket og spaltet med sekvensering grad modifisert trypsin (Promega). Peptidoppløsningen ble gjenvunnet, og resterende peptider ble ekstrahert ved risting med 5% trifluoreddiksyre (TFA) i 50% acetonitril. De kombinerte løsninger ble konsentrert ved hjelp av en lyofiliseringsanordning. De tryptiske peptider, som ble oppløst i 0,1% TFA, ble avsaltet med Zip-Tip (Millipore, Billerica, MA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner, blandet med like stort volum av en matrise-oppløsning (10 mg /ml α-cyano -4-hydroxycinnamic syre i 50% acetonitril /0,1% TFA), og applisert på en målplate. MS /MS-analyser ble utført ved anvendelse av AB SCIEX TOF /TOF ™ 5800 System (AB SCIEX, Foster City, CA, USA). Protein identifikasjon ble utført gjennom ProteinPilot ™ programvare (AB Sciex, Framingham, MA, USA) ved hjelp av Uniprot databasen.
Co-immunoutfellingsstudier og Western Blot
HT-29 celler og DLD-1 celler ble resuspendert i lyseringsbuffer inneholdende 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 100 mM NaCl, 50 mM KCl, 0,05% Tween-20, 10% glycerol, og Halt Protease Inhibitor Cocktail (Takara). Etter 15-minutters inkubering på is, ble cellelysatet ultralydbehandlet og sentrifugert ved 16000 x
g
i 10 minutter ved 4 ° C. Supernatanten ble samlet som den hel-celleekstrakt. Cellelysatet ble forhånds fjernet ved å tilsette 5 pl protein A /G Plus-Agarose (sc-2003, Santa Cruz Biotechnology) og inkubert i 1 time ved 4 ° C. Mus monoklonalt anti-PSF-antistoff (200 ug /ml, sc-271 796, Santa Cruz Biotechnology) og den celleekstrakt ble blandet og inkubert ved 4 ° C i 3 timer. Prøven ble deretter blandet med 5 ul av IP matrise (ImmunoCruz ™ IP /WB Optima B system, sc-45039, Santa Cruz Biotechnology) og inkubert ved 4 ° C over natten. Etter inkubering ble immunopresipitatene ble vasket 5 ganger med 0,5 ml 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 0,5 M NaCl, 0,1 M KCl, og 0,025% Tween-20, og deretter eluert med SDS-PAGE-reduserende prøvebuffer. Prøvene ble atskilt med 5-20% SDS-PAGE og western utslettet. Etter vasking, ble membranen inkubert med en pepperrotperoksidase bundet artsspesifikt hel sekundært antistoff (anti-kanin-IgG eller -mouse, GE Healthcare, Little Chalfont, UK) i 1 time ved romtemperatur og deretter visualisert med Pierce ECL Western Plus Blotting substrat (Thermo Scientific, Pittsburgh, PA, USA) eller EzWestLumi pluss (ATTO, Tokyo, Japan).
Kvantitativ real-time PCR-analyse
Total RNA ble fremstilt fra HT-29 og DLD-1 celler ved hjelp NucleoSpin® RNA II (Takara). Deretter, 0,5 ug av total-RNA ble anvendt for den etterfølgende syntese av cDNA ved anvendelse av den ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japan) som anbefalt av produsenten. Kvantifisering av mRNA nivåer ble målt ved hjelp av en ECO Real-Time PCR system (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) og SYBR Grønn Realtime PCR Master Mix -Plus- (Toyobo) med følgende primer paret sett: PSF, 5′-TGCCATTCATGCTTCTATGCA-3 «(F) og 5′-GGCCTAGACACTCTCATGCTTTC-3′ (R); 18S rRNA, 5»-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 «(F) og 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3» (R). Alle PCR ble utført i 10 mL volumet med 48-brønns PCR-plater (Illumina). Syklusbetingelsene var 95 ° C i 10 minutter (aktivering polymerase), etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 15 sek, 55 ° C i 15 sek, og 72 ° C i 30 sek. For å bestemme hvilken husholdningsgener var mest egnet for den etterfølgende normalisering av data, vi først valgte kandidater 3: GAPDH, β-actin, og 18S-rRNA, som vanligvis brukes interne kontroller i pattedyrceller. Etter amplifikasjon, ble prøvene langsomt oppvarmet fra 55 ° C til 95 ° C med kontinuerlig avlesning av fluorescens for å oppnå en smeltekurve. Den relative mRNA-kvantifisering ble beregnet ved hjelp av aritmetisk formel 2
-ΔΔCq, hvor ΔCq er forskjellen mellom terskelen syklus av et gitt mål-cDNA og et endogent referanse cDNA. Avledninger av formler og valideringstester har blitt beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin nr 2.
Små interfering RNA
PSF uttrykk ble hemmet i HT-29 og DLD-1 celler ved transfeksjon med en liten interfering RNA (siRNA) rettet mot PSF (Santa Cruz Biotechnology), ved hjelp av Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen). Celler ble sådd ut på 6-brønners plater (Iwaki, Tokyo, Japan) ved en tetthet på 5 x 10
4 celler pr brønn i DMEM inneholdende 10% FBS. Celler ble transfektert med 100 pmol /ml av mRNA-spesifikk siRNA eller kryptert kontroll siRNA. Reduksjonen i PSF-nivåer ble bekreftet ved western blot-analyse.
Måling av celleproliferasjon
PSF ble slått ned i HT-29 og DLD-1-celler, som ble sådd ut i 96-brønners kultur plater (5 × 10
3 celler /brønn) og inkubert i 24 timer. Celleformering ble bestemt ved anvendelse av celletelling leder-8 (Dojindo, Kumamoto, Japan): 10 ul av celletelling leder-8-løsning ble tilsatt til mediet og inkubert i 2 timer i en inkubator med 5% CO
2; mengden av oransje formazanforbindelsen fargestoff produsert ble beregnet ved å måle absorbans ved 450 nm i en mikroplateleser (Awareness Technology, Inc., Palm City, Florida, USA).
Påvisning av Cytoplasmatiske vacuolization
DLD-1 og HT-29-celler ble dyrket på 96-brønners plater i DMEM i 24, 48 og 72 timer etter transfeksjon med PSF siRNA. Ved disse tidspunktene ble celler undersøkt under et Olympus fluorescerende mikroskop. Bilder ble analysert ved å telle det totale antall celler og antall vacuolated celler.
PPARy-aktivering ble bestemt i HT-29 eller DLD-1-celler transfektert med 125 ng av pGL3-PPRE-acyl-CoA oksidase luciferase vektor, 62,5 ng av pcDNA3.1-PPARy-vektoren, og 12,5 ng av pSV-β-galaktosidase (Promega) vektoren, som ble utført som tidligere rapportert [21], [22]. Tjuefire timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med Opti-MEM (Invitrogen) inneholdende testforbindelse oppløst i DMSO (opp til 0,1%) og dyrket i ytterligere 20 timer. Luciferase aktivitet ble målt med ONE-Glo Luciferase Assay System (Promega) med en LuMate mikro luminometer (Awareness Technology, Inc., Palm City, Florida, USA).
Pattedyr To-hybrid Analyser
CV-1-cellene ble sådd ut på en 96-brønns plate (Iwaki) ved en tetthet på 1,5 x 10
4 celler per brønn i DMEM inneholdende 10% FBS. På neste dag ble cellene transient transfektert med 71 ng av pGL4.31 [
luc2P /GAL4UAS /Hygro
] vektor, 14,3 ng av pFN11A-PSF vektor, 14,3 ng av pFN10A-PPARy vektor, og 10 ng av PSV-β-galaktosidase vektor (Promega) ved hjelp av X-tremeGENE HP DNA transfeksjon reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA). På 48 timer etter transfeksjon, ble cellene analysert med ONE-Glo ™ Luciferase Assay System (Promega) ved hjelp av en Power Scan 4 mikroplateleser (DS Pharma Biomedical Co., Ltd.). Prøvene ble kjørt i quintuplets, og middelverdien ± SEM ble beregnet. Dataene er representative for minst 3 uavhengige transfections.
Statistical Analysis
Student
t
-test ble brukt for statistiske sammenligninger. Forskjeller ble betraktet som signifikant når P-verdien var under 0,05.
Resultater
Protein-protein interaksjoner vurdert av rullegardin Eksperimenter
rullegardin eksperimenter med Hans-merket fusjonsproteiner er festet til metall affinitet perler er en screeningteknikk for identifisering av protein-protein interaksjoner. Bruke 6 × Hans-merket PPARy som agn (Fig. 1A, panel til høyre), vi får fanget et potensielt mål protein (100 kDa) fra HT-29 atom ekstrakter (Fig. 1a). Etter grundig vasking, bundne proteiner og den fangede proteinet ble skåret ut fra gelen, trypsin-spaltet og analysert ved peptid masse fingerprinting med MALDI-MS. Tandem massespektrometri (MS /MS) profiler som identifiserer PSF-proteinet er vist i fig. 1A. Fordi PSF er en kjernefysisk protein, vi så gjennomført cellefraksjonering, western blotting analyse, og farging av PSF. Som vist på fig. 1B, i HT-29 og DLD-1 cellelinjer, PSF lokalisert hovedsakelig innen atom pellet. På den annen side, i HT-29-celler, PPARy lokalisert innenfor den cytosoliske og atomfraksjoner. For ytterligere å undersøke samspillet mellom PPARy og PSF, utførte vi co-immunoprecipitation (co-IP) eksperimenter med atom ekstrakter. Som vist på fig. 1C, PSF ble oppdaget med en anti-PSF antistoff etter immunoprecipitation atom utdrag fra HT-29 og DLD-1 celler med et anti-PPARy antistoff. Dermed PSF og PPARy samhandle innenfor tykktarmskreftceller.
(A) Pull-down affinitet-bindingsanalysen med renset PPARy. Full-lengde PPARy uttrykt i
E. coli
som en 6 x His-merkede fusjonsprotein ble isolert og renset ved anvendelse av TALON harpiks (panel øverst til høyre). 6 x His-tagget PPARy-protein ble inkubert med nukleære ekstrakter isolert fra HT-29 celler. Etter vasking med vaskebuffer, ble harpiksen oppsamlet ved sentrifugering, og SDS-PAGE ble utført med en 5-20% (vekt /volum) akrylamid gel. De separerte proteinbånd ble visualisert ved Coomassie Brilliant Blue. Den proteinbånd (a) ble skåret ut fra gelen, spaltet med trypsin, og identifisert ved masse fingerprinting. Antallet peptider, andel av sekvens-dekning, og aksesjonsnummeret for proteinet er angitt i tabell S1. (B) Verifikasjon av lokalisering av PSF i kjernefysiske og cytosoliske utdrag fra HT-29 og DLD-1 celler. Cytosoliske ekstrakter og nukleære ekstrakter ble fremstilt fra celler og analysert ved immunoblotting ved bruk av et antistoff mot human PSF. Immunfluorescens farging av formalinfiksert HT-29 og DLD-1 celler viser kjernefysiske lokalisering av PSF (høyre panel). (C) HT-29-celler ble lysert med lyseringsbuffer og deretter analysert ved hjelp av ko-immunoutfelling og western blotting med anti-PSF antistoff. Perler alene og normalt kaninserum (IgG) ble anvendt som negative kontroller. Pilene viser plasseringen av PSF (100 kDa).
Interaksjons av pFN-PSF og pFN-PPARy Fusion Proteiner i CV-1 celler
For å undersøke potensielle interaksjoner mellom PSF og PPARy, analyserte vi deres interaksjon i en pattedyr to-hybrid analysen i CV-1 celler. CV-1-celler ble brukt fordi de ikke uttrykker PPARy [21]. Som forventet fra tidligere eksperimenter, koekspresjon av PSF, fusjonert til det GAL4 DNA-bindende domene, og PPARy, kondensert til VP16 aktiveringsdomenet, indusert GAL4 promoter-drevet luciferase-ekspresjon (3,0 ganger i forhold til det med tomme vektorer, fig. 2A). Effekten av rosiglitazon på evnen av PPARy-PSF for å indusere luciferase-ekspresjon ble analysert som vist i fig. 2B. PPARy aktivering ikke påvirke PPARy-PSF forening. Deretter fant vi ut den fysiske plasseringen av interaksjons nettsteder. PSF er sammensatt av 707 aminosyrer (aa), har en molekylmasse på 76 kDa, og består av 2 strukturelle og funksjonelle domener [23]. For å undersøke hvilken av disse domenene er avgjørende for interaksjonen med PPARy, konstruerte vi PSF-delesjonsmutanter. Interaksjon av kimære Gal4-PSF sletting mutanter med VP16-PPARy ble vurdert ved hjelp av pattedyr to-hybrid reporter gen analysen. Som vist på fig. 2C, tap av aminosyrer 1-290 av PSF hadde ingen effekt på interaksjonen. Således er det N-terminale domene ikke er essensiell for interaksjonen mellom disse proteinene. Tap av aminosyrer 291-370 av PSF forstyrret samspillet mellom PSF og PPARy. Sletting av aminosyrer 371-450, 451-662 og 452-707 av PSF også forstyrret samspillet med PPARy. Til sammen våre resultater identifisert den første nucleotide bindingsdomene (aa 291-370) som en viktig molekylær stedet for PPARy bindende.
(A) Skjematisk fremstilling av to-hybrid analysen ved hjelp av full-lengde PSF og PPARy . For pattedyr to-hybrid-analyse, CV-1-celler ble ko-transfektert med GAL4-UAS-Luc alene eller i kombinasjon med pFN11A-PSF (BIND) og pFN10A-PPARγ1 (VP16 transaktivator). Etter 24 timer inkubering ble cellene lysert, og luciferaseaktivitet ble målt. Resultatene er vist som gangers induksjon sammenlignet med den negative kontroll (GAL4-UAS-Luc alene) og representerer gjennomsnittet av triplikater fra et representativt eksperiment, med feilfelt som viser standardavviket. (B) CV-en-celler ble ko-transfektert med GAL4-UAS-Luc, pFN11A-PSF, og pFN10A-PPARγ1. Etter 24 timer inkubering ble cellene behandlet med rosiglitazon, og luciferaseaktivitet ble målt. Behandling med rosiglitazon (0,1-10 mm) påvirket ikke PSF-PPARy interaksjon. (C) Skjematisk fremstilling av PSF basert på domenet prediksjon verktøyet SMRT; nukleotid-bindende domene er indikert. Domener i PSF inkluderer C-terminale nukleotid anerkjennelse motiver (NRM1 og NRM2) og svært belastet domene. Den N-terminale ende inneholder prolin-glutamin-rike domener og arginin-glysin-rike domener. Interaksjonen mellom PPARγ1 med de avkortede former av PSF ble analysert ved anvendelse av pattedyr-to-hybrid-analyse. CV-1 celler ble transfektert med plasmider for ekspresjon av det GAL4-UAS-Luc, pFN11A-PSF kimære protein, VP-16-proteiner PPARγ1, og de angitte delesjonsmutanter. Folden induksjon av luciferaseaktivitet ble beregnet i forhold til den negative kontroll. Feilstolpene representerer standardavvik.
PPARy Activation regulerer ikke PSF Expression i HT-29 og DLD-1 celler
For å finne ut PPARy rolle i å regulere PSF uttrykk, vi undersøkte virkningen av en PPARy agonist, rosiglitazon (10 uM), på PSF ekspresjon i DLD-1 og HT-29-celler. Som vist i fig. 3A og B, i HT-29 celler, stimulering med rosiglitazon hemmet ikke PSF mRNA og protein uttrykk; Men uttrykket nivåer redusert i DLD-1 celler stimulert med rosiglitazon. Den selektive og irreversible PPARy-antagonist GW9662 (10 pM) hemmet ikke PSF ekspresjon i begge cellelinje. Videre tillegg av GW9662 og rosiglitazon ikke endre PSF mRNA og protein uttrykk. Disse resultater antyder at PSF uttrykk er PPARy-uavhengig og indikerer at andre mekanismer enn PPARy stimulering regulere PPARy-PSF aksen.
(A) Real-time PCR måling av PSF mRNA og protein ekspresjon i HT-29 og DLD-1 celler. Celler ble behandlet med vehikkel (DMSO), rosiglitazon (Rosi), eller GW9662 (GW) i 20 timer. PCR ble utført ved anvendelse av spesifikke primere for PSF. De relative PSF nivåene ble normalisert til 18S- rRNA og er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (
n =
3), ** P 0,01. Tilsetningen av GW9662 sammen med Rosi endret ikke PSF mRNA og protein ekspresjonsnivåene. Proteinnivåer ble analysert ved SDS-PAGE og western blot og visualisert med forbedret kjemiluminescens reagens. Hvert felt ble ladet med 50 ug hel-celle-lysat. β-actin ble brukt som en lasting kontroll.
knockdown av PSF Hemmer Cell Proliferation og induserer vakuolisering i DLD-1 celler
For å evaluere effekten av PSF på spredning av HT -29 og DLD-1 celler, PSF uttrykk ble slått ned ved hjelp av siRNA. Som vist på fig. 4A, knockdown av PSF uttrykk i HT-29 og DLD-1 celler ved hjelp av siRNA var effektive, noe som gjenspeiles av western blot analyse ved hjelp av en anti-PSF antistoff. Som vist på fig. 4B, real-time kvantitativ RT-PCR-analyse viste at PSF mRNA i siRNA transfekterte celler ble slått ned med 80-90% i forhold til uttrykk i utransfekterte (UT) kontrollceller. DLD-1 celler dukket opp som tomme, Lucent mellomrom i kontrast fase på 48 timer etter siRNA transfeksjon (fig. 4C). Ved 48 og 72 timer etter transfeksjon, ca 30 og 40% av det totale antall celler, henholdsvis, viste omfattende vacuolization av cytoplasmaet. Cell vakuolasjon økt i antall og størrelse, opptar stadig større områder av cytoplasma i en tidsavhengig måte. Deretter bestemmes vi effekten av PSF knockdown på celleformering ved hjelp av en kolorimetrisk analyse. Som vist på fig. 4D, PSF knockdown sterkt hemmet celleproliferasjon i DLD-1-celler, som har et lavere endogent nivå av PPARy enn HT-29-celler. Interessant, PSF knockdown svakt hemmet celleproliferasjon i HT-29 og LoVo-celler, sammenlignet med spredning i DLD-1 og Caco-2-celler. Dermed HT-29 celler synes å være mer motstandsdyktig mot PSF knockdown-indusert veksthemming.
(A) Uttrykk for PSF ble slått ned i HT-29 og DLD-1 celler. Totalt protein ble hentet fra utransfekterte (UT), kontrollere siRNA-, eller PSF siRNA-transfekterte celler. Førti-åtte timer senere, ble hel-celle-lysatene underkastet Western blot-analyse for PSF. Inkubering med et anti-β-aktin-antistoff ble anvendt som en protein-lastekontroll. (B) Effekten av siRNA på mRNA uttrykk i HT-29 og DLD-1 celler. Effektiviteten av PSF knockdown ble beregnet til å være 80% ved sanntids kvantitativ RT-PCR. Data er presentert som gjennomsnitt ± SEM (
n =
3). (C) 24 timer etter transfeksjon ble celler på nytt utplatet i 96-brønners plater (5 x 10
3 celler /brønn) og inkubert i 48 timer. Cytoplasmatiske vacuolization var tydelig i DLD-1 celler i kontrast fase etter siRNA transfeksjon (angitt med piler). Vacuolated celler ble analysert og telles som beskrevet i avsnittet Materialer og metoder. Minst 3 felt av celler per prøve ble tellet og ordnet. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (
n =
3), ** P 0,01. (D) Tidsavhengig cellevekst inhibering ble målt ved hjelp av Cell telling leder-8 ved 24, 48, 72, 96 og 120 timer etter transfeksjon siRNA. Et like stort antall celler (1 x 10
5-celler /brønn) ble sådd ut i 6-brønns plater og deretter inkubert i 24 timer ved 37 ° C i en inkubator med 5% CO
2. Deretter ble 10 ul av celletellingsleder-8 tilsettes til mediet og inkubert i 2 timer i en inkubator (5% CO
2). Mengden av oransje fargestoff formazan generert ble beregnet ved å måle absorbansen ved 450 nm i en mikroplateleser. Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM (
n =
4), ** P. 0,01
PPARy Expression nivå er avgjørende for beskyttelse mot PSF knockdown-indusert hemming av cellevekst
Som vist i fig. 5A og B, undersøkte vi PPARy og PSF mRNA og protein ekspresjon i 4 humane tarmkreftcellelinjer, HT-29, DLD-1, Caco-2, og LoVo. Total RNA ble isolert fra ubehandlede celler. Sanntids-PCR-analyse viste at det relative nivået av PPARy mRNA i disse cellene var i størrelsesorden HT-29 Løvø Caco-2 DLD-en. Tilsvarende vår forrige rapport antydet at PPARy protein nivået er høyt i HT-29 og Løvø celler og lite Caco-2 og DLD-1 celler [19]. Dette funnet er også konsistent med en rapport fra Kitamura et al. [24]. Deretter for å teste funksjonen av PPARy, transfiserte vi cellelinjene med et luciferase reporter plasmid. HT-29 og Løvø cellene var mer lydhør overfor rosiglitazon enn DLD-en og Caco-2 celler (Fig. 5C). Som vist på fig. Som vist på fig.
