Abstract
STC1 er et glykoprotein hormon involvert i kalsium /fosfat (Pi) homeostase. Det er montering bevis for at STC1 er tett forbundet med utvikling av kreft. Men funksjonen av STC1 i kreft er ikke fullt ut forstått. Her fant vi at STC1 er nedregulert i kliniske vev av livmorhalskreft i forhold til de tilstøtende normale cervical vev (15 tilfeller). Deretter ble uttrykk for STC1 banket ned av RNA interferens i livmorhalskreft CaSki celler og den lave uttrykk fremmet cellevekst, migrasjon og invasjon. Vi fant også at STC1 overekspresjon hemmet celledeling og invasjon av livmorhalskreftceller. Videre STC1 overekspresjon lysfølsomt CaSki celler til narkotika. Videre viste vi at NF-kB p65 protein direkte bundet til STC1 arrangøren og aktivert uttrykk for STC1 i livmorhalskreftceller. Dermed disse resultatene gitt bevis for at STC1 hemmet celledeling og invasjon gjennom NF-kB p65-aktivering i livmorhalskreft
Citation. Guo F, Li Y, Wang J, Li Y, Li Y, Li G (2013 ) Stanniocalcin1 (STC1) Hemmer celleproliferasjon og invasjon av livmorhalskreftceller. PLoS ONE 8 (1): e53989. doi: 10,1371 /journal.pone.0053989
Redaktør: Soumitro Pal, Barnesykehuset i Boston Harvard Medical School, USA
mottatt: 18 juli 2012; Godkjent: 05.12.2012; Publisert: 29 januar 2013
Copyright: © 2013 Guo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra Natural Science Foundation National of China (nr 30672352) og Innovasjonsprosjekt prosjekt~~POS=HEADCOMP av Postgraduate Education of Central South University (nr 2340-74334000006). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Stanniocalcin1 (STC1) er et glykoprotein hormon involvert i kalsium /fosfat (Pi) homeostase, som opprinnelig ble oppdaget i en sekretorisk hormon av mene av Stannius, en endokrin kjertel av beinfisk [1]. Pattedyr STC1 er bredt uttrykt i forskjellige vev innbefattende hjerte, lunge, lever, binyre, nyre, ovarie, prostata, tarm og milt [2] – [5]. STC1 spiller rolle i forskjellige fysiologiske og patologiske prosesser, inkludert graviditet, amming, angiogenese, organogenese, oksidativt stress, cerebral iskemi, og apoptose [6] – [10]. Et menneske ortolog av fisk STC1 ble funnet av mRNA differensial visning av kreftrelaterte gener [11]. STC1 ble opprinnelig klonet i en skjerm for kreftrelaterte gener. Tallrike linjer fra studier indikerte at endret ekspresjon av STC1 kan ha en rolle i kreftutvikling og utvikling. Økt STC1 genekspresjon har blitt funnet i hepatocellulær, kolorektal, akutt leukemi, og medullære thyroid carcinomer, men redusert ekspresjon av STC1 ekspresjon ble funnet i bryst- og eggstokk-kreft-cellelinjer [12] – [19]. Men forholdet mellom de differensielt uttrykk for STC1 i tumor sammenlignet med normalt vev, og dets biologiske funksjon behov for videre undersøkelser. Noen studie indikerte at STC1 uttrykk var involvert i dannelsen av tumor blodkar, og STC1 kan indusere adaptiv respons på hypoksi ved HIF regulering i humane kreftceller [20], [21]. Det er rapportert at histone deacetylase inhibitor-indusert cellulær apoptose innebærer STC1 aktivering [22].
På tross av økt kunnskap STC1, er det lite kjent funksjon av STC1 i progresjon av kreft. I denne studien undersøkte vi hvilken rolle STC1 genuttrykk i menneskets livmorhalskreft. Vi fant at STC1 ble nedregulert i kliniske vev av livmorhalskreft. Deretter fant vi at STC1 lav uttrykk fremmet cellevekst, migrasjon og invasjon. Vi fant også at STC1 overekspresjon hemmet celledeling og invasjon av livmorhalskreftceller. Videre STC1 overekspresjon lysfølsomt CaSki celler til narkotika. Disse dataene støttet pro-apoptotisk funksjon av STC1. Videre viste vi at NF-kB p65 protein direkte bundet til STC1 arrangøren og aktivert uttrykk for STC1 i livmorhalskreftceller.
Resultater
STC1 ble nedregulert i kliniske vev av livmorhalskreft
for å undersøke hvilken rolle STC1 i livmorhalskreft, vi først undersøkte mRNA uttrykk nivået på 15 par matchet cervical vev ved RT-PCR. Ekspresjonsnivået av STC1 mRNA i livmorhalskreft vev ble redusert sammenlignet med de tilstøtende normale (figur 1A og B). Deretter, immunohistokjemi analyse viste at proteinnivået STC1 var lav i tumorvev, og samtidig økes i tilstøtende normale vev, noe som indikerer dens potensielle rolle i progresjonen av livmorhalskreft (figur 1C og D).
(A ) ekspresjonsnivået av STC1 mRNA i kreft (T) og tilstøtende normal (N) tilpasset livmorhalsen vev ble undersøkt ved hjelp av RT-PCR. GAPDH fungerte som en lasting kontroll. (B) Box plot grafen viste de kvantitative resultatene av STC1 mRNA uttrykk i alle par av prøvene (
p
0,05). (C) Protein nivået av STC1 i tumor og normalt vev ble undersøkt ved immunhistokjemisk analyse. Bar Størrelse: 100 mikrometer. (D) Mengde analyse av proteinnivå STC1 uttrykk. Intensiteten av reaktivitet ble scoret ved hjelp av en tre-lags system (
p
0,05). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre adskilte eksperimenter. En verdi på P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikans
nedregulering av STC1 Forfremmet CaSki Cells Vekst og Invasion
For å studere den biologiske funksjonen til STC1, genererte vi RNAi vektor inneholder siRNA spesielt rettet mot STC1 til stabilt slå ned endogen uttrykk for STC1 i CaSki celler. Som vist i figur 2A, sammenlignet med kontrollen (CaSki /NC), var celler transfektert med siRNA -STC1 signifikant redusert nivå av STC1 mRNA eller protein.
(A) Slå ned av STC1 i CaSki-celler. CaSki-celler ble transfektert ved STC1 målretting siRNA, og knockdown effektivitet ble vist ved hjelp av RT-PCR og western-blotting. (B) MTT-analyser viste at effekten av redusert STC1 på CaSki-cellevekst. Etter en 7-dagers periode, veksten av CaSki /siRNA celler var mye raskere enn CaSki /NC celler (*
p
0,05). (C) kolonidannelse analysen viste stort antall cellekolonier fra CaSki /siRNA-celler sammenlignet med CaSki /NC-celler (
p
0,05). (D) Sårhelende analysene viste virkningen av STC1 på migrering av CaSki-celler. CaSki /siRNA celler migrert raskere sammenlignet med CaSki /NC celler (venstre panel). Den relative migrasjon avstand fra CaSki celler ble beregnet (høyre panel) (
p
0,05). Bar Størrelse: 100 mikrometer. (E) Matrigel invasjon analysene viste virkningen av STC1 på invasjonen av CaSki-celler. Antallet CaSki /siRNA celler på filteroverflaten var større enn CaSki /NC celler (venstre panel) (
p
0,05). Middelverdien av invaderte celler ble vist i panel høyre. Bar Størrelse: 100 mikrometer. (F) Vekst kurver av xenotransplantater ble bestemt av tumorvolum (venstre panel) (*
p
0,05). Vekstratene av xenotransplantater ble vurderes av tumorvolum /dager (høyre panel) (*
p
0,05). CaSki /siRNA eller CaSki /NC celler ble injisert subkutant i nakne mus. (G) Ved utgangen av forsøksperioden, slutt xenografttumorer ble vist. (H) RT-PCR analysert uttrykk for STC1 i representative xenografttumorer. (I) Representative bilder av histologisk undersøkelse av xenografttumorer. De delene av xenografttumorer ble farget med H E. Bar størrelse: 20 mikrometer. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre adskilte eksperimenter. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre adskilte eksperimenter. En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikans
Deretter undersøkte vi effekten av redusert STC1 på CaSki cellevekst ved MTT-analyser.. Etter en 7-dagers periode, veksten av CaSki /siRNA celler var mye raskere enn CaSki /NC celler, og ble observert betydelig høyt antall CaSki /siRNA celler fra dag 4 (figur 2B). Et lignende mønster av fremme effekten av redusert STC1 ekspresjon i CaSki-celler ble oppnådd i kolonidannelse analysen (figur 2C). Derfor er den høye aktiviteten og et stort antall av cellekolonier fra CaSki /siRNA-celler viste at nedregulering av ekspresjon STC1 fremmet cellevekst in vitro.
Cell migrering og invasjon er viktig prosess for tumorutvikling og metastasering. Deretter undersøkte vi effekten av STC1 på migrering av CaSki-celler ved den til sårheling analysen i figur 2D. Etter inkubasjon av fysisk skadde celler i 48 timer, CaSki /siRNA celler migrert raskere sammenlignet med CaSki /NC celler. Videre analyser av virkningen av STC1 på CaSki celler invasjon avslørte at nedregulering av STC1 forbedret invasjonen av celler in vitro, fastsatt matrigel invasjon analysen (figur 2E). Den vesentlig lengre avstand migrasjon og et stort antall CaSki /siRNA celler på filteroverflaten indikerte at nedregulering av STC1 forbedret migrasjon og invasjon evne CaSki celler in vitro.
For å finne ut hvilken rolle STC1 videre i tumorigenicity og utvikling av livmorhalskreft, ble CaSki /siRNA eller CaSki /NC celler injisert subkutant i nakne mus. Utviklingen av tumor ble overvåket i 40 dager. Som vist i figur 2F, STC1 knockdown tumorer fremkom tidligere og vokste hurtig sammenlignet med kontrolltumorer. Ved slutten av forsøksperioden ble de endelige vekter av STC1 knockdown tumorer (1,417 ± 0,169 g) funnet å være vesentlig høyere enn kontrollene (0,478 ± 0,115 g) (figur 2G). RT-PCR av STC1 i representative xenografttumorer indikert at redusert STC1 uttrykket hadde blitt opprettholdt gjennom eksperimentelle utdanning (figur 2 H). H E farging av STC1 knockdown svulster viste en høy kjernefysisk /cytoplasma ratio, store og dype-farget kjerner sammenlignet med kontroll tumorer (figur 2i). Sammen er disse dataene viste at nedregulering av STC1 fremmet in vivo xenograft tumor utvikling.
Overuttrykte STC1 hemmet celleproliferasjon og invasjon av CaSki Cells
Gitt at nedregulering av STC1 fremmet CaSki celler utvikling in vitro eller in vivo, hypotese vi at STC1 kan inhiberes CaSki-celler utvikling. For å teste denne hypotesen, ble CaSki celler transfektert med plasmid koding STC1. Sammenlignet med kontrollen (CaSki /NC), celler (CaSki /STC1) transfektert med plasmid som koder for STC1 har økte nivåer av STC1 mRNA eller protein (figur 3A). MTT-analyser viste at veksten av CaSki /STC1 celler var mye lavere enn CaSki /NC-celler (Figur 3B). Kolonidannelse analyse viste at en liten mengde av cellekolonier fra CaSki /STC1 celler viste en lav aktivitet (figur 3C). Matrigel invasjon analysen avslørte at oppregulering av STC1 dempet invasjon av celler in vitro (figur 3D).
(A) Overekspresjon av STC1 i CaSki-celler. STC1 ekspresjonsvektor ble transfektert inn i CaSki-celler, og økt ekspresjon av STC1 ble vist ved hjelp av RT-PCR og western-blotting. (B) MTT-analyser viste at veksten av CaSki /STC1 celler var mye lavere enn CaSki /NC-celler (*
p
0,05). (C) kolonidannelse analyse viste at en liten mengde av cellekolonier fra CaSki /STC1 celler viste en lav aktivitet (
p
0,05). (D) Matrigel invasjon analyse avslørte at oppregulering av STC1 dempet invasjon av celler in vitro. Bar Størrelse: 100 mikrometer. (E) STC1 overexpressed svulster dukket opp senere og langsomt vokste i forhold til å kontrollere svulster (*
p
0,05). (F) På slutten av forsøksperioden ble de endelige vekter av STC1 overuttrykt tumorer funnet å være lavere enn kontrollene. (G) RT-PCR av STC1 i xenografttumorer indikert at økte STC1 uttrykket hadde blitt opprettholdt gjennom eksperimentell tid kurset. (H) H E farging av STC1 overuttrykt svulster viste en lav kjernefysisk /cytoplasma ratio, og begrenset til kreft reir i forhold til å kontrollere svulster. Bar størrelse: 20 mikrometer. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre adskilte eksperimenter. En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikans
Deretter CaSki /STC1 eller CaSki /NC celler ble injisert subkutant i nakne mus.. STC1 overexpressed svulster dukket opp senere og vokste sakte i forhold til kontroll tumorer (Figur 3E). På slutten av forsøksperioden, de endelige vekter av STC1 overexpressed svulster (0,285 ± 0,057 g) var lavere enn kontrollene (0,523 ± 0,154 g) (figur 3F). RT-PCR av STC1 i xenografttumorer indikert at økte STC1 uttrykket hadde blitt opprettholdt gjennom eksperimentelle utdanning (figur 3G). H E farging av STC1 overuttrykt svulster viste en lav kjernefysisk /cytoplasma ratio, og begrenset til kreft reir i forhold til å kontrollere svulster (Figur 3H). Sammen er disse dataene antydet at oppregulering av STC1 hemmet celleproliferasjon og invasjon av CaSki celler in vitro eller in vivo.
STC1 Følsomme CaSki Cells til narkotika
Tidligere resultater viste at STC1 kan hemme celle spredning av CaSki celler. Cisplatin, thapsigargin og rapamycin er stoffer forbundet med celler vekst og apoptose. Cisplatin-basert kjemoterapi har ofte vært brukt i kreftbehandling inkludert livmorhalskreft [23]. Thapsigargin som et apoptotisk middel kan oppvise en effektiv tumorkontroll basert på evnen til å inhibere den intracellulære sarco- /endoplasmtic kalsium pumpe [24], [25]. Pattedyr målet for rapamycin er en serin /treonin proteinkinase av PI3K /AKT-signalveien, som spiller en avgjørende rolle i å kontrollere kreftcellevekst, metabolisme og cellesyklusprogresjon [26]. Deretter CaSki-celler ble behandlet med med eller uten cisplatin (0, 1, 2, og 3 mg /L), thapsigargin (0, 1, 3, 6 og 9 uM), eller rapamycin (0, 0,01, 0,1, 0,5 og 1 mg /l) i 96 timer eller 72 timer, fjerning av aliquoter hver 24 timer for å evaluere cellelevedyktighet. Vi har funnet at veksten av CaSki-celler var langsom med forbedringen av tid og konsentrasjon av legemidler (figur 4A-C). For å avgjøre om uttrykket av STC1 økt legemiddelindusert celler vekst retard, ble CaSki /STC1 eller CaSki /NC behandlet med ulike stoffer som cisplatin, thapsigargin og rapamycin. Veksten av CaSki /STC1 celler var tregere med økende tid i forhold til CaSki /NC celler når cellene ble behandlet med cisplatin, thapsigargin eller rapamycin (fig. 4D-F). Disse dataene viste at overekspresjon av STC1 forbedret sensitivitet på CaSki celler til narkotika.
(A) Effekt av cisplatin på CaSki celler vekst. CaSki-celler ble behandlet med med eller uten cisplatin (0, 1, 2, og 3 mg /l) i 96 timer, fjerning av aliquoter hver 24 timer for å evaluere cellelevedyktighet. (B) Effekt av thapsigargin på CaSki celler vekst. CaSki-celler ble behandlet med med eller uten thapsigargin (0, 1, 3, 6 og 9 pM) i 72 timer, fjerning av aliquoter hver 24 timer for å evaluere cellelevedyktighet. (C) Virkning av rapamycin på CaSki-celler vekst. CaSki-celler ble behandlet med med eller uten rapamycin (0, 0,01, 0,1, 0,5 og 1 mg /l) i 72 timer, fjerning av aliquoter hver 24 timer for å evaluere cellelevedyktighet. (D) STC1 sensibiliserte CaSki celler til cisplatin. CaSki /STC1 eller CaSki /NC-celler ble behandlet med cisplatin (2 mg /l) i 96 timer. MTT-analyser påvist cellevekst CaSki /STC1 eller CaSki /NC celler i ansiktet av cisplatin (*
p
0,05). (E) STC1 lysfølsomt CaSki celler til thapsigargin. CaSki /STC1 eller CaSki /NC-celler ble behandlet med thapsigargin (3 uM) i 72 timer. MTT-analyser påvist cellevekst CaSki /STC1 eller CaSki /NC celler i ansiktet av thapsigargin (*
p
0,05). (F) STC1 lysfølsomt CaSki celler til rapamycin. CaSki /STC1 eller CaSki /NC-celler ble behandlet med rapamycin (0,5 mg /l) i 72 timer. MTT-analyser påvist cellevekst CaSki /STC1 eller CaSki /NC celler i ansiktet av rapamycin (*
p
0,05). Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM av tre adskilte eksperimenter. En verdi på P . 0,05 ble ansett som statistisk signifikans
Direkte Binding av NF-kB p65 protein til STC1 Arrangøren Region livmorhalskreftceller og regulert uttrykk for STC1
nukleær faktor-kappa B (NF-kB) familie av transkripsjonsfaktorer regulerer uttrykket av mange gener, inkludert spredning og invasjons gener. NF-kB pathway spiller en sentral rolle i kreft og hjerte- og karsykdommer. Arrangøren av STC1 inneholder flere NF-kB P65 bindingsseter [27]. Til å begynne ytterligere utforske mekanismer mellom korrelasjon av STC1 og p65, ble bindingsstedene testet i CaSki celler ved kromatin coimmunoprecipitation. Området (-GGGACAAACC-) ble funnet å binde til NF-kB p65 (fig. 5A). For å bestemme om ekspresjon i STC1 CaSki-celler ble korrelert med NF-kB, aktiviteten av NF-kB ble detektert. Medfølgende med økt aktivitet av PARP og Caspase-3, aktiviteten av NF-kB p65 og STC1 også øke når CaSki-celler ble behandlet med thapsigargin (Fig. 5B). TNFa aktiverer apoptotiske trasé Følgende simultan induksjon av NF-kB. For å avgjøre om uttrykket av STC1 tilsvarende økt i TNFa-indusert apoptose, ble CaSki celler behandlet med økende tid av TNFa. Ekspresjonen av NF-kB p65 øket, og aktiviteten av STC1 og Caspase-3 forsterket respons på TNFa (fig. 5C). Pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC) er en effektiv hemmer av NF-kB aktivering og undertrykker NF-kB avhengig transkripsjon av pro-in fl ammatory cytokiner og chemokiner [28]. Når CaSki-celler ble behandlet med PDTC, aktiviteten av NF-kB p65 redusert og ekspresjon av STC1 nedregulert med økende tid fra PDTC (fig. 5D). Videre, etter at knockdown av P65 ble utført ved å transfektere siRNA målretting NF-kB p65, den subcellulære ekspresjon av p65 og STC1 på CaSki-celler ble analysert (figur 5E). Ekspresjonen av p65 i cytoplasma og cellekjernen både redusert, og mens den i kjernen betydelig redusert. Ned regulerende STC1 uttrykk i kjernen ble også funnet etter knockdown av p65. Knockdown av p65 forårsaket uttrykk for p65 og STC1 både redusere på mRNA nivå (figur 5F).
(A) bindingsseter av STC1 ble testet i CaSki celler ved kromatin coimmunoprecipitation. Nettstedet ble funnet å binde til NFkB p65. (B) Western blotting detektert aktiviteten av PARP, caspase-3, STC1, og NF-kB p65 på CaSki-celler. CaSki-celler ble behandlet med thapsigargin (3 uM) i 12 timer. (C) Western blotting detektert aktiviteten av p65, STC1, og caspase-3 i CaSki-celler. CaSki-celler ble behandlet med økende tid av TNFa (10 mg /l) i 2,5 timer. (D) Western blotting detektert aktiviteten til p65 og STC1 på CaSki-celler. CaSki-celler ble behandlet med PDTC (10 uM) i 60 minutter. (E) subcellulære aktivitet av p65 og STC1 på CaSki-celler ble analysert ved Western blotting. CaSki-celler ble behandlet med siRNA knockdown av p65 i 72 timer. (F) Ekspresjon av p65 og STC1 i CaSki ble påvist ved RT-PCR på mRNA-nivå. CaSki-celler ble behandlet med siRNA knockdown av p65 i 48 timer. (G) Skjematisk fremstilling av enkelte funn i dette arbeidet.
Diskusjoner
Det er montering bevis for at STC1 er tett forbundet med utvikling av kreft. Men ekspresjonen av STC1 variert i forskjellige vev, og også for det samme vev i forskjellig nivå (mRNA eller protein), og derfor funksjonen av STC1 kan vise forskjellen [29]. I denne studien fant vi at STC1 hemmet celledeling og invasjon av livmorhalskreftceller. STC1 er nedregulert i kliniske vev av livmorhalskreft, som indikerte STC1 er involvert i utviklingen av livmorhalskreft. I livmorhalskreft, kan den lave uttrykk for STC1 forårsake svulst utvikling. Deretter fant vi at STC1 lav uttrykk fremmet cellevekst, migrasjon og invasjon etter nedregulering av STC1 av RNA interferens i livmorhalskreftceller. Videre fant vi også at STC1 overekspresjon hemmet celledeling og invasjon av livmorhalskreftceller. Videre STC1 overekspresjon lysfølsomt CaSki celler til narkotika. Disse dataene støtter det alternativet som STC1 kan hemme tumorprogresjon for livmorhalskreft. Tapet av funksjon STC1, som hemmer vekst og invasjonen av kreftceller, kan føre til tumorprogresjon i livmorhalskreft.
Arrangøren av STC1 genet inneholder HIF og NF-kB bindingssete. Det er rapportert at HIF-1α bundet til STC1 genpromotoren og p300 var nødvendig for et godt samspill med HIF-1 og oppregulering av STC1 mRNA og protein ekspresjon [30]. Chen et al antatt at STC1 delvis blokkert NF-kB-aktivering i TNF-a-behandlede humane koronare arterie endoteliale celler [31]. Law et al rapporterte at histone hyper-acetylering og rekruttering av aktivert NFkB stimulert STC1 genuttrykk i HT29 celler [22]. Forholdet mellom STC1 og NF-kB er forskjellig i forskjellige vev type. Vi viste at NF-kB p65 protein direkte bundet til STC1 arrangøren og regulert uttrykk for STC1 i livmorhalskreftceller. Disse resultatene har potensielle kliniske implikasjoner. Våre resultater tyder på at å øke uttrykket av STC1 bør være en god strategi for å hemme tumorspredning og invasjon og også kan være et mulig kombinert behandling med cellegifter i livmorhalskreft.
Fra over disse resultatene, vi fremmet modell for STC1-mediert inhiberende for tumorprogresjon (figur 5): etter aktivering av NF-kB p65, økt ekspresjon STC1. Den forhøyede STC1 Uttrykket redusert tumorprogresjon, og følgelig følsomheten av cervical kreft celler med forhøyet STC1 uttrykket til kjemoterapi stoffet øket. Dermed videre studier er å belyse dypt mekanismene som er involvert i STC1-mediert hemmende for tumorprogresjon og å utforske videre hva andre molekyler ta del i utviklingen.
Materialer og metoder
Prøver og Immunohistochemistry
Tilfeller av livmorhalskreft og tilstøtende normalt vev ble oppnådd på protokoller godkjent av Secondary Xiangya Hospital of Central South University. Clinicopathologic karakteristikker av de 15 pasienter med livmorhalskreft ble vist i tabell S1. Parafinsnitt ble deparaffinized med xylen og rehydrert i gradert alkohol. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved inkubering i 3% hydrogenperoksid ved RT i 10 min. Ikke-spesifikk binding ble blokkert med PBST inneholdende 10% geiteserum i 2 timer ved RT. STC1 antistoff (Santa Cruz Biotechnology) ble tilsatt til hvert objektglass og inkubert ved 4 ° C over natten. Etter tre vaskinger ble slides inkubert med seg (DAKO) i 40 min ved RT. Diaminobenzidin ble anvendt som et kromogen. Seksjoner ble kontra med hematoxylin, dehydrert, og montert. Evaluering av immunhistokjemiske lysbilder ble gjort med et Nikon Eclipse E800 mikroskop på 200 × forstørrelse. Intensiteten av reaktivitet ble scoret ved hjelp av en tre-lags system: 0-3 (0 = ingen farging, 3 = 100% flekker). Den immunreaktive resultatet av prøven ble bestemt ved prosentandelen av positive celler. Studien protokollen ble godkjent av etikkomiteen av Xiangya School of Medicine, Central South University.
Reverse Transcription-PCR (RT-PCR)
RNA isolert fra vev og celler ble omvendt transkribert og forsterkes ved bruk av ONE-STEP revers transkripsjon-PCR System (Fermentas). Primersekvensene som brukes er vist i Tabell S2. Etter oppvarming ved 95 ° C i 1 minutt, ble PCR utsatt for 30 sykluser (GAPDH, 25 sykluser) 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s, og 68 ° C i 1 min 30 sek med en endelig forlengelse ved 68 ° C i 10 min. Den integrerte tetthetsverdi (IDV) for hvert bånd ble bestemt ved bruk av gel-Pro Image Analyzer (Bio-Rad, Hercules, California), og forholdene mellom IDV-verdiene ble beregnet for å vurdere den relative ekspresjonsnivåer av mRNA.
Cell Culture
CaSki humane cervikale kreftceller ble opprettholdt ved vårt laboratorium og dyrket i Dulbecco-modifisert Eagle-medium (DMEM; Gibco) supplert med 10% bovint kalveserum (BCS) (Gibco). Celler ble opprettholdt ved 37 ° C i en atmosfære av fuktig luft med 5% CO2.
Vector Bygg og Cell Transfeksjon
For å slå ned STC1 uttrykk, brukte vi pRNAT-U6.1 /Neo vektor som koder for en liten hårnål RNA rettet mot det mål-genet i CaSki-celler. Måltallene sekvenser for STC1 var 5’TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA -3 «(CaSki /siRNA). Vi brukte negativ universal kontroll som en negativ kontroll (CaSki /NC).
For transfeksjon av plasmid ekspresjonsvektor som koder for humant STC1 DNA-sekvensering som inneholder den åpne leseramme STC1 flankert av Hindlll-Xhol-restriksjonsseter ble PCR-amplifisert fra CaSki celler. Primer sekvenser som ble brukt var fornuftig 5’GAAAGCTTATGCTCCAAAACTCAG -3 «og antisense 5’TTCTCGAGTTATGCACTCTC ATGG -3». Det resulterende fragmentet ble satt inn i Hindlll /XhoI -precut pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) for å generere pcDNA3.1- STC1. Den ønskede sekvens ble bekreftet ved direkte DNA-sekvensering.
For transfeksjon ble cervikale kreftceller dyrket til 70% konfluens og transfektert i serumfritt medium i 6 timer med lipofektamin 2000 (Invitrogen) og vektor. Etter 48 timer ble cellene høstet, etterfulgt av begrenset fortynning i 96-brønners plater for generering av enkeltcellekloner. Tre uker senere, ble nivåene av STC1 ekspresjon i cellekloner som hadde blitt infisert med vektorene, karakterisert for STC1 protein og mRNA.
MTT og kolonidannelse
MTT-analysen ble utført som rapportert tidligere [32]. For kolonidannelsesbestemmelsen, celler ved 100 celler per brønn i 60 mm plater ble dyrket i 10% FBS DMEM ved 37 ° C, 5% CO2 i 3 uker. De cellekolonier ble vasket to ganger med PBS, fiksert med 4% paraformaldehyd i 15 minutter og farget med Gimsa i 30 minutter. Individuelle kloner med mer enn 50 celler ble tellet. Clone forming effektivitet for enkelte type celler ble beregnet i henhold til antall kolonier /antall inokulert celler × 100%.
ett lag Wound Healing og Invasion Analyser
For mono sårbehandling analysen, cellene ble dyrket i 10% FBS DMEM i 60 mm plater. Etter at cellene nådde sub-konfluens, ble monolagcellene såret ved avskraping av cellene og deretter dyrket i medium i 48 timer. Den migrerte avstand på CaSki-celler ble overvåket og fotografert under et mikroskop. Avstandene mellom cellemigrering ble beregnet ved å trekke avstanden mellom lesjon kantene etter 48 timer fra den avstanden, målt ved 0 timer. Den relative avstand migrerende celler måles ved avstanden av cellemigrering /avstanden målt ved 0 timer. For invasjon assay, cellene ved 10
4 /brønn ble sådd ut i de øvre kamrene i 200 ul FBS-fritt DMEM og de nedre brønnene ble fylt med 500 ul 10% FBS DMEM for å indusere cellemigrering. Etter inkubering i 24 timer ble cellene på filterflaten fiksert med 4% formaldehyd, farget med 0,5% krystallfiolett og undersøkt under et mikroskop. Celler i minst seks tilfeldige mikroskopiske felt (200 x) ble tellet.
Western Blot analyse
Cellene ble vasket med kald fosfatbufret saltløsning (PBS) og lyseres i Laemmli-buffer (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 50 mM ditiotreitol og 0,01% bromfenol-blått) i 5 minutter ved 95 ° C. Cellelysater ble analysert ved SDS /PAGE og elektroforetisk overført til polyvinylidendifluorid-membran. Blottene ble probet med spesifikke antistoffer av en sekundær deteksjonstrinnet. De immunreaktive proteiner ble avslørt av en ECL kit. Western blot ble utført ved anvendelse av følgende antistoffer: Kanin anti-STC1-antistoff (Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-fosfo-NF-kB p65-antistoff (Cell Signaling Technology), kanin anti-PARP-antistoff (Cell Signaling Technology), kanin anti- -Caspase-3-antistoff (Cell Signaling Technology).
in vivo tumorvekst analysen
påvirkningen av STC1 på svulst utvikling av livmorhalskreft in vivo ble undersøkt. Celler på 5 × 10
6 per mus ble injisert subkutant i 4 uker gamle Balb /c nakne mus (n = 4 per gruppe, Shanghai Laboratory Animal Center, Shanghai, Kina). De eksperimentelle parene ble gjort i forskjellige mus. Utvikling og vekst av solide svulster ble overvåket ved å måle tumorstørrelse ved hjelp av en verniercaliper blindt hver fem dager for en 40-dagers periode. Tumorvolumet ble beregnet ved hjelp av formelen: tumor volum (mm
3) = bredde (mm)
2 × lengde (mm) × 0,5 [33]. Ved slutten av forsøket ble alle musene avlivet og enkelte kreft vekter ble målt ved hjelp av en balanseaksel.
Chromatin Immunoutfellingsunder Analyser
ChIP analysen ble utført ved bruk av chip analysesett i henhold til produsentens anvisninger (Upstate bioteknologi, Lake Placid, New York) og antistoff mot NF-kB p65 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). Kromatin immunoutfellingsstudier primere ble konstruert for å amplifisere et fragment inneholdende promotor STC1. Primersekvensene som brukes er vist i Tabell S2.
Statistical Analysis
Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. Forskjellen mellom gruppene ble bestemt ved ANOVA analyse og sammenligning mellom to grupper ble analysert ved t-test ved bruk av GraphPad Prism programvare versjon 4.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, California). En verdi på P 0,05 ble ansett som statistisk signifikans
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1..
Clinicopathologic karakteristikker av de 15 pasienter med livmorhalskreft.
doi: 10,1371 /journal.pone.0053989.s001 plakater (DOC)
Tabell S2.
Primer for RT-PCR.
doi: 10,1371 /journal.pone.0053989.s002 plakater (DOC)
