Abstract
Endret uttrykk og funksjon av lektin-lignende oksidert low-density lipoprotein reseptor-1 (LOX -1) er forbundet med flere sykdommer som endotelial dysfunksjon, aterosklerose og fedme. I disse patologi, oxLDL /LOX-1 aktiverer signalveier som fremmer celledeling, celle motilitet og angiogenese. Nyere studier har indikert at
OLR
en mRNA er over-uttrykt i stadium III og IV av menneskelige prostata adenokarsinomer. Det gjenstår imidlertid funksjonen av LOX-1 i prostatakreft angiogenese som skal bestemmes. Vårt mål var å analysere bidrag oxLDL og LOX-1 til tumor angiogenese ved hjelp c4-2 prostatakreftceller. Vi analyserte uttrykk for pro-angiogene molekyler og angiogenese på prostatakreft tumorxenotransplantater, ved hjelp av prostata kreft cellemodeller med overekspresjon eller knockdown av LOX-1 reseptoren. Våre resultater viser at aktiveringen av LOX-1 under anvendelse av oxLDL øker celleformering, og ekspresjonen av de pro-angiogene molekyler VEGF, MMP-2 og MMP-9 i en doseavhengig måte. Merkbart, var disse effektene forhindret i c4-2 prostatakreft modell når LOX-1 uttrykk ble slått ned. Den angiogene effekten av LOX-1 aktivert med oxLDL ble ytterligere demonstrert ved bruk av aorta-ring analysen og xenograft modell av tumorveksten på chorioallantoic membran av kyllingembryoer. Derfor foreslår vi at LOX-1 aktivering av oxLDL er en viktig begivenhet som forbedrer tumor angiogenese i menneskelige prostata kreft celler
Citation. González-Chavarría jeg, Cerro RP, Parra NP, Sandoval FA, Zuñiga FA, Omazábal VA, et al. (2014) lektin-Like Oksidert LDL reseptor-1 er en Enhancer av Tumor Angiogenese i Human prostata kreft celler. PLoS ONE 9 (8): e106219. doi: 10,1371 /journal.pone.0106219
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 07.02.2014; Godkjent: 29 juli 2014; Publisert: 29 august 2014
Copyright: © 2014 González-Chavarría et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av Fondecyt Grant 1121159, Conicyt, Chile. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lektin-lignende oksidert low-density lipoprotein reseptor-1 (LOX-1) er et medlem av åtseldyr reseptor familien [1], som formidler anerkjennelse og internalisering av oksidert LDL (okse-LDL) [2 ]. LOX-en er hovedsakelig uttrykt i endotelceller, selv om denne reseptoren kan også bli funnet i en rekke andre celletyper slik som monocytter, cardiomiocytes, adipocytter, trombocytter, makrofager og vaskulære glattmuskelceller [3]. Den endrede ekspresjon og funksjon av LOX-1-reseptoren har blitt assosiert med sykdommer slik som endotelial dysfunksjon, aterosklerose, fedme, og nylig også med tumorutvikling [4] – [6]. Aktiveringen av LOX-1 ved oxLDL i humane endotelceller induserer ekspresjon av adhesjonsmolekyler; pro inflammatoriske signalveier; og pro-angiogene proteiner, for eksempel metalloproteinase-2 og 9 (MMP-2 og MMP-9), angiotensin II (Ang II) og vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [7] – [10]. Angiogenese er en fysiologisk prosess, som bestemmer dannelsen av nye blodkar fra hatt kontakt fartøy [11]. Det anses som et normalt fenomen under embryonal utvikling, vekst av organismen og sårheling [12]. Imidlertid er angiogenese også en grunnleggende prosess for utvikling og progresjon av flere typer av tumorer [13]. Tumor angiogenese er regulert av balansen mellom pro- og anti-angiogene molekyler utgitt av tumorceller og stromale tumorceller som fibroblaster og makrofager, som bestemmer innkobling av tumor angiogenese [14], [15]. Den genekspresjon i tumor angiogenese ytterligere reguleres i respons på en rekke stimuli, deriblant hypoksi, oksidativt stress og inflammasjon. I denne forbindelse mellom stimuli og pro-angiogene proteinekspresjon, og VEGF blitt identifisert som en viktig faktor i tumor angiogenese [16], [17]. Hypoksi, cytokin sekresjon og oksidativt stress i tumorceller øke ekspresjonen av VEGF, og dermed indusere tumor angiogenese [18].
LOX-1 er blitt foreslått som en mulig kobling mellom fedme, dyslipidemi, og kreft [19] . Konsekvent, har kliniske tilstander av fedme og aterosklerose vært knyttet til tumorprogresjon og metastase i prostata kreft [20] – [22]. Pasienter diagnostisert med metabolsk syndrom, kroniske betennelsessykdommer og autoimmune tilstander viste en høy forekomst og aggressivitet i tumor utvikling [23]. Faktisk har nyere studier vist en økt uttrykk av LOX-1 i humane prostata adenokarsinomer i etapper III og IV [5], som krever nye vascularization og angiogenese for lokal invasjon. Men den spesifikke effekten av LOX-1 i tumor angiogenese har ennå ikke blitt beskrevet.
Dette arbeidet viser at LOX-1 og dens aktivering ved hjelp av oxLDL indusere tumor angiogenese og stimulerer celleproliferasjon i prostatakreftceller. Nærmere bestemt demonstrerer vi at aktiveringen av LOX-1 under anvendelse av oxLDL fremmer celle-proliferasjon, og ekspresjon av pro-angiogene molekyler VEGF, MMP-2 og MMP-9 i en doseavhengig måte. Spesielt, ble disse effektene forhindret i c4-2 prostatakreft modell når LOX-1 uttrykk ble slått ned. Videre ble den angiogene effekten av LOX-1 aktivert ved oxLDL demonstrert ved bruk av aorta-ring analysen og xenograft modell av tumorveksten på chorioallantoic membraner (CAM) av kyllingembryoer. Derfor foreslår vi at LOX-1 aktivering av oxLDL er en relevant aktivering sti som kreves for angiogene forbedring av svulst utvikling av menneskelige prostata kreft celler.
Resultater
Generering av prostatakreftcellelinjer overekspresjon LOX-1 og shRNA mot olr1
c4-2 prostatakreftcellelinjer ble transduced med lentiviral uttrykk vektor LvCW-LOX-1, som koder for
olr1
genet under kontroll av cytomegalovirus promoter (CMVP), og isoleres ved hjelp av begrensende fortynning kloningsmetode. Overekspresjon av LOX-1 i c4-2 celler ble bestemt ved bruk av real-time PCR, immunoblotting, og immunfluorescens. Syv forskjellige kloner med LOX-1 overekspresjon ble oppnådd, av disse ble 3 kloner valgt etter Western blot eksperimenter og analysert ved hjelp av real-time PCR (Fig. 1A og D). Den valgte celle klon c4-2 /LOX-1 (+) (klon 5) hadde en 1,2 x 10
3 ganger uttrykk i løpet av basal LOX-1 mRNA-nivåer av det native c4-2 cellelinje eller c4-2 /GFP overekspresjon kontroll. I tillegg ble LOX-1 overekspresjon i denne klonen immunolocalized i cellemembranen ved hjelp av konfokal mikroskopi (fig. 1F). For å bestemme hvorvidt overekspresjon mediert av lentivirale partiklene hadde en effekt på ekspresjonen av LOX-1, ble en overekspresjon kontroll (c4-2 /GFP-celler) som er generert. Vi har ikke observert signifikante endringer i ekspresjon av LOX-1 i denne kontroll sammenlignet med det native c4-2-cellelinjen (fig. 1C og F).
A) Western blot for LOX-1 (40 kDa ) uttrykk i menneskelige Cap kloner med overekspresjon av LOX-1. B) Western blot for LOX-1 (40 kDa) uttrykk i menneskelige prostata kreft cellekloner med LOX-1 knockdown C) Real-time PCR for LOX-1 uttrykk i tre kloner med overekspresjon av LOX-1. D) Real-time PCR for LOX-1 ble bestemt i tre kloner som uttrykker shRNA /LOX-1 (A), og tre kloner som uttrykker shRNA /LOX-1 (B). Dataene representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo, og statistisk analysert ved anvendelse av en-veis analyse av varians, og Dunnetts post-test; (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p≤0.05
).
LOX- en knockdown i c4-2 celler ble oppnådd ved hjelp av en shRNA mot mRNA kodet av
olr1
genet. C4-2 celler ble transduced med lentiviral vektorer for uttrykket av hver shRNA (LVW-U6 /
OLR
1) sekvens mot
olr1
under kontroll av U6 promoter. De transduserte celler ble isolert ved hjelp av begrensende fortynning kloningsmetode, og LOX-en ned-ekspresjon ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR, immunoblotting, og immunfluorescens (fig. 1). To forskjellige shRNA sekvenser, shRNA-A og shRNA-B, ble analysert. Tre forskjellige kloner av shRNA-A og shRNA-B LOX-1 knockdown ble oppnådd. Den valgte shRNA-B klon ble redusert LOX-1-ekspresjon ved 98% sammenlignet med basal LOX-1 mRNA-nivåer av det native c4-2-cellelinjen eller c4-2 /LvEmpty knockdown kontrollcellelinje (Fig. 1B-E). Videre ble ned-uttrykk av LOX-1 i denne klonen verifisert av immunhistokjemi (Fig. 1F). For å avgjøre om knockdown mediert av lentiviral partiklene hadde en effekt på uttrykk for LOX-1 en knockdown kontroll (c4-2 /LvEmpty) ble generert. Vi observerte ikke vesentlige endringer i uttrykket av LOX-1 i denne kontrollen sammenlignet med den opprinnelige c4-2 cellelinje (Fig. 1C og F).
prostata kreft cellemodeller oppnådd, nemlig c4-2 /LOX-1 (+) [klon 5], c4-2 /LOX-1 (-) [klon shRNA-B1] og naturlig c4-2 cellelinje, ble brukt som modeller i alle analyser utført i dette arbeidet
oxLDL har ikke cytotoksiske effekter i prostatakreftcellemodeller
Starter fra oksidasjonen av nativt LDL fra normolipemic pasient vi oppnådd en fraksjon av middels nivå oksidert LDL (oxLDL) som ble undersøkt ved dannelse av konjugerte diener og natriumboratbuffer elektroforese i 1% agarose (fig. 2A). For å avgjøre om den oppnådde oxLDL hadde noen cytotoksiske effekten vi inkuberes prostata kreft cellemodeller med oxLDL (25 til 150 mikrogram /ml) i løpet av 12 timer. Våre resultater viste ingen cytotoksiske virkninger av oxLDL på en hvilken som helst av de prostata cellemodeller for konsentrasjonsområdet analysert (fig. 2B). Imidlertid ble det observert en betydelig økning i celleproliferasjon av c4-2, c4-2 /GFP, c4-2 /LvEmpty og c4-2 /LOX-1 (+) cellemodeller for alle oxLDL anvendte konsentrasjoner, sammenlignet med den samme ubehandlede prostata kreft cellemodeller. Dessuten ble det observert en signifikant økning i celleproliferasjon i c4-2 /LOX-1 (+) sammenlignet med c4-2, eller overekspresjon og knockdown kontroller for alle oxLDL konsentrasjoner analysert. Imidlertid proliferativ effekt ble fullstendig forhindret i c4-2 /LOX-1 (-) cellemodell, over alle konsentrasjoner som ble analysert (figur 2B).
A) oxLDL erholdt fra humant plasma ble oksydert med 7. uM av CuSO
4, overvåkes ved hjelp av spektrofotometri ved 243 nm λ og underkastet elektroforese i 1% agarosegeler med natriumboratbuffer. B) Cytotoksisitet analyse av prostatacancercellemodeller behandlet med 25, 50 og 100 mikrogram /ml oxLDL i løpet av 12 timer. Dataene representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer og statistisk analysert ved hjelp av enveis ANOVA og Dunnetts post-test (* eller #
p≤0.05
).
Den oxLDL ligand øker uttrykket av pro-angiogene markører
prostatakreft c4-2-cellelinje ble inkubert med økende konsentrasjoner av oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) i løpet av 12 timer, og ekspresjon av det pro-angiogene markører VEGF , MMP-2 og MMP-9 ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR. Våre resultater viste en signifikant økning i ekspresjonen av VEGF, MMP-2 og MMP-9, proporsjonale med oxLDL konsentrasjonene som benyttes, med en respektiv 3,5-,, 2.5, og 3-dobling, når 100 mikrogram /ml av oxLDL var anvendes. Videre LOX-1-ekspresjon ble også øket proporsjonalt med konsentrasjonen av oxLDL anvendt, som viser et tre-gangers økning ved 100 ug /ml (Fig. 3).
Relativ kvantifisering av LOX-1, VEGF, MMP -2, og MMP-9-ekspresjon ble utført ved anvendelse av sanntids-PCR i human prostatacancer cellelinje c4-2 inkubert med økende konsentrasjon av oxLDL (25, 50, 100 ug /ml) i 12 timer. Dataene representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo, og statistisk analysert ved anvendelse av en-veis analyse av varians og Dunnet post-test; (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p≤0.05
).
Økt uttrykk for pro-angiogene markører i prostatakreftceller krever aktivering av LOX-1 av oxLDL
prostatakreftceller modeller c4-2 /LOX-1 (-) og c4-2 /LOX-1 (+) ble inkubert med 100 ug /ml oxLDL i løpet av 12 timer, og ekspresjon av de pro-angiogene markører (VEGF, MMP-2, MMP-9) ble analysert. Ekspresjon av VEGF, MMP-2 og MMP-9 i c4-2 cellelinje ble inkubert med oxLDL økt betraktelig (2-, 2-, og 2,5 ganger henholdsvis), sammenlignet med ubehandlede c4-2-celler (fig. 4A ). Interessant, uttrykket av pro-angiogene markører indusert av oxLDL, ble hindret i c4-2 /LOX-1 (-) prostatakreft cellemodell. På den annen side, stimulering av c4-2 /LOX-1 (+) med oxLDL betydelig økt ekspresjon av alle pro-angiogene markørene analysert (VEGF og MMP-2, 2-fold; MMP-9 3-fold), sammenlignet med ubehandlede celler c4-2. Ekspresjon av VEGF, MMP-2 og MMP-9 i c4-2 /LOX-1 (+) celler, ble også signifikant øket (1,6-, 1,5-, og 1,4 ganger, henholdsvis), selv i fravær av oxLDL stimulering, og redusert med 20%, 50% og 20% i c4-2 /LOX-1 (-) celler, sammenlignet med den endogene ekspresjon i c4-2 cellelinjen uten oxLDL stimulering (figur 4A.)
c4-2, c4-2 /LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) human prostatacancercellemodeller ble inkubert i med eller uten oxLDL [100 mikrogram /ml] i 12 timer. A) Relativ kvantifisering av VEGF, MMP-2 og MMP-9-ekspresjon ble analysert ved hjelp av sanntids-PCR. Dataene representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter utført in triplo og statistisk analysert ved hjelp av en-veis analyse av varians og Dunnet post-test; (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p≤0.05
). B) Western blot for VEGF uttrykk (30 kDa). C) Zymogram for MMP-2 (72 kDa pro-skjema 64 kDa aktiv-form) og MMP-9 (92 kDa pro-skjema. 84 kDa aktiv-form) aktiviteter i kondisjonert medium
Den kondisjonerte media fra prostata kreftcellemodeller inkubert med oxLDL [100 mikrogram /ml] ble oppsamlet og konsentrert. Senere uttrykk VEGF ble evaluert ved immunblotting, og aktiviteten til MMP-2 og MMP-9 ble analysert ved zymografi. Våre resultater tiltalt som VEGF uttrykk ble økt i c4-2 celler inkubert med oxLDL, når man sammenligner med c4-2 celler uten oxLDL, mens uttrykket av VEGF ble forhindret i c4-2 /LOX-1 (-) celler inkubert med oxLDL [ ,,,0],100 ug /ml]. Dessuten ble VEGF ekspresjon øket i c4-2 /LOX-1 (+) celler med o uten oxLDL behandling (Fig. 3B). Analyse av metalloproteinase-aktivitet viste en økning i den gelatinase aktiviteten av MMP-2 og MMP-9 i det kondisjonerte medium fra c4-2 celler inkubert med oxLDL, og er forhindret i kondisjonert medium fra c4-2 /LOX-1 (-) -celler inkubert med oxLDL. Videre LOX-1 overekspresjon i c4-2 /LOX-1 (+) celler viste en økt aktivitet av MMP-2 og MMP-9 med eller uten oxLDL stimulering (Fig. 4C).
Aktivering av LOX -1 av oxLDL fremmer dannelse av spire i mus aortaringer
Vi analyserte c4-2 modell celler inkubert med oxLDL for å bestemme om generering av endoteliale spirer kan bli stimulert i den aortiske ring analysen av differensial sekresjon av pro-angiogene markører. Den c4-2, c4-2 /LOX-1 (-) og c4-2 /LOX-1 (+) cellemodeller ble inkubert med 100 pg /ml oxLDL i løpet av 12 timer, og det kondisjonerte medium ble oppsamlet, konsentrert og anvendes for behandling av mus aortaringer.
stimulering av aortiske ringer med kondisjonert medium fra c4-2 og c4-2 /LOX-1 (+) celler behandlet med oxLDL betydelig forbedret generering av spirer sammenlignet den ubehandlede c4-2-cellelinjen. Forskjellene mellom aorta-ring spire generasjon ved anvendelse av kondisjonert medium fra c4-2 /LOX-1 (-) med eller uten oxLDL stimulering, var ikke signifikant. Dermed overuttrykk av LOX-1 forfremmet spirer generasjon med eller uten oxLDL stimulering (Fig. 5A).
A). Mikrofotografering av mus aortaringer og kvantifisering av spirer pr ring inkubert med kondisjonert medium fra prostatakreft c4-2, c4-2 /LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) celler tidligere stimulert med eller uten oxLDL [100 ug /ml]. B) LOX-1 aktivering av oxLDL fremmer tumor angiogenese i Cap xenograft modeller på chorioallantoic membran av kylling embryoer. Mikrofotografering og kvantifisering av tumorblodkarene i xenotransplantater av c4-2, c4-2 /LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) celler, som på forhånd inkubert med eller uten oxLDL [100 mikrogram /ml] i chorioallantoic membraner av 10 dager gamle kylling embryoer. Dataene representerer gjennomsnitt ± S.D. av tre uavhengige eksperimenter utført i tre eksemplarer, og ble statistisk analysert ved hjelp av enveis variansanalyse med Dunnetts post-test (***
p≤0.001
, **
p≤0.01
, *
p≤0.05
).
Aktivering av LOX-1 av oxLDL fremmer angiogenese i prostata kreft celletransplantater på chorioallantoic membran av kylling embryoer
for angiogenese studier på chorioallantoic membran (CAM) av kyllingembryoer, prostatakreft-cellekloner c4-2, c4-2 /LOX-1 (-), og c4-2 LOX-1 (+) ble pre-inkubert med oxLDL 100 ug /ml for 2 timer. Omtrent 1 × 10
6 celler ble deretter inokulert på CAM av 10 dager gamle kylling embryoer. Fem dager etter inokulering, ble tumorene ekstrahert fra CAM og omfanget av tumor vaskularisering ble analysert. C4-2-celler pre-inkubert med oxLDL viste en signifikant økning i tumor vaskularisering sammenlignet med de ubehandlede c4-2 cellene. Videre, LOX-1 overekspresjon i c4-2 /LOX-1 (+) celler viste også en økt tumor vaskularisering når cellene ble inkubert med eller uten oxLDL sammenlignet med de ubehandlede c4-2 cellene. Spesielt, c4-2 /LOX-1 (-) celler behandlet med oxLDL viste ingen vesentlige variasjoner i tumor vaskularisering, sammenlignet med både c4-2 og c4-2 /LOX-1 (-) ubehandlede celler (Fig. 5B).
olr1
genet er overuttrykt i felles array-datasett fra metastatisk prostatakreft
med sikte på å fastslå om de observerte effekter på tumor angiogenese mediert av oxLDL /LOX-1 i c4-2 prostata kreft celler hadde noen klinisk relevans hos pasienter, brukte vi NCBI Gene Expression database Omnibus (GEO) for å bestemme uttrykket av
olr1
reseptor i GDS2545 datasettet, som har ulike stadier av prostatakreft progresjon . Denne informasjonen gjør at den komparative analysen av menneskelige metastatisk prostatakreft, primær prostatakreft og normal donor vev. I denne sammenheng uttrykk for
OLR-en
ble funnet å være signifikant økt i primær prostatakreft og metastatisk prostatakreft sammenlignet med normal prostata vev (Fig. 6).
uttrykk for
olr1
på ulike stadier av prostatakreft tumorprogresjon ble bestemt ved hjelp av den offentlige databasen GDS2545 på NCBI Gene Expression Omnibus (GEO). Dataene representerer gjennomsnitt ± S.E. av humant normalt donor vev n = 17, primær prostatakreft n = 64 og metastatisk prostatakreft n = 50, som ble statistisk analysert ved hjelp av en
t
test (
* p≤0.05
).
Diskusjoner
i dette arbeidet vi demonstrere, for første gang, rollen av LOX-1 reseptoren og dens aktivisering hjelp oxLDL, på spredning og angiogenese av menneskelig C4 2 prostata kreft celler. Nærmere bestemt demonstrerer vi at en økning i oxLDL konsentrasjoner fremmet celleproliferasjon og i betydelig grad og øker proporsjonalt ekspresjon av pro-angiogene markører VEGF, og metalloproteinases MMP-2 og MMP-9. I tillegg cellular stimulering av LOX-1 med oxLDL også økt uttrykk av LOX-1 reseptoren, generere en positiv feedback-loop av LOX-1 uttrykk.
Foreningen av LOX-1 og oxLDL med sykdommer , slik som endotelial dysfunksjon, aterosklerose, akutt myokardialt infarkt, slag, diabetes, hypertensjon, metabolsk syndrom og fedme, er blitt grundig undersøkt [3], [5], [24]. Fedme, i seg selv, har også blitt forbundet som en viktig risikofaktor for arteriosklerose, diabetes mellitus type 2 og kreft, så vel som andre sykdommer [25]. Kliniske studier antyder en sammenheng mellom høy serum oxLDL konsentrasjoner og en økt risiko for å utvikle tykktarmskreft [26]. Videre har oxLDL konsentrasjoner også vist seg å øke i vektige pasienter [27].
I samsvar med disse funnene, hadde tidligere rapporter vist at fedme er forbundet med økt risiko for å utvikle høyt ondartede og metastatisk prostatakreft [21 ], [28]. Videre, i den transgene Adenokarsinom av musen Prostata (TRAMP) musemodell, mating av musene med en hypercaloric diett, øker histologiske grad av prostata tumorer, antallet av metastaser, tumormasse, og graden av vaskularisering, sammenlignet å trampe mus matet med normal diett [29].
det er en spesiell relevans i forholdet mellom kolesterol og prostatakreft, fordi androgen og andre steroidhormoner syntetiseres fra kolesterol, og er grunnleggende i utvikling og vedlikehold av prostatakreft [30]. Under fysiologiske forhold androgener er involvert i oppkjøpet av sekundære kjønnskarakteristika, vekst og normal utvikling av prostata. Men de har også vært forbundet med tumorprogresjon i prostata kreft [31]. Således er mange av de ildfaste prostatakreft til androgen deprivasjon, økning kolesterol opptak, som er det primære substrat for androgen syntese [31], [32]. I denne forbindelse er det viktig kilde av kolesterol til LDL tumorceller, som hovedsakelig endocyted av LDL-reseptorer (LDLR) [33], [34]. Men anser vi at oksidasjonsmiddel og pro-inflammatorisk svulstens mikromiljø rik på ROS [35] kunne være fremme LDL modifisering av lipoperoxidation [36], unngå anerkjennelse av LDLR og favorisering sitt opptak av åtseldyr reseptorer av oxLDL. I henhold til dette, analyserte vi ekspresjonen av reseptorer for scavengers modifiserte lipoproteiner og ekspresjonen av LDL-reseptoren i den GDS2545 datasettet, oppnådd fra offentlig database (GEO-profil) [37]. Deri, observerte vi en betydelig økning i uttrykket av de scavenger reseptorer
olr1, skjerf Hotell og
scarb1
i primærsvulster og metastasering av prostata kreft, og en betydelig økning i uttrykket av
CD36 Hotell og
olr1
reseptor i prostatakreft metastaser i forhold til normal prostata vev. Interessant, ekspresjonen av LDLR viste en betydelig reduksjon i sin ekspresjon på tumormetastase og ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom primær prostata-tumorer og normalt vev prostata (data ikke vist).
i betraktning dette, høye konsentrasjoner av sirkulerende LDL hos overvektige pasienter med prostatakreft kunne bidra til tumorprogresjon gjennom LOX-1-aktivering ved oksydasjon modifisert LDL (oxLDL) som er generert i den oksyderende mikromiljøet, som er tilstede i prostata svulst stroma. I denne forbindelse genererte vi et middels nivå oksidert LDL, som bør være representativt for oxLDL til stede i tumoren mikromiljøet. Våre resultater viste at oxLDL brukt i denne studien har ingen cytotoksisk effekt i noen av de c4-2 prostatakreftceller modeller analysert. I denne forbindelse er det blitt rapportert at oxLDL har en differensial cytotoksisk effekt avhengig av celletypen. Kreftceller linjer K562 /AO2 (leukemi) og EC9706 (esophageal carcinoma) behandlet med oxLDL presentere en høyere rate av celle levedyktighet i forhold whit ikke-kreftceller som HUVEC (human navlevene endotelceller) [38].
Interessant nok ble det observert en betydelig økning i celleproliferasjon av c4-2, c4-2 /GFP, c4-2 /LvEmpty og c4-2 /LOX-1 (+) cellemodeller, over hele området av oxLDL konsentrasjoner analysert sammenlignet med de ubehandlede cellelinjer. Også, c4-2 /LOX-1 (+) cellemodell viste en høyere spredning sammenlignet med kontrollceller modellene c4-2, c4-2 /GFP, og c4-2 /LvEmpty, for alle konsentrasjoner analysert. Imidlertid ble den proliferative virkning av oxLDL hindres i c4-2 /LOX-1 (-) cellemodell, noe som indikerer at denne effekten er nært knyttet til aktivering av LOX-1-reseptoren ved oxLDL. I denne forstand, har proliferativ effekt fremmet av oxLDL /LOX-1 er beskrevet i muskelceller, endotelceller og nylig i brystkreft celler gjennom aktiveringsveier som involverer p38 (MAPK), P44 /42 MAPK, og NF- kB [6 ], [39]. Men de proliferative effekter på prostatakreftceller hadde ennå ikke blitt beskrevet.
In vitro
studier har vist at oxLDL stimulering av humane navlevene endotelceller (HUVECs) aktiverer uttrykk for LOX -1 reseptor, genererer en overekspresjon av adhesjonsmolekyler, inflammatoriske proteiner, og MMP-2 og MMP-9-metalloproteinaser, [8], [40], [41]. Videre endotelceller fra kveg-aorta ble behandlet med ox-LDL fremme kapillær formasjonen reguleres ved LOX-1, og aktivering av NADPH oksidase /MAPKinase /NF-kappa B, med en økning av VEGF-ekspresjon [9], [42]. Våre resultater viste at ekspresjon av VEGF, og aktivering av MMP-2 og MMP-9, er nært mediert av oxLDL /LOX-1 i c4-2 prostatakreft-cellelinje.
bekrefter også, ved hjelp aorta ring analysen og kyllingembryo CAM xenograft modell, at økningen av VEGF, MMP-2 og MMP-9 ekspresjon mediert av LOX-1 /oxLDL har en tumoral angiogen effekt både
in vivo
og
ex vivo
på c4-2 prostatakreftceller modeller. Dette er i tråd med tidligere
ex vivo
studier, der pro-angiogene faktorer som angiotensin II ikke induserer kapillær spire formasjonen i Aortaringene isolert fra
OLR-en KO
mus [10]. Likeledes ablasjon av
OLR-en
genet markert redusert koroidal neovaskularisering i murine modeller av laser-indusert skade [43]. Signalering indusert ved oxLDL /LOX-1 kan ha en kritisk rolle i prosessen med tumor angiogenese fordi microvessel tetthet er en viktig prognostisk indikator i prostata cancer, og er assosiert med klinisk stadium, progresjon, metastase, og prostatakreft overlevelse [44], [45].
som konklusjon, viser vi en direkte sammenheng mellom fedme faktorer, slik som LOX-1 /oxLDL og forbedring av ekspresjon av spredning og pro-angiogene markører, som har en biologisk virkning på tumor angiogenese
ex vivo Hotell og
in vivo
i c4-2 prostatakreftceller modeller. Derfor foreslår vi at LOX-1 kan være en viktig regulator i prostatakreftceller, med mulighet til å forbedre tumor angiogenese mot kreft og metastaser hos overvektige pasienter.
Materialer og metoder
Cellekultur
Humant c4-2 prostatakreft [46], [47] og HEK-293 FT-celler ble dyrket i RPMI 1640 og DMEM-medium henholdsvis, supplert med 2 mM L-glutamin (Hyclone), 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin streptomycin (GIBCO).
Dyr
BALB /c-mus ble erholdt fra Harlan Winkelmann GmbH (Borchen, Tyskland) og holdt under kontrollerte og sterile omgivelses forhold. Fire mus (8-12 uker gamle) ble anvendt for eksperimentene.
Egg fra
Gallus gallus domesticus
ble hentet fra ISP (Instituto de Salud Pública, Chile), ble vasket med en 7 uM kobbersulfatoppløsning for å forhindre soppforurensning, og ble inkubert ved 37,5 ° C og 80% relativ fuktighet i 10 dager. Eggene ble snudd periodisk med en automatisk to turner (GQF Hova-bator Manufacturing Co. USA) for å hindre vedheft og ruptur av CAM fra eggeskallet. Embryoet inokulert med c4-2 celler modeller ble inkubert ved 37,5 ° C, 80% luftfuktighet og 5% CO
2 i 5 dager.
Alle studier med eksperimentering med dyrene var i samsvar med retningslinjene og anbefalinger fra NIH guide for omsorg og bruk av forsøksdyr (dagens utgave) og fulgt retningslinjene angitt i den chilenske biosikkerhet Manual of Conicyt (National Agency for vitenskap og teknologi). De eksperimentelle protokollene ble utarbeidet av forfatterne og godkjent av Institutional Ethics Committee. I alle tilfeller tilsyn av veterinærmyndigheter fra School of Biological Sciences, Universidad de Concepción, Chile, var garantert. Når musene ble brukt til eksperimentering, ble de plassert i individuelle rom og passende fôring, vannforsyning og helseovervåking ble permanent gitt. Dyr avlives ble menneskelig håndtert. De ble utsatt for innledende anesthetization og kaliumklorid injeksjon intravenøst for å unngå lidelse.
ox-LDL forberedelse
Blodprøver (20 ml) ble hentet fra fire frivillige, som undertegnet en skriftlig samtykke. Denne protokollen ble godkjent av etikkomiteen av Universidad de Concepción, Chile. Humant LDL (1,019 til 1,063 g /ml) ble isolert fra blodplasma fra friske forsøkspersoner etter sekvensiell ultrasentrifugering ved 4 ° C. LDL ble dialysert mot filtrert (0,45 um) LDL-buffer (150 mmol /l NaCl, 0,24 mmol /l EDTA, pH 7,4), skiftet tre ganger, i 36 timer ved 4 ° C. Etter grundig dialyse mot PBS, med 3 endringer, for 36 timer ved 4 ° C, ble oksidert LDL fremstilt ved inkubering av renset LDL med 7 uM CuSO
4 i 3 timer ved 37 ° C. Modifisering av LDL ble overvåket ved hjelp av spektrofotometri ved genereringen av konjugerte diener ved λ 243 nm, og deretter en elektroforese i 1% agarose-gel i natriumboratbuffer ble realisert for å bestemme endringen i den elektroforetiske migrasjonen av oxLDL sammenlignet med LDL. Gelen ble farget med 0,25% Coomassie Blue R-250, i løpet av to timer, og avfarget i 4 timer ved hjelp av 5% MeOH, 7,5% HOAc, 87,5% H
2o. Båndene av LDL og oxLDL ble analysert med Odyssey CLX instrument (LI-COR, EEUU).
Cytotoksisitet evaluering
prostatakreftcellemodeller ble inkubert med 25, 50 og 100 mikrogram /mL oxLDL i løpet av 12 timer. Etter dette ble mediet fjernet, ble kulturene vasket med fosfat-bufret saltvann, og cellenes levedyktighet ble målt inkubering av kulturene med 10 mg /ml av 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5- difenyl-tetrazolium-bromid (MTT) ved 37 ° C i 30 minutter, og måling av absorbansen ved 570 nm i solubiliserte celler ved hjelp av et UV-synlig SPECTROstar
Nano
spektrometer (BMG LABTECH, Tyskland).
lentiviral vektorer som uttrykker ORL-en eller shRNA mot olr1
den menneskelige LOX-1-sekvensen ble sub-klonet inn i lentiviral pLCW vektor, genererer pLCW-LOX-1 konstruere.
