Abstract
Bakgrunn
En isoleucin metionin mutasjon i posisjon 148 i PNPLA3 genet (p.I148M, rs738409) er nylig blitt identifisert som en følsomhetsfaktor for leverskade hos steatohepatitis. Her studerte vi om
PNPLA3
rs738409 polymorfisme påvirker også predisposisjon for leverkreft (HCC).
Metoder
Vi sammenlignet distribusjoner av
PNPLA3
genotyper i 80 og 81 kaukasiske pasienter med alkoholisk og hepatitt C-virus (HCV) -associated HCC 80 og 81 alders- og kjønns matchet pasienter med alkoholrelatert og HCV-relaterte skrumplever uten HCC, henholdsvis.
PNPLA3
genotyper i 190 friske individer fra samme populasjon fungert som referanse. Potensielle confounders fedme, diabetes, HCV genotype og HBV-infeksjon ble kontrollert av univariate og multivariate logistisk regresjon med fremover varierende utvalg.
Resultater
PNPLA3
genotyper var i Hardy -Weinberg likevekt for alle studiegrupper. Frekvensen av den 148m allel var signifikant (p 0,001) økte i alkoholisk cirrhose med (53,7%) og uten HCC (36,2%), men var ikke forskjellig mellom friske kontroller (22,9%) og pasienter med cirrhose (25,3%; p = 0,545) og HCC (30,2%; p = 0,071) på grunn av hepatitt C. HCC risikoen var høyest i 148m /M homozygote pasienter med alkoholisk leversykdom (odds ratio (OR) 16,8 versus friske kontroller; 95% konfidensintervall (KI) 6,68 -42,43, p 0,001). Endelig bekreftet multivariat regresjon 148m /M homozygosity (OR 2,8; 95% -CI: 1,24 til 6,42; p = 0,013) som HCC risikofaktor i alkoholisk levercirrhose. I HCV-relaterte skrumplever bare HCV genotype 1 ble bekreftet som en HCC risikofaktor (OR 4,2; 95% -CI: 1,50 til 11,52; p = 0,006).
Konklusjon
PNPLA3
148m variant er en fremtredende risikofaktor for HCC hos pasienter med alkoholisk levercirrhose, mens effektene er ubetydelig hos pasienter med cirrhose grunn av HCV. Denne polymorfisme gir et nyttig verktøy for å identifisere personer med særlig høy HCC risiko hos pasienter med alkoholisk leversykdom som bør tas hensyn til i fremtidige HCC forebyggingsstudier
Citation. Nischalke HD, Berger C, Luda C, Berg T Muller T, Grünhage F, et al. (2011)
PNPLA3
rs738409 148m /M Genotype er en risikofaktor for leverkreft i alkoholisk levercirrhose, men viser ingen eller svak sammenheng i hepatitt C skrumplever. PLoS ONE 6 (11): e27087. doi: 10,1371 /journal.pone.0027087
Redaktør: Yujin Hoshida, Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology og Harvard University, USA
mottatt: 26 juli 2011; Godkjent: 10 oktober 2011; Publisert: 07.11.2011
Copyright: © 2011 Nischalke et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble finansiert av Deutsche Krebshilfe (tilskudd 107 865 til HDN og USA, https://www.krebshilfe.de/english.html) og SFB TR57 TP01 TP12 av Deutsche Forschungsgemeinschaft (https://www.dfg.de/en/index.jsp) til FL, JN og USA. CK ble støttet av en bevilgning på BMBF Network «Susceptbility og Motstand mot Hepatitt C» til USA og JN (tilskudd 01KI0792, https://www.bmbf.de/en/index.php). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
leverkreft (HCC) er en ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis [1], [2]. HCC er i hovedsak knyttet til kronisk viral hepatitt B og C i utviklingsland [3], mens i Europa og Nord-Amerika omtrent 45% av HCCs er forårsaket av økt alkoholforbruk [4].
Stor interesse har kommet fra et genom-wide forening studie som identifiserte en enkeltnukleotidpolymorfi (rs738409C /G) i
PNPLA3
gen på kromosom 22, som koder for en isoleucin → metionin substitusjon (p.I148M) av patatin lignende fosfolipase A3, også betegnet adiponutrin som risikofaktor for steatohepatitis og skrumplever i alkoholholdige og alkoholfrie fatty leversykdom [5], [6]. Adiponutrin er et transmembranprotein uttrykt i humant fettvev og lever. Selv om dens presise in vivo funksjon er fortsatt ukjent, dagens data indikerer en sentral rolle i lipid homeostase. Adiponutrin uttrykk er nedregulert under faste og induseres under høyt kaloriinntak fordi genaktivitet er oppregulert i respons til glukose, insulin og thyreoideahormoner. Således er adiponutrin en viktig regulator av lever- lipid metabolisme under ernæringsmessig overskudd av [6], [7]. Men dette genetisk variant ble ikke korrelert med kroppsmasseindeks, visceral eller subkutane fettinnhold, insulinfølsomhet eller perifert blod lipid nivåer [8], [9]. Dessuten er det korrelert omvendt med arteria carotis intima tykkelse, noe som tyder på at I148M polymorfisme selektivt påvirker fett deponering i leveren, men er ikke knyttet til en generell stoffskiftesykdom [6], [10], [11]. Men 148m varianten ble korrelert med hevet serum alaninaminotransferase nivåer [12], [13], [14] forhøyede leverfettinnhold og økt forekomst av fibrose i alkoholholdige og alkoholfrie fatty leversykdom [15], [16]. Her studerte vi hvis adiponutrin 148m allelet hatt noen effekt på risikoen for HCC utvikling blant cirrhosepasienter med alkoholisk leversykdom i forhold til kronisk viral hepatitt C, en alternativ sterk risikofaktor for HCC.
Materialer og Metoder
Etikk erklæringen
de rapporterte studiene ble godkjent av Institutional Review styrene i Bonn og Berlin Universitetet etiske komiteer. Skriftlig informert samtykke er innhentet fra pasienter før prøvetakingen. Prøvene ble kodet og data lagres anonymt.
Studiegrupper
Vi rekrutterte 161 pasienter med leverkreft (HCC) i Bonn og Berlin Universitetet Avdelinger of Gastroenterology mellom 2005 og 2009. I 80 pasienter HCC var relatert til alkoholholdige skrumplever og i 81 pasienter til kronisk hepatitt C. Disse HCC pasienter ble sammenlignet med 80 og 81 kjønn og alder (± 3 år) -matched pasienter med alkoholisk levercirrhose og HCV-assosiert skrumplever, som ikke har leverkreft. Cirrhosepasienter uten leverkreft hadde minst ett års oppfølging for å beskytte mot muligheten for okkult malignitet. 190 friske frivillige fra samme bakgrunn befolkningen fungert som en referanse. Pasientene ble ansett å ha alkoholisk levercirrhose om deres historie indikerte gjennomsnittlig alkoholforbruk overstige 300 g etanol per uke. Pasienter med blandet HCV-infeksjon og økt alkoholforbruk ( 300 g /uke) hadde blitt ekskludert fra denne studien. Fordelingen av HCV genotyper var 90,0% genotype 1, 1,3% genotype 2, 7,5% genotype 3, 1,3% genotype 4 hos pasienter med leverkreft og 61,7% genotype 1, 22,2% genotype 2, 8,6% genotype 3, 7,4% genotype 4 i HCV-infiserte pasienter med cirrhose uten HCC. Alle fag i denne studien var kaukasiere. Ytterligere demografiske og kliniske kjennetegn er oppført i tabell 1.
Alle pasientene gjennomgikk grundig klinisk undersøkelse, standard laboratorietester og abdominal ultralyd. Kronisk virushepatitt ble diagnostisert ved rutinetesting for hepatitt B overflateantigen, HBV-DNA, HCV-RNA og HCV-antistoffer, henholdsvis. Serum nivåer av ferritin, transferrin metning, om nødvendig HFE genetisk testing samt kvantitative immunglobuliner og antistoffer ble bestemt å utelukke andre årsaker til leversykdom. Skrumplever ble diagnostisert enten ved leverbiopsi, forbigående elastography (stivhet 15 kPa), og tegn på portal hypertensjon (splenomegali, øsofagusvaricer, ascites). Diagnosen HCC ble gjort av kontrastforsterket magnetisk resonanstomografi og computertomografi henhold til nylig etablerte diagnostiske kriterier [EASL 2009 und AASLD 2010 retningslinjer].
Fastsettelse av rs738409 p.I148M alleler
Genomisk DNA ble ekstrahert fra 200 ul EDTA-blod ved hjelp av QIAamp Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden, Tyskland) i henhold til produsentens protokoll. Fastsettelse av
PNPLA3
rs738409 polymorfisme ble utført av LightCycler real time PCR (Roche, Mannheim, Tyskland) ved hjelp av en kommersiell LightSNiP (SimpleProbe) analyse fra TIB-MolBiol (Berlin, Tyskland) i henhold til produsentens anbefalinger.
Statistisk analyse
genotypefrekvensene ble bestemt og testet for konsistens med Hardy-Weinberg likevekt bruker et eksakt test. Allel og genotypefrekvensene ble sammenlignet mellom saker og kontroller av Pearson godhet-of-fit chi
2 test og Armitage trend test, henholdsvis (https://ihg2.helmholtz-muenchen.de/cgi-bin/hw/hwa1. pl). Forskjeller mellom gruppene ble analysert ved t-test og Mann-Whitney-U test som passer.
Strøm beregninger ble gjort ved hjelp av Lenth, RV (2006-9) Java Applets for Power and Sample Size [Dataprogramvare] hentet den 25 august 2011 fra https://www.stat.uiowa.edu/~rlenth/Power. Strøm beregningen var målrettet for å sikre 80% statistisk styrke på 5% alfa feil.
For å ta hensyn til videre potensielle konfunderende risikofaktorer for leverkreft effektene av HCV-genotype, HBV-infeksjon, diabetes og fedme ble vurdert av univariate sammenligninger (ANOVA og chi
2-statistikk), etterfulgt av multivariate logistisk regresjon med fremover varierende utvalg. Denne analysen ble utført separat i pasienter med alkohol- og HCV-relaterte leversykdom. Parametere med effekter på p 0,1 ble inngått den multivariate analysen med P 0,05 for inkludering og p 0,1 for utelukkelse som utvalgskriterium for parametere i de endelige statistiske modeller
Statistisk analyse ble utført med SPSS 18.0 (. SPSS, München, Tyskland). Data er rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik, med mindre annet er oppgitt.
Resultater
Study befolkningen
Fedme og diabetes forekom oftere i alkoholisk levercirrhose uten HCC enn i alkohol pasienter med HCC (tabell 1; p 0,05). Betydelig høyere GGT verdier ble observert i de to gruppene med alkoholisk leversykdom enn hos pasienter med HCV-infeksjon (p 0,05), mens ALAT var signifikant høyere hos pasienter med hepatitt C (p 0,01 hver). Hos pasienter med HCV-forbundet skrumplever distribusjon av Child-Pugh klasser var tilsvarende mellom pasienter med og uten HCC. I kontrast, Child Pugh klasse B og C seiret i kontrollgruppen med alkohol-indusert skrumplever uten HCC (p 0,001).
PNPLA3 (r
s738409) genet polymorfi og leverkreft
de distribusjoner av
PNPLA3
p.I148M lene var i samsvar med Hardy Weinberg likevekt i alle studiegrupper (tabell 2). Av notatet, distribusjon av
PNPLA3
I148M alleler var lik hos friske kontroller og pasienter med HCV-forbundet skrumplever og HCV-relaterte HCC gir opphav til 22,9%, 25,3% (p = 0,545) og 30,2% (p = 0,071) frekvenser på 148m allelet, henholdsvis. I kontrast til utbredelsen av pasientene bærer en
PNPLA3
148m varianten ble betydelig økt i de to gruppene med alkoholisk leversykdom og nådde allelfrekvenser på 53,7% (p 0,001 versus friske kontroller) og 36,2% (p = 0,033 versus friske kontroller) hos pasienter med og uten leverkreft, henholdsvis (figur 1).
Denne figuren viser frekvensene av 148I (grå del av søyler) og 148m (mørke delen av søylene) alleler av
PNPLA3 plakater (rs738409) polymorfisme hos pasienter med HCV-forbundet og alkoholrelaterte HCC, pasienter med alkoholisk og HCV-relaterte skrumplever, som ikke har leverkreft, og friske kontroller, henholdsvis. Forskjeller mellom gruppene ble sammenlignet med chi
2-statistikk
De distribusjoner av
PNPLA3
p.I148M genotyper er oppsummert i tabell 2. Pasienter med alkohol -relaterte HCC består vesentlig mer 148I /M heterozygot og 148m /M homozygote individer enn friske kontroller og de to gruppene av pasienter med alkoholisk levercirrhose uten leverkreft. Frekvensen av
PNPLA3
148m allel ble økt både i alkohol-indusert skrumplever (OR = 1,92; 95% -CI: 1,28 til 2,86; p 0,002) og alkohol-assosiert leverkreft (OR = 4,37; 95% -CI: 2,97 til 6,43; p 0,001) sammenlignet med friske kontroller. Hos pasienter med alkoholisk levercirrhose risikoen for HCC var spesielt knyttet til homozygot 148m /M genotype (OR = 16,84; 95% -CI: 6,68 til 42,43; p 0,001). Når vi sammenlignet risikoen for at PNPLA3 I148M polymorfisme mellom alkohol pasienter med og uten HCC, forskjeller i frekvens allel (OR = 2,28; 95% -CI: 1,47 til 3,55; p 0,001) og frekvensen for homozygot 148m /M genotype (OR = 4,33; 95% -CI: 1,68 til 11,16; p 0,002) fortsatt indikerte en signifikant effekt av den 148m allel på utviklingen av alkoholholdige skrumplever mot leverkreft. Vi kunne ikke finne noen signifikante sammenhenger mellom de PNPLA3 I148M polymorfi og serumnivåer av leverenzymer eller markører av metabolsk syndrom (fedme, diabetes mellitus eller serum lipider) (data ikke vist).
For å utelukke at de observerte forskjellene i fordelingen av Child-Pugh klasser kan ha påvirket vår analyse, vi stratifisert pasientene i de to klassene A /B versus C. Da vi matchet våre alkohol pasienter for kjønn, alder og dikotomisert Child – Pugh klasse. Etter matchende 42 parene forble tilgjengelig for en supplerende analyse: I disse matchet par av alkoholholdige pasienter med og uten leverkreft de PNPLA3 148m allelfrekvenser var 53,6% vs. 31,0% (OR = 2,57; 95% -CI: 1,37 til 4,84; p = 0,003), respektivt. Likeledes frekvenser av den homozygote 148m /M-genotype var 31,0% mot 9,5% hos pasienter som matcher med og uten HCC (OR = 6,50; 95% -CI: 1,68 til 25,16; p = 0,004).
Endelig merket av hvis
PNPLA3
p.I148M polymorfisme forble en selvstendig HCC risikofaktor når andre kjente risikofaktorer for HCC som fedme, diabetes, og HBV-infeksjon ble også tatt hensyn til. Inkludert alle pasienter med alkohol- og HCV-indusert leversykdom, respektivt, beregnet vi separate Cox regresjonsmodeller for å identifisere HCC risikofaktorer hos pasienter med alkoholisk cirrhose (tabell 3), og HCV-assosiert cirrhose (tabell 4). Homozygot
PNPLA3
148m /M genotype (OR 2,83; 95% -CI: 1,24 til 6,42; p = 0,013) ble bekreftet som en risikofaktor for HCC i alkoholisk levercirrhose. Videre HCV genotype 1 (OR 4,16; 95% -CI: 1,50 til 11,52; p = 0,006) ble bekreftet som en risikofaktor for HCC i HCV-forbundet skrumplever
Diskusjoner
Kronisk hepatitt C og alkoholbruk er de viktigste årsakene til HCC i europeiske befolkninger. Her utførte vi en tverrsnittsanalyse for å studere den potensielle rolle
PNPLA3
p.I148M variant i leverkreft assosiert med alkoholisk leversykdom sammenlignet med pasienter med HCV-indusert HCC. Vi fant en stadig økende utbredelsen av 148m allel hos pasienter med alkoholisk levercirrhose (36,2%) og alkohol-assosiert HCC (53,7%) sammenlignet med friske kontroller (22,9%), mens forskjeller i forekomsten av denne genetiske varianten mellom friske kontroller og HCV-assosiert cirrhose (25,3%) og HCV-relaterte HCC (30,2%) var små og ikke statistisk signifikant. Disse funn er i overensstemmelse med tidligere observasjoner i alkoholisk leversykdom og styrker konseptet at den PNPLA3 148m varianten er assosiert med mer alvorlig leverskade og cirrhose i alkoholisk leversykdom [17], [18]. Her legger vi romanen observasjon at denne genetiske varianten er også en sterk genetisk risikofaktor for alkoholrelatert HCC, noe som bidrar til en ca 4 ganger høyere risiko i homozygote bærere av 148m allelet selv i nærvær av etablert skrumplever. Denne ideen er ytterligere understreket av våre multivariat regresjonsmodell, som bekreftet
PNPLA3
148m homozygosity som uavhengige risikofaktorer for HCC blant våre pasienter med alkoholisk leversykdom. På den annen side,
PNPLA3
148m variant hadde bare mindre virkninger på HCC risiko i cirrhose i forbindelse med kronisk hepatitt C som antyder at dette genetisk variant er ikke en svulst gen per se, men bare fungerer i kombinasjon med betydelig alkohol eksponering og lever lipid akkumulering.
To nyere studier fra Italia rapporterte sterke effekter av
PNPLA3
148m variant også på risikoen for HCC i kronisk hepatitt C [19], [20], mens en tredje italiensk studie antydet at dette allelet var hovedsakelig forbundet med metabolsk skrumplever [21]. I tråd med denne siste rapporten, fant vi bare liten effekt av
PNPLA3
148m variant på risikoen for HCC i våre pasienter med HCV-infeksjon, i hvem skjevhet fra samtidig alkoholforbruket hadde blitt utelukket med stor forsiktighet. I våre HCV-infiserte pasienter
PNPLA3
148m /M homozygosity avdekket en odds ratio på 1,666 for risikoen for leverkreft (tabell 4), som ikke klarte å nå statistisk signifikans med vår utvalgsstørrelsen. Strøm beregning pekt på behovet for 670 pasienter per studiegruppe for å påvise statistisk signifikans (p 0,05) for denne antatte foreningen. På den annen side observerte avvik mellom de ulike studier kan reflektere utilsiktede kosttilskudd forskjeller mellom befolkninger, sannsynligvis det faktum, at pasienter med kombinert HCV-infeksjon og alkoholinntak ( 300 g /uke) ikke hadde tilstrekkelig tatt hensyn til. Denne forklaringen ville være i samsvar med konseptet som hepatisk lipid-akkumulering i kronisk hepatitt C-genotype 1 er knyttet til tilstedeværelsen av andre flere metabolske faktorer, slik som diabetes og fedme [22]. Viktigere, effekten skyldes den
PNPLA3
p.I138M polymorfisme i ernærings skrumplever var ikke korrelert til alder, kjønn, kroppsmasseindeks eller diabetes i tråd med tidligere rapporter [8].
Til slutt , var det en markert i ubalanse leversykdom alvorlighetsgrad mellom pasienter med og uten HCC blant alkohol-indusert cirrhose. Denne ubalansen muligens gjenspeiler det faktum at pasienter med tidlig alkohol-indusert cirrhose (Child Pugh klasse A) bare sjelden til stede på sykehustjenester, hvis HCC er fraværende. Dermed pasienter i alkoholrelaterte kontrollgruppen uten HCC hadde betydelig mer avansert skrumplever enn pasienter med alkohol-indusert skrumplever og HCC. For å sjekke om dette funnet var partisk vår analyse, vi også analysert undergruppen av pasienter som kan bli matchet for Child-Pugh klasser i tillegg til kjønn og alder. I tråd med vår hypotese dette supplerende analyse bekreftet en signifikant sammenheng mellom
PNPLA3
148m allel – og spesielt
PNPLA3
148m /M genotype – og HCC (OR = 6,50; 95% – CI:. 1,68 til 25,16; p = 0,004)
den fysiologiske rolle PNPLA3 protein er fortsatt uklart.
PNPLA3
genet koder for et enzym som viser både triglyserid hydrolase og transacylation aktivitet in vitro [23]. Den metionin substitusjon i posisjon 148 forstyrrer triglycerid-hydrolase-aktivitet [24], men PNPLA3 ablasjon i to forskjellige musestammer har ikke resultert i hepatisk lipidakkumulering og leverskade under en rekke forskjellige dietter [25]. På den annen side over-ekspresjon av
PNPLA3
148m i mus øket nedsatt fettinnhold favorisere en forsterkning-av-funksjon-mutasjonen [24]. I tillegg er en rekke andre intracellulære interaksjoner også diskutert som mulige alternative patogene mekanismer [26]. I sammenheng med ikke-alkoholisk steatohepatitis
PNPLA3
risiko allel fremmer lever lipidakkumulering og alvorlighetsgraden av fibrose [6], [8], [10], [27], [28]. Likeledes fører jevnlig alkoholforbruk leverskade via steatohepatitis. Det er også dokumentert at leverbiopsier fra bærere av en
PNPLA3
148m allel, spesielt 148m homozygote fag, utstillings større leverbetennelse og leverskade enn pasienter med villtype-genet på samme grad av lipid deponering [27 ]. Således kan den økes hepatisk inflammatorisk aktivitet og fibrose i respons til lipidakkumulering, som er forbundet med den
PNPLA3
148m variant som øker risikoen for HCC i alkoholisk cirrhose.
uansett den underliggende mekanismer, koblingen mellom PNPLA3 polymorfisme og HCC i alkoholisk leversykdom ser sterk nok til å bære praktiske konsekvenser: tilstedeværelsen av et
PNPLA3
148m allel, og spesielt
PNPLA3
148m homozygosity, kan gi et enkelt verktøy for å identifisere personer med særlig risiko for HCC på alle stadier av alkoholisk leverskade. Derfor bør fremtidige HCC forebygging og behandlingsstrategier også ta hensyn til den kombinerte effekten av
PNPLA3
p.I148M polymorfisme og alkohol hos pasienter med kronisk leversykdom.
