Abstract
Mål
For å undersøke prevalens, genotyper og prognostiske verdier av Epstein-Barr virus (EBV) og humant papillomavirus (HPV) infeksjoner i japanske pasienter med ulike typer hode og nakke kreft (HNC).
Metoder og materialer
HPV og EBV DNA, EBV genotyper og
LMP-en
varianter, og HPV mRNA uttrykk ble påvist ved PCR fra fersk-frosne HNC prøver. HPV-genotypene ble bestemt ved direkte sekvensering, og EBV kodet RNA (
EBER
) ble undersøkt ved in situ hybridisering.
Resultater
Av de 209 HNC pasienter, 63 (30,1 %) hadde HPV-infeksjon og HPV-16 var den vanligste subtype (86,9%). HPV
E6 /E7
mRNA uttrykk ble funnet i 23 av 60 (38,3%) HPV DNA-positive tilfeller oppdages. Stedet for høyest forekomst av HPV var orofarynx (45,9%). Blant 146 (69,9%) HNCs hvori EBV-DNA ble identifisert, 107 (73,3%) og 27 (18,5%) inneholdt typer A og B, henholdsvis, og 124 (84,9%) viste eksistensen av
del-LMP- 1
. Men bare 13 (6,2%) HNCs var positive for
EBER
, 12 (92,3%) som stammer fra nasopharynx. Samtidig infeksjon av HPV og
EBER
ble funnet i bare 1,0% av HNCs og 10,0% av NPCer. Kaplan-Meier overlevelsesanalyse viste signifikant bedre sykdomsspesifikke og total overlevelse i HPV DNA + /mRNA + orofaryngeal plateepitelkarsinom (OPC) enn hos de andre OPC pasienter (
P
= 0,027 og 0,017, henholdsvis). Multivariat analyse viste at scenen T1-3 (
P
= 0,002) og HPV mRNA-positive status (
P
= 0,061) uavhengig spådd bedre sykdomsspesifikk overlevelse. Ingen signifikant forskjell i sykdomsspesifikk overlevelse ble funnet mellom
EBER
-positivt og -negative NPC pasienter (
P
= 0,155).
Konklusjoner
Våre funn tyder på at co-infeksjon med HPV og EBV er sjelden i HNC. Orofaryngeal SCC med aktiv HPV-infeksjon var knyttet til en svært gunstig utfall, mens EBV status var ikke prognostisk i NPC kohorten
Citation. Deng Z, Uehara T, Maeda H, Hasegawa M, Matayoshi S, Kiyuna A , et al. (2014) Epstein-Barr virus og humant papillomavirus infeksjoner og Genotype Distribusjon i hode og nakke kreft. PLoS ONE 9 (11): e113702. doi: 10,1371 /journal.pone.0113702
Redaktør: Jeffrey Chalmers, The Ohio State University, USA
mottatt: 18 juli 2014; Godkjent: 28 oktober 2014; Publisert: 18.11.2014
Copyright: © 2014 Deng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er innenfor papir
Finansiering:. Denne studien ble støttet av tilskuddet KAKENHI 26462610 (Japan Society for Promotion of Science) Dr. Suzuki, gi KAKENHI 26462611 (Japan Society for Promotion of Science) Dr. Deng, et stipend fra Okinawa Medical Science Research Foundation Dr. Deng, og et stipend fra Science and Technology Development Center, Kunnskapsdepartementet av Folkerepublikken Kina Dr. Deng. Denne studien ble også støttet og gjennomføres i samarbeid med Ryukyu Society for Promotion of Oto-Rhino-halssykdommer. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode- og halskreft (HNC) er den sjette største kreft i verden, med mer enn 600.000 nye tilfeller rapportert hvert år [1]. Overdreven alkohol og tobakk er to tradisjonelle og viktige risikofaktorer for HNC. I de siste to tiårene, forekomsten av HNC, som karsinom i strupehodet eller hypopharynx, har sunket betydelig på grunn av forebyggende strategier rettet mot disse risikofaktorene. Imidlertid har forekomsten av orofaryngeal plateepitelkarsinom (OPC) økt kraftig, spesielt i ung-utbruddet HNC i fravær av disse tradisjonelle risikofaktorer, noe som antyder involvering av andre faktorer. Humant papillomavirus (HPV) er nå også en etablert etiologisk faktor for forekomst og utvikling av HNC, spesielt OPC. En økning i andelen av HPV-relatert orofaryngeal kreft ble observert i USA 1973-2004 [2]. Tilsvarende to retrospektive kohortstudier fra Stockholm, Sverige, viste økning i andelen av HPV-positive tonsill- kreft fra 23,3% i 1970 til 93% i perioden 2006-2007, og i at av HPV-positive base av tungen kreft fra 58 % for 1998-2001 til 84% for 2006 til 2007 [3], [4]. I tillegg er det faktum at HPV blir detektert i ikke-i munnhule og svelg HNC antyder at dens rolle i utvikling og progresjon av HNC ikke er begrenset til det oropharynx [5], men omfatter nasopharynx, hvor Epstein-Barr virus (EBV) er gjennomgående oppdaget i kreftceller fra områder med høy og lav forekomst [6].
EBV er en allestedsnærværende herpes virus som rammer mer enn 90% av verdens voksne befolkning og er assosiert med ulike maligne lidelser inkludert Hodgkins sykdom, Burkitt lymfom, B-celle lymfom [7], [8], [9], og gastrisk karsinom [10]. I hodet og nakken, kan etablering av en latent transforme EBV infeksjon og de potensielle virus genetiske endringer som oppstår i epitelceller bidra til utvikling, vekst og invasive egenskapene til nasopharyngeal karsinom (NPC) [6]. Plasma EBV DNA-analyse har vist seg nyttig i å oppdage tidlig NPC i individer når det ikke er klinisk mistanke om svulst [11]. En rekke virale proteiner av EBV omfatter latency-assosierte proteiner, latente membranproteiner-1 og -2 (
LMP-1
og
LMP-2
), og EBV-nukleære antigener (
EBNA1-6
) [9], [12]. EBV er klassifisert som type A eller B basert på linket polymorfisme i
EBNA Anmeldelser –
2
,
3a
,
-3B
, og
3C product: [13].
LMP-1
har blitt funnet å være et onkogen EBV [14]. Det består av en kort aminosyre cytoplasmisk N-enden (aminosyrene 1-23), seks transmembran-dekkende domener (aminosyrer 24-186), og en C-terminus (aminosyrene 187-386). Den C-terminale ende og transmembrane-dekkende domener av
LMP-1
er nødvendig for maksimal aktivering av nukleær faktor kappa B-(NF-kB), aktivering av denne er knyttet til inhibering av apoptose [15 ], [16], [17]. En sletting av 30 basepar (bp) på 3’C-terminal regionen av
LMP-en
genet (
del-LMP-en
) har blitt rapportert i NPC i kinesiske pasienter . Denne slettingen kan resultere i tap av aminosyrer 346-355 i
LMP-en
protein. Proteinet delesjon har en lengre halveringstid og gir forsterket NF-kappa B og JNK /AP1 signale aktivitet på epitelceller. Disse egenskapene
del-LMP-1
variant er lokalisert for å transmembran-dekkende domener, og kan bidra til en mer ondartet fenotype av NPC [18]. Tidligere studier har funnet
del-LMP-en
å være til stede i mer enn 75% av NPC pasientene i Sørøst-Asia og Nord-Afrika [19], [20], [21]. Overvekt av spesifikke
LMP-en
varianter i NPC kan gjenspeile forskjeller i biologiske eller molekylære egenskapene til
LMP-1
varianter. Dessuten
del-LMP-1
har lavere immunogenisitet enn den ikke-del-varianten, noe som kan gi opphav til tumorutvikling hos immunkompetente verter via rømmer immunosurveillance [22]. Men utbredelsen og rolle EBV i HNC på andre områder enn de nasopharynx er kontroversielt. Mens EBV DNA har blitt identifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) i 72-92% av oral SCC, laryngeal SCC, og faryngeale SCC tilfeller [23], [24], [25], [26], utbredelsen av EBV-infeksjon basert på in situ hybridisering (ISH) rettet mot EBV kodet RNA (
EBER
), gull-standard analyse for å avgjøre om en biopsi svulst er EBV-relatert, er betydelig inkonsekvent i disse kreftformene [23], [27 ], [28], [29]. Videre skiller NPC forekomsten blant geografiske regioner, og til tross EBV infeksjon oppstår omfattende over hele verden, indikerer dette at en undertype av EBV er involvert i NPC.
Samtidig infeksjon med virus og virus /virus direkte eller indirekte veksel har vært funnet i noen kreftformer, og et typisk eksempel for en ondartet svulst på grunn av virus /virus interaksjoner er Kaposis sarkom-assosiert herpesvirus (KSHV) indusert Kaposis sarkom hos AIDS-pasienter [30], [31]. Nyere bevis indikerer at personer med HPV er til betydelig høyere risiko for å få humant immunsviktvirus (HIV) [32], [33]. Ko-infeksjon av HPV og herpes simplex-virus 1 (HSV-1) er også sett i en undergruppe av HNC tilfeller [5]. Som HPV og EBV er de to vanligste virus i HNC bør det avklares om co-infeksjon fører til deres samhandling i HNC og hvorfor HPV utbredelsen har økt i løpet av de siste tiårene.
Denne prospektive studien undersøkte frekvensen av EBV genotyper,
del-LMP-en
varianter, og HPV-genotypene i fersk-frosne prøver fra pasienter med HNC for å analysere virkningene av EBV og HPV-infeksjon på ulike typer HNC. Funnene ble deretter undersøkt for foreninger med kliniske funksjoner og prognose.
Materialer og metoder
Kliniske prøver og cellelinjer
Vi rekrutterte 209 pasienter med HNC patologisk bekreftet av Institutt av otolaryngologi, Head and Neck Surgery av University of the Ryukyus, Japan, mellom desember 2006 og mars 2014. Skrevet ble informert samtykke innhentes fra hver pasient og forskningsprotokollen ble godkjent av etikkomiteen ved Universitetet i Ryukyus. Vevsprøver tatt ved biopsi eller kirurgisk inngrep ble snap-frosset i flytende nitrogen og lagres inntil videre analyse.
cellelinjer CaSki (ECACC, Salisbury, UK) og Raji (ATCC, Tokyo, Japan) ble brukt som kontrollene for forsterkning av HPV
Hotell og
E6 /E7
gener og EBV
LMP-en
og
EBNA-3C
gener, henholdsvis L1 og dyrket i henhold til leverandørens anvisninger.
DNA-ekstraksjon og PCR for påvisning av HPV DNA og EBV DNA
DNA ble ekstrahert fra prøvene og celler ved hjelp av Gentra Rensing Tissue Kit (Qiagen, Germantown, MD) i henhold til produsentens protokoll. Tilstedeværelsen og integriteten av DNA i alle prøver ble verifisert ved PCR â-globingenet amplifisering ved anvendelse av primere PC04 og GH20 [34].
tilstedeværelsen av HPV DNA ble analysert ved PCR ved anvendelse av den generelle konsensus primersettene
GP5 + /GP6 + Hotell og
MY09 /11 product: [35], [36]. DNA-prøver negative for HPV å bruke
GP5 + /GP6 +
eller
MY09 /11
ble gjen forsterket av (auto) nestet PCR med
GP5 + /GP6 +
primerpar som tidligere beskrevet [37]. Vann (negativ kontroll) og DNA fra HPV-16-positive CaSki-celler (positiv kontroll) ble inkludert i hver forsterkning serie. PCR-produkter ble renset og sekvensert direkte med en ABI PRISM 3130 x l Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Carlsbad, CA). Sekvenser ble justert og sammenlignet med de kjente HPV-typer i GenBank databasen ved hjelp av BLAST-programmet.
EBV DNA tilstedeværelse og typing ble utført ved PCR bruke primere som strekker seg over
EBNA-3C
genet som tidligere beskrevet [13]. På grunn av primer nettsteder flankerer regioner av typespesifikk variasjon, de resulterende PCR-produkter var to forskjellige størrelser avledet fra
EBV-A product: (153 bp) og
EBV-B plakater (246 bp) ( Figur 1). Som positive kontroller, to EBV-positive prøver av type A og type B, bekreftet ved PCR og direkte sekvensering ble inkludert i hver PCR-reaksjon
USA panel:. Et bestemt 316 bp bånd viste villtype
LMP -1 product: (prøvene 3, 4, 6, 7 og positiv kontroll PC-en) og en bestemt 286 bp bandet indikerte 30 bp sletting
LMP-en
(prøve 1, 2, 5, og PC-2). Produktene av positive kontroller ble bekreftet ved direkte sekvensering. Nedre panel: 30 bp sletting sekvens av
del-LMP-en
fra villtype LMP-en ved sekvensanalyse
Vi har også undersøkt
LMP-en.
genet som tidligere rapportert [19]. Prototypen Raji-cellelinjen (ATCC), som bibeholder den karboksyterminale 30 bp, produserer et 316 bp-fragment og ble anvendt som en positiv kontroll for villtype
LMP-1
. Prøver med en kortere PCR produkt lengde enn det som er observert med Raji ble antatt å inneholde
LMP-en
sletting (
del-LMP-en
, 286 bp fragment). I tillegg ble en prøve med en 30 bp delesjon variant bekreftet ved PCR og direkte sekvensering også inkludert i hver PCR-reaksjon.
Påvisning av HPV
E6 /E7 mRNA
ved revers transkripsjon PCR
Total RNA ekstraheres fra tumorprøver ved hjelp av helt RNA ™ kit (Ambion, Austin, TX) i henhold til produsentens protokoller ble suspendert i 50 mL ultra-høy kvalitet dietylpyrokarbonat-behandlet vann.
Før cDNA-syntese, eventuelt resterende DNA ble fjernet ved inkubering med en U-DNase i (Ambion) ved romtemperatur i 25 min. cDNA ble så syntetisert fra DNA-free total RNA bruker RETROscript® Kit (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. For å undersøke for tilstedeværelsen av forurensende DNA i RNA prøver ble alle analyser utført både med og uten revers transkriptase.
For å oppdage høy risiko
E6 /E7
mRNA transkripter, PCR ble utført med cDNA hentet fra HPV DNA-positive prøver ved hjelp av Takara PCR humant papillomavirus Typing Set (Takara Bio Inc., Otsu, Japan), som kan identifisere høyrisiko HPV type 16, 18, 31, 33, 35, 52 og 58. Hvis du vil kontrollere HPV-16
E6 /E7
mRNA transkripter ble HPV-16-DNA-positive prøver også undersøkt ved hjelp av en halv-nestet PCR tilnærming med cDNA som tidligere beskrevet [38].
ISH for
EBER
tilstedeværelsen av EBV i kreftceller ble bekreftet av ISH for
EBER
. Kort fortalt ble 4 mikrometer tykke seksjoner fra formalinfiksering parafininnstøpte blokker deparaffinized, re-hydrert, og predigested med proteinase K. hybridisering løsning som inneholder fluorescein (FITC) konjugert EBV oligonukleotidprobe (
EBER
PNA sonde, cocktails av
EBER en
og
2
, Dako, Glostrup, Danmark) ble søkt om 90 min ved 55 ° C. En Dako ISH deteksjonssett (kode nr S5201) med kanin F (ab «) 2 anti-FITC-antistoff og enzym-substrat (5-brom-4-klor-3-indolylphosphate og nitro tetrazolium) ble anvendt for å visualisere de hybridiserings-produkter. Stained lysbilder ble kontra med Nuclear Fast Red (Vector Laboratories, Burlingame, California). Mørkeblå signaler som opptrer i kjernen ble anerkjent som
EBER
positive.
Statistisk analyse
Beskrivende statistikk ble brukt for å karakterisere pasientens baseline. Mann-Whitney U-test eller Kruskal-Wallis test ble brukt for kontinuerlige variabler, og Pearsons khikvadrattest eller Fishers eksakte test ble brukt for kategoriske variabler.
Tilbakefall overlevelse ble definert som tiden fra slutten av behandlingen for kreft tilbakefall eller siste oppfølging. Sykdomsspesifikk overlevelse ble definert som tiden fra slutten av behandlingen til innsynkning av sykdom eller siste oppfølging. Overlevelseskurver ble evaluert av Kaplan-Meier-metoden, og overlevelse distribusjoner ble sammenlignet med log-rank test.
P
verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant. Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av SPSS programvare (SPSS for Windows versjon 12.0, SPSS, Inc., Chicago, IL).
Resultater
Clinicopathological kjennetegn ved pasientene
Plassering av den primære svulsten var nesesvelget hos 20 pasienter (9,6%), oropharynx i 74 (35,4%), hypofarynx i 50 (23,9%), strupehode i 28 (13,4%), og munnhulen i 37 (17,7%). Av de 209 pasientene, 168 fikk kurativ behandling (samtidige kjemoradioterapi i 73, kirurgi og postoperativ strålebehandling eller chemoradiation terapi (stråledose, 50-54 Gy) i 51, kirurgi alene i 27, og strålebehandling alene 17), fikk 30 pasienter palliativ behandling, og 11 hadde ingen behandling. Demografiske og kliniske karakteristika er oppsummert i tabell 1.
HPV-infeksjon og genotyper i HNC
HPV-DNA ble påvist i 30,1% (63/209) av 209 pasienter, og den orofarynx var stedet for høyest prevalens (45,9%; 34/74). Genotyping av neoplasmer viste at de fleste av HPV DNA-positive prøvene inneholdt høyrisiko HPV-16 (86,9%; 53/63 tumorer). De andre HPV-typer inkludert HPV-33 (4 tilfeller), HPV-35 (2 tilfeller), HPV-56 (1 sak), HPV-58 (2 tilfeller), og HPV-67 (en sak). Ingen flere infeksjon eller lavrisiko HPV-typer ble funnet (tabell 1).
Av de 63 HPV DNA-positive prøver, 60 var tilgjengelig for RNA-ekstraksjon og HPV
E6 /E7
mRNA uttrykk ble funnet i 23 (38,3%) av dem. Interessant nok har de fleste av HPV
E6 /E7 mRNA
-positive tumorer (87,0%; 20/23) avledet fra oropharynx. Mens 60,6% (20/33) av HPV DNA-positive OPCs var positivt for viral HPV mRNA uttrykk, HPV
E6 /E7
mRNA transkripter ble funnet i kun tre av 27 (11,1%) ikke-orofaryngeal HNCs, stammer fra nasopharynx, strupehode, eller munnhulen (tabell 2).
Analyse av statistisk sammenheng mellom HPV-infeksjon status og histoclinical funksjoner avdekket ingen signifikante sammenhenger mellom tilstedeværelsen av HPV DNA og kjønn, alder , TNM stadium, eller nodal scenen. HPV DNA var mer sannsynlig å bli funnet i røykere eller lette røykere (dvs. Brinkman indeks 400;
P
= 0,030). I tillegg ble det observert signifikante sammenhenger mellom HPV status og svulst plassering (
P
= 0,002) og mellom HPV status og tumor differensiering (
P
0,001).
EBV infeksjon, genotyper, og 30 bp sletting
LMP-en
variant i HNC
Som angitt i tabell 2, PCR forsterkning av
EBNA-3C
genet viste EBV DNA i 146 (69,9%) av de 209 HNC prøver: 107 (73,3%) inneholdt type A, 27 (18,5%) inneholdt type B og type A og type B ble funnet sammen i 12 (8,2%) tilfeller. Vi har også undersøkt forekomsten av
LMP-en
variant og funnet
del-LMP-en
i 124 (84,9%) av 146
EBNA
-positive tilfeller. Nesten alle type A EBV tilfeller (98,1%, 105/107) inneholdt
del-LMP-en
, mens litt over halvparten av type B tilfeller (63,0%; 17/27) inneholdt villtype
LMP-en product: (
P
0,001).
forekomsten av EBV DNA ved sekundært var 95,0% (19/20), 79,7% (59/74), 64,0 % (32/50), 50,0% (14/28), og 59,5% (22/37) i svulster fra nasopharynx, orofarynx, hypopharynx, strupehode, og munnhulen, henholdsvis. Av de 17 NPC prøver som inneholder type A EBV, 16 (94,1%) viste
del-LMP-en
, inkludert seks WHO type I tilfeller, 6 WHO type II tilfeller, og 4 som skriver III tilfeller.
for å bestemme tilstedeværelsen av EBV infeksjon i tumorceller,
EBER
ble også undersøkt av ISH i alle HNC prøvene (figur 2). I motsetning til den høye forekomsten av EBV DNA identifisert ved PCR, bare 6,2% (13/209) av HNCs var positive for
EBER
. EBV infeksjon i HNC var hovedsakelig lokalisert i nasopharynx (92,3% [12/13] av
EBER
-positive svulster, nasopharynx vs ikke-nasopharynx HNC,
P
0,001).
EBER
ble påvist i 60,0% (12/20) av pasienter med NPC, inkludert 2 (22,2%, 2/9) med WHO type I, 6 (100%, 6/6) med WHO type II og 4 (80%, 4/5) med WHO type III, men i bare 1,4% (1/74) av pasientene med OPC. Ingen av
EBER
-positive tilfeller avledet fra hypopharynx, strupehode, eller munnhule
Micrograph A:. Mesteparten av svulsten cellene var positive (nasofaryngeal karsinom, × 100, bar = 100 um), som indikert av pilene ved høy forstørrelse (x 200). Micrograph B: selv om noen positive lymfocytter er tydelige (pil), ingen neoplasma celler var positive. Mikrografer C og D:. §§ farget med hematoxylin og eosin (HE)
HPV og EBV co-infeksjon i HNC
Både HPV DNA og EBV-DNA ble påvist ved PCR i 45 (21,5%) av den totale 209 pasienter. Men av de 13
Eber
-positive HNCs, bare 2 var HPV-16 positive og begge avledet fra nasopharynx. Siden EBV infeksjon i HNC er definert som
Eber
-positive tumorceller ved ISH, co-infeksjonsrater av HPV og EBV i HNC og NPC var bare 1,0% og 10,0%, henholdsvis (Tabell 3). Selv om HPV-infeksjon var mest vanlig i OPCs, ingen av de 34 HPV DNA-positive OPC tilfeller var samtidig infisert med EBV, noe som bekreftes av
EBER
ISH.
Survival analyse
Siden det var ikke nok vev for mRNA deteksjon i ett tilfelle, evaluert vi behandlingsresultatene av 73 OPC pasienter basert på HPV-status. Femti-fire pasienter med tidligere ubehandlet primær OPC hadde komplett remisjon etter å ha mottatt primær kurativ behandling, fem viste vedvarende sykdom etter kurativ behandling, 10 gikk palliativ behandling, og fire hadde ingen behandling. Median oppfølging for pasienter hvis data ble sensurert var 41 måneder (range, 3-86 måneder). Senest oppfølging, 18 (24,7%) av de 73 OPC pasientene hadde dødd av sykdommen og to døde av urelaterte sykdommer. Kaplan-Meier analyse viste at ingen signifikante forskjeller i sykdomsspesifikk overlevelse eller total overlevelse mellom OPC pasienter med HPV DNA + og OPC pasienter med HPV DNA (
P
= 0,332 og
P
= 0,378 henholdsvis fig. 3). Men sammenlignet med OPC pasienter med HPV mRNA (dvs. både OPC pasienter med HPV DNA + /mRNA og OPC pasienter med HPV DNA- /mRNA), OPC pasienter med HPV DNA + /mRNA + hadde bedre sykdomsspesifikke og generelle overlevelse (
P
= 0,027 og
P
= 0,017, henholdsvis). Den 3-årige sykdomsspesifikk overlevelse var 95,0% (95% KI = 85,5% -100%) i kohorten med HPV DNA + /mRNA + og 73,8% (95% KI = 61,4% -86,1%) i kohorten med HPV DNA + /mRNA eller HPV DNA /mRNA.
sykdomsspesifikk overlevelse og total overlevelse var signifikant bedre i HPV DNA-positive /mRNA-positive OPC pasienter enn hos HPV DNA-positive /mRNA-negative og HPV DNA-negative /mRNA-negative OPC pasienter. Det ble imidlertid ingen signifikante forskjeller i sykdomsspesifikk overlevelse eller total overlevelse funnet mellom HPV DNA-positive og HPV DNA-negative OPC pasienter.
For å vurdere den uavhengige prediktive verdien av alle disse faktorene for sykdoms- spesifikk overlevelse i OPC, univariate og multivariate analyser ved hjelp av Cox proporsjonal farer modeller ble utført. I univariat analyse, OPC pasienter med HPV DNA + /mRNA + status viste signifikant høyere sykdomsspesifikk overlevelse (
P
= 0,029; hazard ratio (HR) = 0,12; 95% konfidensintervall (KI) = 0,01 til 0,99) enn de andre OPC-pasienter (tabell 4). OPC pasienter kategorisert som stadium T4, nodal stadium 2-3, og tunge drikker alkohol (alkohol per dag 50 g) hadde signifikant lavere sykdomsspesifikk overlevelse (T4,
P
= 0,002, HR = 0,15, 95 % CI = 0,04 til 0,50; nodal stadium 2-3,
P
= 0,040, HR = 3,49, 95% CI = 01.01 til 12.03, tung alkohol drikker,
P
= 0,040, HR = 3,49, 95% CI = 01.01 til 12.03) sammenlignet med pasienter kategorisert som stadium T1-3, nodal stadium 0-1, og lette røykere og ikke-røykere. Den endelige modellen av multivariat analyse ved hjelp av en Cox-modell for identifisering av virkelig sykdomsspesifikk overlevelse av OPCs viste det stadiet T1-3 (
P
= 0,002; justert HR = 0,22, 95% CI = 0.08- 0,56) og HPV mRNA-positive status (
P
= 0,061; justert HR = 0,15, 95% CI = 0,02 til 1,10) spådd bedre sykdomsspesifikk overlevelse (tabell 4)
i tillegg vurderes vi prognoser i de 54 OPC pasienter som hadde komplett remisjon etter å ha mottatt primær kurativ behandling. Den 3-årige tilbakefall overlevelse var 100% for OPC pasienter med HPV DNA + og 75,1% (95% KI = 59,1% -91,2%) for OPC pasienter med HPV DNA (
P
= 0,002) ( Figur 4A). Dermed blir 3-års sykdomsspesifikk overlevelse i HPV DNA + OPC pasienter ble betydelig bedre enn i de HPV DNA-pasienter (100% vs 88,9%,
P
= 0,015) (figur 4B). Interessant, HPV mRNA + OPC pasientene også viste signifikant bedre tilbakefall overlevelse enn HPV mRNA OPC pasienter (
P
= 0,032) (figur 4C), og de tre-års tilbakefall-fri overlevelse var 100% og 80,4%, respektivt. Men OPC pasienter med HPV mRNA + viste bare en litt sterkere tendens til rettferdig sykdomsspesifikk overlevelse sammenlignet med OPC pasienter med HPV mRNA (100% vs 91,2%,
P
= 0,080) (figur 4D).
Etter kurativ behandling, HPV DNA-positive OPC pasienter viste signifikant bedre tilbakefall overlevelse og sykdomsspesifikke overlevelse sammenlignet med HPV DNA-negative OPC pasienter. Lignende resultater ble funnet i HPV mRNA-positive OPC pasienter.
For å vurdere påvirkning av EBV på overlevelse for pasienter med NPC ble pasientene stratifisert etter påvisning av
EBER
. Blant 20 pasienter med NPC, 18 ble behandlet lokalt og behandling detaljer og utfallet var tilgjengelig fra diagnosetidspunktet for disse pasientene. Median oppfølgingstid var 21 måneder (range, 3-63 måneder). Selv om pasienter med
EBER
-positivt NPC viste en trend mot økt sykdomsspesifikk overlevelse sammenlignet med pasienter med
EBER
-negativ NPC, ble ingen signifikant forskjell funnet mellom disse to gruppene (
P
= 0,155) (figur 5A). Tilsvarende 16 tilfeller fikk kurativ samtidig kjemoradioterapi for primærkreft, og ingen signifikant forskjell i sykdomsspesifikk overlevelse ble funnet mellom
EBER
-positivt NPC og
EBER
-negative NPC kohorter (
P
= 0,381) (figur 5B).
ble funnet noen signifikante forskjeller i forekomst av sykdomsspesifikk overlevelse mellom
EBER
-positivt (tumor EBV infeksjon) og
Eber
-negative pasienter NPC.
Diskusjoner
den totale HPV utbredelse i HNC var noe høyere i denne studien (30,1%) enn i internasjonale studier, som har rapportert 25,9% HPV-DNA-positive tilfeller for disse kreft enheter [39]. Videre vår studie funn var i overensstemmelse med tidligere rapporter som viser at oropharynx var det sekundære området fra den høyeste forekomst av HPV i HNC, og den mest vanlige virale genotype i HPV-assosiert HNC ble HPV-16 [39], [40]. I motsetning til livmorhalskreft, der HPV
E6 /E7
transkripsjoner er identifisert i de fleste HPV DNA-positive prøvene [41], bare 38,4% av HPV DNA-positive HNC tilfeller viste HPV
E6 /E7
mRNA positivitet i denne studien.
E6 /E7
mRNA er regnet som en markør for HPV malign transformasjon, og demonstrere onkogene
E6 /E7
transkripsjon kan tyde på at HPV-drevet carcinogensis er mekanistisk mulig, mens HPV DNA-positive /RNA-negative resultater kan bare reflektere enten lav-nivå transkripsjon eller ikke-transkripsjonell aktiv, og eventuelt en «passasjer» infeksjon. Det faktum at ca 90% av tilfellene med transkripsjonelt aktiv HPV stammer orofarynx støttet ideen om en nær sammenheng mellom HPV og OPC. Tidligere studier har vist at virusmengden av HPV DNA viser stor variasjon mellom hode og nakke regioner, og kopiere numre av DNA i OPCs var mye høyere enn hos ikke-orofarynx HNCs. Den relative lave mangfold av HPV-infeksjon i ikke-orofarynx hode og nakke områder, inkludert hypopharynx, strupehode, og munnhulen, kan relateres til lav
E6 /E7
mRNA uttrykk i svulster på disse stedene [42], [43]. I tillegg Wiest rapportert at de fleste tumorer som ikke uttrykker
E6 /E7
inneholder en mutert
p53
-genet, karakterisert ved at E6 genet blir ofte forstyrret. Mangelen på
E6 /E7
uttrykk kan skyldes E6 genet avbrudd eller endringer i transkripsjonen kontroll [38].
I tidligere studier har pasienter med NPC i Taiwan ofte viste en høyere prevalens av HPV (35-51%) [44], [45], [46] enn i Europa og USA (9-27%) [47], [48], [49]. I tillegg er om lag 22% av munnhulen SCC tilfeller i Taiwan havn høyrisiko HPV DNA [50], [51]. Det er interessant i denne studien, en forholdsvis høy forekomst av HPV ble også funnet i noen ikke-oropharynx HNCs, slik som NPC (30,0%) og munnhulen SCC (29,7%). De fleste av våre pasienter ble rekruttert fra Okinawa, en sørlig øy i Japan meget nær til Taiwan, noe som kan indikere geografisk og rase distinkte HPV egenskaper og at onkogene HPV kan være forbundet med et undersett av karsinomer som involverer nesesvelget og munnhulen. Gitt den lave deteksjon priser av
E6 /E7
mRNA transkripter, men rollen til HPV i disse ikke-orofarynx HNCs trenger ytterligere avklaring.
Denne studien ved bruk av PCR på fersk frosne prøver fra NPCer viste at EBV type A er dominerende og
del-LMP-en
er vanlig i den japanske befolkningen, funnene som er enig med data innhentet fra den samme typen av prøver samlet i Sørøst-Asia og Nord-Afrika [19], [20], [52], [53]. Det motsatte har blitt observert i prøver fra europeiske EBV-assosiert NPC pasienter og friske givere, der villtype
LMP-1
isolater er mer fremtredende enn
del-LMP-en
varianter [54 ]. Den 30 bp delesjon
LMP-1
varianter oppviser transformasjon aktivitet og induserer tumorigen forandringer, og slettingen protein har en lengre halveringstid og en større evne til å aktivere NF-kB og JNK /AP1 i epitel-celler, og dermed bidra til en mer ondartet fenotype NPC [18], [55]. Fordelingen egenskapene til EBV varianter kan tyde på større tumorigent potensialet i
del-LMP-en
i endemiske områder i Sørøst-Asia og Nord-Afrika sammenlignet med vill-type EBV. Men motstridende funn av ingen signifikante forskjeller i hyppigheten av
del-LMP-en
i halsen-vaskeprøver mellom endemiske og ikke-endemiske områder i Kina [56] understreker behovet i fremtidig forskning for å avklare om
del-LMP-en
er faktisk en NPC fenotype-korrelert polymorfisme og ikke en geographical- eller etnisitet relaterte polymorfisme.
Selv om bare litt over halvparten av tilfellene med EBV type B inneholdt villtype
LMP-en
de fleste av tilfellene med EBV type-A inneholdt
del-LMP-en
. Våre funn er i samsvar med en tidligere studie fra Korea [19], der de fleste (87%) av type A EBV utstilt
del-LMP-en
variant og type B EBV utstilt vill skriv
LMP-1
oftere. Interessant, vill-type
del-LMP-en
ble ikke bare finnes i 64,3% av type B EBV men var dominerende (64,1%) i type A EBV i perifere mononukleære blodceller fra friske bærere [57]. Videre Correa et al undersøkte 7 AIDS-pasienter med primær sentrale nervesystemet lymfom og fant at
del-LMP-en
ble alltid oppdaget med type B EBV [58], som var forskjellig fra funnene i NPC. Til sammen den sterke tilknytningen av EBV type og
LMP-1
varianter kan være på grunn av iboende egenskapene til EBV. [19].
