Abstract
Carnosine, en naturlig forekommende dipeptide, har nylig blitt vist å ha anti-tumor aktivitet. Men den underliggende mekanisme uklart. I denne studien undersøkte vi effekten og mekanismen for karnosin på cellelevedyktigheten og proliferasjon av dyrkede humane magekreft SGC-7901-celler. Carnosine behandling fremkalte ikke celle apoptose eller nekrose, men redusert proliferativ kapasitet på SGC-7901 celler. Seahorse analyse viste SGC-7901 celler dyrket med pyruvat har aktiv mitokondriene, og er avhengig av mitokondrie oksidativ fosforylering mer enn glykolyse vei for generering av ATP. Karnosin markert redusert absoluttverdien av mitokondrial ATP-linked åndedrett, og redusert maksimalt oksygenforbruk og reserveluftkapasitet, som kan redusere mitokondriefunksjon korrelert med proliferativ potensial. Samtidig Carnosine også redusert ekstracellulært forsuring hastighet og glykolyse av SGC-7901 celler. Våre resultater antydet at Carnosine er en potensiell regulator av energi metabolisme av SGC-7901 celler både i anaerob og aerobic trasé, og gitt en ledetråd for preklinisk og klinisk evaluering av Carnosine for magekreft terapi
Citation. Shen Y, Yang J, Li J, Shi X, Ouyang L, Tian Y, et al. (2014) Carnosine Hemmer spredning av menneskelige magekreft SGC-7901 Cells gjennom Begge de mitokondrie respirasjon og glykolyse Pathways. PLoS ONE 9 (8): e104632. doi: 10,1371 /journal.pone.0104632
Redaktør: Salvatore V. Pizzo, Duke University Medical Center, USA
mottatt: 14 februar 2014; Godkjent: 15 juli 2014; Publisert: 12. august 2014
Copyright: © 2014 Shen et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Natural Science Foundation National of China (81102427), og delvis støttet av Zhejiang Provincial vitenskapelige Foundations (Y2110322), Program for Zhejiang ledende team of S T innovasjon (2010R50048) og Wenzhou Science and Technology Project (2010S0094 ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er en av de mest vanlige ondartede sykdommer i verden. I de økonomisk utviklingsland, er magekreft den andre årsak til kreft-relaterte dødsfall [1], [2]. Til tross for den forbedring i kirurgisk og multimodal terapi, er den samlede 5 års overlevelse fremdeles lav (15% til 35%) på grunn av de høye gjentakelse priser, invasjon og metastase [3]. Derfor, i dag, for å finne mer effektive anti-tumor legemidler med færre bivirkninger er nødvendig.
L-Carnosine (β-alanyl-L-histidin) er en naturlig forekommende dipeptide som er syntetisert av endogen Carnosine syntetase. Det er vidt fordelt i hjernen hos pattedyr, skjelettmuskel, magesekk, nyrer, hjerte og hud [4], [5]. Så langt har ikke mye er kjent om dets fysiologiske funksjon, men flere mulige roller har vært vurdert, slik som nevrotransmitter, anti-inflammatorisk middel, frie radikaler, mobilt organisk pH-buffer og metallchelator [6], [7]. Det har blitt rapportert at karnosin er en potensiell terapeutisk middel for behandling av Alzheimers sykdom, slag, diabetes og andre sykdommer i sanseorganene [8], [9]. Bare nylig, ble det vist at karnosin kan også ha en anti-tumorigen effekter. For eksempel har karnosin blitt rapportert å ha evnen til å hemme ondartet gliom vekst [10], og denne effekten kan være mediert av en innflytelse på glykolytisk energimetabolismen, er det brukt karakterisert metabolske fenotypen observert i tumorceller, kjent som Warburg effekt [11 ], [12].
Nylig, har betydningen av mitokondrier som oksygen sensorer samt produsenter av ATP blitt et samlingspunkt for kreftforskning, og studier har vist et viktig fenomen som mitokondrie metabolisme, spesielt sitronsyre syklus aktivitet er viktig for rask spredning av flere cancercelletyper [13], [14]. Imidlertid, i tilfelle av humane magecancerceller, er lite informasjon tilgjengelig i hvilken grad glykolyse og mitokondriell oksidativ fosforylering (OXPHOS) bidrar til den cellulære energiproduksjon og hurtig spredning. Hvorvidt karnosin kan også hemme veksten av humane magecancerceller er ukjent. Og om den hemmende effekten av Carnosine på kreftcellene vekst er også knyttet til sin handling på mitokondrie respirasjon og OXPHOS er fortsatt uklart.
Nylig, Seahorse Biovitenskap XF96 ekstracellulær Flux Analyzer har blitt brukt til samtidig og kontinuerlig overvåke både aerobic og glykolytiske komponenter i celle bioenergi [15]. Derfor, i denne studien, utforsket vi effektene av Carnosine på veksten av menneskelige mage kreftceller og for ytterligere å karakterisere bioenergetisk profilen til cultured human magekreft celle SGC-7901 og rollene til Carnosine i SGC-7901 celler energiomsetningen med Seahorse Biovitenskap XF96 ekstracellulær Flux Analyzer og andre relaterte teknologier.
Materialer og metoder
Reagenser
L-Carnosine, natrium pyruvat, rotenon, karbonyl cyanid p-trifluormetoksyfenylamidoksim-hydrazone (FCCP), antimycin A, 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-diphenyltetra-tetrazoliumsaltet-bromid (MTT), metanol, melkesyre var fra Sigma (St. Louis, MO, USA). Penicillin, streptomycin, L-glutamin, trypsin, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM), føtalt bovint serum var fra GIBCO-BRL (Grand Island, NY, USA). Annexin V-FITC /PI apoptose deteksjon kit, BCA Protein Assay Kit og ATP Assay Kit ble kjøpt fra Beyotime Institutt for bioteknologi ((Nanjing, Kina). XF analysemedium og XF kalibreringsløsning ble kjøpt fra Seahorse Bioscience.
Cell kultur
menneskelig magekreft cellelinje SGC-7901 (SGC-7901), human lever leverkreft cellelinje (HepG2) og rotte C6 glioma cellelinje (C6) ble kjøpt fra Shanghai Institute cellen bank, Chinese Academy of Science (den opprinnelige kilden er American Type Culture Collection, ATCC, Manassas, VA, USA). Cellene ble dyrket i DMEM medium supplementert med 10% føtalt bovint serum (FBS), 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin, og holdt ved 37 ° C og 5% CO
2 i en fuktet inkubator. cellene ble trypsinert ved et forhold på 01:03 etter konfluens ved bruk av 0,25% trypsin. subdyrket celler ble sådd ut på 96-, 24- eller seks-brønns plater på tettheter av 2 × 10
3, 5 × 10
4, 2 × 10
5 eller 1 × 10
6 celler /brønn, henholdsvis.
MTT-analysen reduksjon
Cell metabolsk aktivitet ble overvåket ved kolorimetrisk MTT-assay som tidligere beskrevet [16]. I korthet ble cellene dyrket på 96-brønners plater, og det var 6 brønner i hver gruppe. På slutten av forsøkene ble cellene inkubert med 0,5 mg /ml MTT i 4 timer ved 37 ° C. Deretter ble supernatanten sjiktet fjernet, og 100 ul dimetylsulfoksid ble tilsatt til hver brønn. MTT metabolisme ble kvantifisert spektrofotometrisk ved 570 nm i en mikroplateleser Biorad. Resultatene ble uttrykt som prosentandelen av MTT-reduksjon, idet absorbansen kontrollceller som 100%.
kolonidannelse assay
Celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved tetthet på 100-200 celler per brønn, og deretter ble behandlet med karnosin (20 mM). Kloner ble tillatt å vokse i 14 dager i DMEM kulturmedium supplert med 10% FBS, 100 U /ml penicillin G og 100 ug /ml streptomycin. Celler ble deretter fiksert med 70% etanol og farget med Coomassie Brilliant Blue for analyse av kolonidannelse som tidligere beskrevet [17].
Flowcytometriske Assay av celledød
Celledød ble kvantifisert ved Annexin V-FITC-PI (propidiumjodid-) dobbel flekker, ved å bruke en Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit i henhold til produsentens forslag. I korthet ble cellene sådd ut i 6-brønns plater i DMEM-medium. Celler ble behandlet med 20 mM karnosin i 48 timer, og deretter ble samlet og vasket to ganger i iskald PBS, resuspendert i bindingsbuffer ved en tetthet på 1 x 10
6 celler /ml. Celler ble inkubert samtidig med fluorescein-merket Annexin V og PI i 20 minutter og analysert ved strømningscytometri. Annexin V-FITC genererte signaler ble detektert med et FITC-signaldetektor (FL1, 525 nm). PI signaler ble overvåket ved hjelp av en detektor som er reservert for utslipp fykoerytrin (FL2, 575 nm). Data ble analysert ved hjelp av Cell quest programvare fra BD.
ekstracellulær Flux Technology
For å måle oksygenforbruk rate (OCR) og ekstracellulære forsuring rate (ECAR) av celler i ulike forhold, en Seahorse XF96 ekstracellulære Flux Analyzer (Seahorse Bioscience, Billerica, MA, USA) ble brukt. Dette instrumentet gir mulighet for sensitiv måling av glykolyse og flere parametere av mitokondriefunksjon, inkludert basal OCR, ekstra luftkapasitet, maksimal OCR, ATP bundet respirasjon og proton lekkasje fra heft intakte dyrkede celler. Etter grunnlinjemålinger ble OCR og ECAR målt etter sekvensiell tilsetning til hver brønn 20 pl oligomycin, FCCP og rotenon, for å nå arbeidskonsentrasjoner på 1 ug /ml, 1 uM og 1 jjM, respektivt. Alle analyser ble utført ved anvendelse av en seeding tetthet på 10000 celler /brønn i 200 ul DMEM i en XF96 cellekultur mikroplate (Seahorse Bioscience). Cellene ble byttet til ubufret DMEM supplert med 2 mM natriumpyruvat og 20 mM karnosin en time før starten av forsøket og holdt ved 37 ° C. OCR er rapportert i enheten av picomol per minutt og ECAR er rapportert i milli-pH-enheter (mph) per minutt.
Fastsettelse av ATP Produksjon
ATP-analysen ble utført i henhold til produsentens instruksjon. Kort beskrevet, ble høstet dyrkede celler lysert med en lyseringsbuffer, etterfulgt av sentrifugering ved 10.000 x g i 2 min, ved 4 ° C. Til slutt, i 6-brønners plater, ble nivået av ATP bestemmes ved å blande 20 ul av supernatanten med 100 ul av luciferase-reagens, som katalyseres lyset produksjon fra ATP og luciferin. Luminance ble målt av en monokromator mikroplateleser. Standardkurven ble også generert og proteinkonsentrasjonen i hver gruppe ble bestemt ved anvendelse av BCA-proteinanalysesettet. Total ATP-nivåer ble uttrykt som nmol /mg protein.
HPLC-analyse av ekstracellulær melkesyre
Konsentrasjonen av melkesyre i den cellefrie supernatant ble målt ved hjelp av væskekromatografi (HPLC ) kombinert med en ultrafiolett-detektor ved hjelp av teknikken som er beskrevet tidligere. I korte trekk ble de preparerte analysates separert på Ecosil C-18 revers kolonne (3 mikrometer, 250 mm x 4,6 mm) med løsemiddel A og væske B [0,1 mol /l NH
4H
2PO
4 ( pH 3,4) fortynnet volum /volum i metanol 97:3] med en strømningshastighet på 0,5 ml /min. Temperaturen i kolonnen ble opprettholdt ved 25 ° C, og bølgelengden for UV-påvisning ble satt til 210 nm.
Mitokondriell membranpotensialet vurderings
Endringene i forhold mitokondriemembranpotensialet (Δ
Ψ
m) ble vurdert ved hjelp av lipofile kationiske sonde JC-en 5,5 «, 6,6′-tetraklor-1,1′, 3,3»-tetraetyl-benzamid azolocarbocyanine jodid (JC-1; molekylære prober). Fargestoffet JC-1 gjennomgår en reversibel endring i fluorescens utslipp fra grønn til grønn oransje som Δ
Y
m øker. Celler med høy Δ
Ψ
m skjema JC-1 aggregater og fluor rød; de med lav Δ
Ψ
m inneholde monomere JC-1 og fluoresce grønt. Etter behandling med karnosin i 48 timer ble kulturmediet fjernet og cellene, dyrket på dekkglass, ble inkubert i mørket med JC-1 ved en sluttkonsentrasjon på 2 mM i 20 min. Cellene ble skylt med PBS to ganger og spent på 488 nm med et Olympus BX-51 fluorescens mikroskop.
MtDNA kopiantall måling
Absolutt mtDNA Kopier nummer ble målt ved å sammenligne PCR forsterkning av en mitokondriene fragment [menneske, NADH-ubiquinone oksidoreduktase kjeden 4 (ND4)] med en kjernefysisk amplicon (human, β-actin) fra DNA isolert ved hjelp av en Qiagen DNA mini kit. Primer sekvenser er som følger: human β-aktin (forover: 5′-ACCCACACTGTGCC CATCTAC-3 «; omvendt: 5′-TCGGTGAGGATCTTCATGAGGTA-3′); menneskelig ND4 (frem: 5»-TCCTCCTATCCCTCAACCCC-3 «; omvendt: 5′-CACAATCTGATGTTTT GGTTAAAC-3»). DNA-templater ble fremstilt av områder som strekker seg over hvert fragment ved hjelp av PCR-amplifikasjon. Fortynninger fra 1 x 10
8 ned til 1 x 10
2 kopier av isolerte DNA ble brukt til å generere en standardkurve for kvantifisering. PCR veksling besto av et aktiveringstrinn ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser på 5 sekunder ved 95 ° C og 30 sek ved 58 ° C. Alle PCR ble utført på en Bio-Rad CFX leder Real-Time PCR System (Applied biovitenskap).
Statistical Analysis
Alle data representerer tre eller flere uavhengige eksperimenter. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. Statistiske analyser ble utført av SPSS 11.5 for Windows. Enveis ANOVA (analyse av varians), etterfulgt av LSD (minst signifikant forskjell) eller Dunnetts T3
post-hoc
test (hvor like varianser ikke ble antatt) ble påført for multiple sammenligninger, mens t-test var brukes til sammenligninger mellom to grupper.
P
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Effekt av Carnosine på SGC-7901 celler levedyktighet
For å bestemme effekten av Carnosine på. human magekreft SGC-7901 celler levedyktighet, MTT reduksjon analysen ble brukt. Resultatene viste at karnosin behandling signifikant redusert cellelevedyktighet i en tids- og konsentrasjonsavhengig måte. Karnosin ved konsentrasjoner på 5 og 20 mM markert redusert cellelevedyktighet til 84,0% og 57,9% av kontrollen ved 24 timer, og til 73,5% og 45,9% av kontroll etter 48 timer, henholdsvis (fig. 1A). Imidlertid karnosin i en konsentrasjon på 1 mM påvirket ikke SGC-7901-celler levedyktigheten ved 24 eller 48 timer. Vi videre brukt flowcytometri for å analysere hvorvidt Carnosine kan føre til SGC-7901 celle nekrose eller apoptose. Overraskende nok viste resultatene at karnosin behandling i 48 timer, førte ikke til nekrotiske eller apoptotisk celledød i SGC-7901-celler (Fig. 1B). Fordi MTT reduksjon er også tolkes til å være en indikasjon på cellulær metabolsk aktivitet, og MTT-verdien av en cellepopulasjon er bestemt av både antallet levedyktige celler til stede og deres relative metabolske priser, slik at vi ved å beregne celletallet i et parallelt eksperiment med identisk behandlede SGC-7901 celler ved hjelp av celletelling plate. Vi har funnet at celletallet i karnosin behandlet i 48 timer gruppe var lik den i (fig. 1C) kontrollgruppe, og således indikerer at den reduserte cellelevedyktigheten indusert av karnosin behandling i 48 timer i SGC-7901-celler ble på grunn av metabolske forandringer men ikke på grunn av celledød eller celleformering.
(A) Celler ble forbehandlet med forskjellige konsentrasjoner av karnosin i 24 eller 48 timer, og deretter ble cellenes levedyktighet ble analysert ved anvendelse av MTT-reduksjonsanalysen. Resultatene ble uttrykt som prosentandel av kontroll, og ble viser middelverdi ± SD. n = 10-12.
** P
0,01 vs. kontroll i 24 timer gruppe;
##
P
0,01 vs. kontroll i 48 h gruppe. (B) Celler ble behandlet med 20 mM karnosin i 48 timer, og deretter celledød ble bestemt ved PI og annexin V-FITC farging etterfulgt av strømningscytometri. (C) SGC-7901-celler ble behandlet med 20 mM karnosin og det totale celleantall ble beregnet etter karnosin behandling for 2, 3, 4, 5 og 6 dager ved hjelp av celletelling plate. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. n = 6.
** P
. 0,01 vs. kontroll
For å kontrollere om disse handlingene av Carnosine også finnes i andre kreftceller, ble HepG2 og C6 celler brukes. Resultatene viste at 20 mM karnosin behandling i 48 timer ikke indusere celledød (tabell. S1) eller proliferasjon, men kraftig redusert MTT-reduserende aktivitet både i HepG2 og C6-celler (Fig. S1).
choronic behandlings med Carnosine hemmet SGC-7901 celler kolonier formasjon
for å undersøke om choronic eksponering for Carnosine kan påvirke den proliferative kapasitet på SGC-7901 celler, ble cellene sådd ut ved en lav tetthet (100-200 celler /brønn) og anledning til å danne kolonier i 14 dager i DMEM supplert med 20 mM karnosin. Som vist på fig. 2, choronic eksponering for Carnosine redusert kolonier formasjon til 39,9% av kontroll.
(A) Representative bilder av klonings brønner. Celler ble sådd ut ved lav tetthet i DMEM supplere med eller uten karnosin (20 mM) i 14 dager. Koloniene ble deretter fiksert med 70% etanol og farget med Coomassie Brilliant Blue for analyse av kolonidannelse. (B) Kvantitativ bildeanalyse av koloniene i dyrkede SGC7901 celler. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. n = 6.
** P
. 0,01 vs. kontrollgruppen
bioenergetiske karakterisering av kultivert SGC-7901 celler
Vi undersøkte OCRs og ECAR i dyrkede SGC-7901 celler ved hjelp av en Seahorse XF-96 ekstracellulære flux analysator, som beskrevet tidligere [18]. Basal cellular OCR og ECAR ble funnet å være 161,02 ± 29,58 pmol /min per 10 × 10
3 celler (initial legemer), og 39,31 ± 4,29 mph /min per 10 × 10
henholdsvis 3 celler (fig. 3A). ATP-bundet åndedrett (total basal minus den hastighet med oligomycin, hvor oligomycin er en inhibitor av ATP-syntese) var 96,15 ± 18,34 pmol /min per 10 x 10
3-celler, noe som indikerer at -60% av cellulær oksygen forbruket var relatert til ATP syntese. Samtidig ECAR ble øket til ~250% av grunnlinjen priser i nærvær av maksimal effektiv dose av oligomycin (1 pg /ml), noe som indikerer at cellene skiftet mitokondriell respirasjon til glykolyse. Rotenon (1 mm) redusert OCR til 55,78 ± 8,86 pmol /min per 10 × 10
3 celler (~35% av baseline priser). Den rotenon-resistent sats reflekterer ikke-mitokondrie respirasjon, som inkluderer underlaget oksidering og celleoverflaten oksygenforbruk [19]. Således utgjorde ikke-mitokondriell respirasjon for ~35%, mens mitokondriell respirasjon utgjorde ~65% av det totale cellulær respirasjon. Således, i dyrkede SGC-7901-celler ~92% (60% /65%) av mitokondriell respirasjon ble koblet til ATP-syntese, og ~8% av mitokondriell respirasjon ble redegjort for ved proton lekkasje (Fig. 3B). I nærvær av maksimal effektiv dose av FCCP (1 uM, en frakopling middel som tillater maksimal elektrontransport,), ble det observert en samtidig økning i OCR, og det ble økt til 204 ± 30,24 pmol /min per 10 x 10
3 celler.
(A) real-time analyse av oksygenforbruk (OCR) og ekstracellulære forsuring priser (ECAR) av dyrkede SGC-7901 celler ved perturbing dem med små molekyl metabolske modulatorer. Oligomycin (O, 1 pg /ml), karbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP; F; 1 uM), oksamat (Ox; 100 mM), og rotenon (R; 1 uM) ble injisert i rekkefølge ved de angitte tidspunkter i hver brønn som inneholder SGC-7901 celler etter baseline måling. Hver data representerer middelverdi ± SD. n = 17. (B) Kvantitativ bildeanalyse av OCR på dyrkede SGC-7901 celler. Basal, endogen rate; Oligomycin, ATP-syntase-hemmet rate; FCCP, maksimal frikoblet rate; og Rotenon, rotenon-hemmet hastighet. (C) Basal ECAR og proton produksjonsrate fra målinger tatt i tandem med respirasjonsmålinger. (D) ATP produksjonsrate fra oksidativ fosforylering og glykolyse.
Vi vurderte også den relative bidraget fra glykolyse og OXPHOS i ATP produksjonsrate i SGC-7901 celler. Absolutte quantifications av både glycolytic hastighet og oligomycin sensitive oksygenforbruk hastighet ble målt i SGC-7901 celler. Det ekstracellulære surgjøring hastighet er hovedsakelig på grunn av laktat og bikarbonat produksjon og, når det er kalibrert som det protonproduksjonsrate, indikerer glykolytisk hastighet [15]. Således brukte vi oksamat å hemme laktat dehydrogenase, som konverterer pyruvat til laktat i løpet av det siste trinnet i glykolysen, for å beregne proton produksjonsmengden (fig. 3C). Det er en en-til-en forhold mellom laktatproduksjonshastigheten og ATP produksjonshastigheten fra glykolyse. Den oligomycin følsomme oksygenforbruk ble omdannet til ATP produksjonshastigheten ved bruk av et P /O-forhold på 2,3 [20]. Resultatene viste at SGC-7901-celler dyrket i DMEM (høy glukose) supplert med 2 mM pyruvat gjort minst 93% av deres ATP ved bruk av OXPHOS (Fig. 3D).
carnosin endret bioenergetisk karakterisering av SGC- 7901 celler
Vi har undersøkt effekten av Carnosine på oksygenforbruk rente og ekstracellulære forsuring hastighet i dyrkede SGC-7901 celler. Resultatene i fig. 4 viste at behandling med 20 mM Carnosine for 48 timer redusert basal OCR og ECAR til 141,13 ± 27,06 pmol /min per 10 × 10
3 celler (~87% av kontroll), og 11,32 ± 2,49 mph /min per 10 x 10
3-celler (~27% av kontroll), henholdsvis (fig. 4A, B). ATP-linked åndedrett, proton lekkasje, og ikke-mitokondriell respirasjon var 81,03 ± 17,97, 7,15 ± 3,6 og 52,96 ± 8,40 pmol /min per 10 × 10
3 celler, henholdsvis (fig. 4C, D, E ). Dermed i karnosin behandlet SGC-7901-celler, utgjorde mitokondriell respirasjon for ~62% av den totale cellulær respirasjon, og ~92% (57% /62%) av mitokondriell respirasjon ble koblet til ATP-syntese, og ~8% av mitokondriell respirasjon ble utgjorde ved proton lekkasje. Derfor, redusert Carnosine behandling absoluttverdien av ATP-linked åndedrett, men det gjorde ikke påvirke den relative bidraget frekvensen av ATP-linked åndedrett, proton lekkasje, og ikke-mitokondriell respirasjon til total cellulær respirasjon. Videre fant vi også at Carnosine behandling markant redusert maksimal OCR og reserveluft kapasitet til 161,60 ± 28,46 pmol /min per 10 × 10
3 celler (~79% av kontroll) og 20,47 ± 6,92 pmol /min per 10 × 10
3-celler (~47% av kontroll) (fig. 4F, G).
cellene ble utsådd i spesialiserte mikroplater og dyrket med eller uten karnosin (20 mM) i 48 timer. Cellene ble deretter byttet til ikke-bufret DMEM supplert med 2 mM natrium pyruvat og 20 mM Carnosine, og mitokondrienes funksjon ble vurdert ved hjelp sekvensiell injeksjon av oligomycin, FCCP, og rotenon. (A) Basal OCR, (B) Basal ECAR, (C) ATP-linked OCR, (D) proton lekkasje, (E) ikke-mitokondrie OCR (Non-Mito), (F) maksimal OCR, og (G) reserve kapasitet vises. Resultatene er midler ± SD. n = 6-9.
* P
0,05;
** P
0,01 vs. kontrollgruppen
HepG2 og C6 celler ble også brukt til å ytterligere bekrefte effektene av Carnosine på kreftceller energiomsetningen.. Resultatene viste at 20 mM karnosin behandling i 48 timer markert redusert basal OCR og ECAR av HepG2 og C6-celler, respektivt. Karnosin tillegg også redusert ATP-bundet åndedrett i C6-celler, men ikke i HepG2-celler (Fig. S2). Imidlertid, 20 mM karnosin markert redusert det cellulære ATP-innholdet både i HepG2 og C6-celler, noe som indikerer at glykolyse inhibering var involvert i karnosin handling, i det minste i HepG2-celler (Fig. S2J).
carnosin redusert ekstracellulære melkesyre nivå i kultivert SGC-7901 celler
Fordi Carnosine er en mobil organisk pH buffer, den ekstracellulære forsuring rente analysert i nærvær av Carnosine bruker Seahorse XF96 ekstracellulær Flux Analyzer kan ikke gjenspeiler den reelle glykolyse rate. Så vi brukte også HPLC for å analysere den ekstracellulære melkesyre nivå for å kontrollere effekten av Carnosine på glykolyse i SGC-7901 celler. Våre resultater viste at karnosin behandling markert redusert den ekstracellulære melkesyre nivå til 84% av kontrollen (Fig. 5), som indikerer at karnosin har en potensiell inhiberende effekt på glykolyse i dyrkede SGC-7901-celler.
Cellene ble så dyrket i 48 timer i DMEM med eller uten karnosin (20 mM). Supernatanten ble samlet opp for HPLC-analyse av laktat syre. Data ble uttrykt som gjennomsnitt ± SD. n = 6.
** P
. 0,01 vs. kontrollgruppen
Carnosine endret relative bidraget fra glykolyse og OXPHOS til ATP ladning i SGC-7901 celler dyrket i DMEM mangelen på pyruvat
karakterisert også virkningen av karnosin på endringer av ATP-innholdet og det relative bidraget til glykolysen og OXPHOS til ATP ladning i SGC-7901-celler dyrket i DMEM mangel på pyruvat. Vi målte cellulære ATP-konsentrasjonen i celler eksponert i 45 minutter til seks forhold: kjøretøyet, glykolyse inhibitor 2-DG, FCCP, rotenon, FCCP pluss rotenon, og 2-DG plus FCCP pluss rotenon. Vi fant at karnosin behandling i 48 timer betydelig redusert ATP-innholdet til 62% av kontrollen. 2-DG behandling merkbart redusert ATP-innhold med 48% og 34% i Carnosine fraværende og Carnosine nåværende gruppene sammenlignet med sine egne kjøretøygrupper, henholdsvis. FCCP og FCCP pluss rotenon hver også signifikant redusert ATP-innholdet med 15% og 18% i karnosin fraværende gruppe. Men disse stoffene påvirker ATP-innholdet i Carnosine stede gruppe. Rotenon påvirket ikke ATP-innholdet både i Carnosine fraværende eller tilstede grupper. 2-DG i kombinasjon med FCCP og rotenon i det vesentlige eliminert ATP-produksjon både i disse to gruppene (fig. 6). Dermed to-DG redusert ATP kreve mer enn FCCP eller rotenon gjorde både i Carnosine fraværende og presentere grupper. Disse dataene indikerer at ATP generasjonsskifter fra OXPHOS til glykolyse når mitokondriefunksjonen er nedsatt. ATP kostnad er ikke fullt ut opprettholdes etter hemming av enten glykolyse eller mitokondrienes funksjon i Carnosine fraværende gruppe, mens ATP kostnad opprettholdes etter hemming av mitokondrienes funksjon i Carnosine stede gruppe. Dermed endret Carnosine behandling den relative bidraget av OXPHOS og glykolyse i ATP produksjonsrate i SGC-7901 celler.
Intracellulær ATP-nivå ble målt i respons til glykolyse inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG, 100 mM), mitochondrial uncoupler FCCP (1 uM), og komplekset i-inhibitor rotenon (1 uM) behandling i 45 min, enkeltvis eller i kombinasjon, som vist, i dyrkede SGC7901 celler med eller uten karnosin (20 mM) behandling i 48 timer. ATP-nivået ble uttrykt som% av kontroll, som ble definert som grunnlinjeverdien i celler eksponert kun for kjøretøy. Hver data representerer middelverdi ± SD. n = 6.
** P
0,01 vs. kjøretøy i Carnosine fraværende gruppe,
## P
0,01 vs. kjøretøy i Carnosine fraværende gruppe,
P
0,05,
P
. 0,01 vs. kjøretøy i Carnosine stede gruppe
Effekt av pyruvat på hemmende virkning av Carnosine på SGC-7901 celler mitokondrienes funksjon
for å undersøke om å øke nivået av pyruvat kan reversere hemmende effekt av Carnosine på mitokondriell respirasjon av SGC-7901 celler, ble cellene eksponert for ulike konsentrasjoner av pyruvat. Som vist i tabell. 1, øke nivået av pyruvat ikke kunne reversere inhiberende effekt av karnosin på SGC-7901-celler mitokondriell respirasjon. I tillegg MTT-analysen viste også at ved å øke nivået av pyruvat ikke kunne snu karnosin virkning på SGC-7901-celler mitokondriell metabolisme (fig. 7).
(A) Endring i JC-1 fluorescens med karnosin behandling i dyrkede SGC-7901 celler. Cellene ble behandlet med karnosin (20 mM) i 48 timer, og deretter ble farget med JC-1. Red fluorescens indikerer en polarisert tilstand og grønn fluorescens indikerer en depolarisert tilstand. Skala: 20 mikrometer. (B) MtDNA kopiere nummer i SGC-7901 celler behandlet med eller uten Carnosine.
Effekter av Carnosine på mitokondrie-DNA innhold og mitokondriemembranpotensialet i SGC-7901 celler
Mitokondriell membranpotensialet (Δ
Ψ
m) står for mesteparten av proton-drivkraft brukes til kjøring ATP syntese og har derfor en betydelig rolle i den maksimale ATP-genererende kapasitet [21]. Derfor har vi også brukt den lipofile kationiske sonde JC-en til å utforske om Carnosine undertrykker OXPHOS via undertrykkelse av mitokondriemembranen potensial (Δ
Ψ
m). Resultatene viste at karnosin behandling i 48 timer ikke kan indusere en tydelig forandring av Δ
Ψ
m i dyrkede SGC-7901-celler (Fig. 8A).
SGC-7901-celler ble dyrket i DMEM supplert med økende doser av pyruvat (2, 4, 6 mM) i nærvær eller fravær av karnosin (20 mM) i 48 timer, og deretter ble cellene mitokondrie stoffskifte-aktivitet ble målt ved hjelp av MTT-reduksjon analyse. Resultatene er gjennomsnitt ± SD. n = 8-16.
** P
. 0,01 vs. kontrollgruppen
For å løse tilsynelatende redusert mitokondrie respirasjon indusert av Carnosine, vi også kvantifisert den absolutte mitokondrie DNA (mtDNA) nummer, som er strengt regulert for å opprettholde cellulære energikrav [22]. Til vår overraskelse, resultatene viste at sammenlignet med kontrollceller, de absolutte mtDNA kopiere numre av Carnosine behandlet 7901 celler ble markert økt, og den gjennomsnittlige absolutte mtDNA kopiere tallene var 141,49 ± 7.42 i kontrollcellene og 360,0 ± 59,84 i Carnosine behandlede celler (fig. 8B).
Diskusjoner
Så vidt vi vet, er dette den første rapporten fra bioenergetisk profilen til dyrkede SGC-7901 celler behandlet med og uten Carnosine. Våre viktigste funnene er som følger. Først Carnosine redusert proliferativ kapasitet på SGC-7901 celler. For det andre celler dyrket i DMEM (høy glukose) supplert med 2 mM pyruvat laget ~93% av ATP ved hjelp OXPHOS. Tredje, Carnosine utøvde sin hemmende effekt på SGC-7901 celler spredning gjennom å hemme glykolyse, OXPHOS og mitokondrielle åndedrett av cellene, og disse handlingene av Carnosine ble også funnet i HepG2 og C6 celler. Dermed Carnosine bør vurderes sammen med den økende bevæpning av forbindelser i ulike stadier av narkotika utvikling som er rettet mot svulsten metabolisme, en av de viktigste kjennetegnene ved tumor [23].
På grunn av sitt brede spekter av aktivitet, Carnosine kan considerded som en terapeutisk faktor ved behandling av mange sykdommer. For eksempel har sink carnosin vært brukt for gastrisk helse og for tarmen reparasjon [24]. Nylig har studier viste transformerte celler har ikke vokse i MEM inneholdende høye konsentrasjoner av karnosin, og karnosin kan administreres som et medikament in vivo for å inhibere veksten av maligne celler [25]. Men det måtte bli spurt om Carnosine kan hindre vekst av menneskelige mage kreftceller i tillegg til ondartede celler som har blitt rapportert tidligere.
