Abstract
Den epidemiologiske sammenhengen mellom statin bruk og redusert risiko for avansert prostatakreft tyder på at statiner kan hemme prostatakreft utvikling og /eller progresjon. Studiene ble utført for å fastslå effekten av en modell statin, atorvastatin (ATO), på spredning og differensiering av prostatakreftceller, og å identifisere mulige mekanismer for ATO handling. ATO hemmet
in vitro
spredning av både LNCaP og PC3 menneskelige prostata kreft celler i en dose- og tidsavhengig måte. Jo større inhibitorisk aktivitet av ATO i PC3-celler var assosiert med induksjon av autophagy ved at cellelinjen, som vist ved øket ekspresjon av LC3-II. MIR-182 ble gående oppregulert ved ATO i PC3-celler, men ikke i LNCaP-celler. ATO oppregulering av MIR-182 i PC3 cellene ble p53-uavhengig og ble reversert av geranylgeraniol. Transfeksjon av MIR-182 hemmere redusert uttrykk av MIR-182 ved 98% og svekket den antiproliferative aktivitet av ATO. MIR-182 uttrykk i PC3 cellene ble også økt som svar på stress indusert av serum tilbaketrekking, noe som tyder på at MIR-182 oppregulering kan oppstå på grunn av ernæringsmessig stress. BCL2 og P21 ble identifisert til å være potensielle mål gener fra Mir-182 i PC3 cellene. BCL2 ble nedregulert og p21 ble oppregulert i PC3 celler eksponert for ATO. Disse data tyder på at Mir-182 kan være en stress-responsive miRNA som formidler ATO handling i prostatakreftceller
Citation. Peng X, Li W, Yuan L, Mehta RG, Kopelovich L, McCormick DL (2013 ) Hemming av spredning og Induksjon av Autophagy av Atorvastatin i PC3 prostata kreft celler korrelerer med nedregulering av BCL2 og oppregulering av MIR-182 og p21. PLoS ONE åtte (8): e70442. doi: 10,1371 /journal.pone.0070442
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 21 mars 2013; Godkjent: 18 juni 2013; Publisert: 01.08.2013
Copyright: © 2013 Peng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av kontrakt N01-CN-43303 fra Division of Cancer Prevention, National Cancer Institute, Department of Health and Human Services. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Statiner brukes mye for forebyggelse og behandling av hyperkolesterolemi; den kolesterolsenkende aktiviteten av statiner skjer gjennom deres hemming av 3-hydroksy-3-metyl-glutaryl-koenzym A (HMG-CoA) reduktase, nøkkelenzymet i kolesterolbiosyntese [1], [2]. I tillegg til effekter på kolesterol biosyntese, har statiner som atorvastatin (ATO) vakte stor interesse for deres mulige verktøy for kreft forebygging og behandling [3], [4].
Resultatene fra flere epidemiologiske studier og meta -analyses foreslå en invers sammenheng mellom statin bruk og prostata kreftrisiko, særlig risikoen for fremskreden eller metastatisk prostata kreft [5], [6], [7]. Nyere data fra studier i eksperimentelle prostatakreft modeller viser at samtidig bruk av statiner med andre midler kan gi additiv eller synergis kreft effekter [4], [8]. Flere mulige mekanismer har blitt identifisert gjennom hvilke statiner kan modulere kreft progresjon; disse mekanismene omfatter hemming av celleproliferasjon, induksjon av autophagy og apoptose, og inhibering av angiogenese [3], [9], [10]. Statiner er potente inhibitorer av mevalonat biosyntese [11], noe som resulterer i hemming av protein prenylation; de antiproliferative og kreft effekter av statiner kan bli påvirket gjennom denne veien. Imidlertid er den spesifikke biokjemiske mekanisme (r) gjennom hvilken ATO-systemet og andre statiner utøve kreft forebyggende og /eller terapeutisk aktivitet i prostata forblir stort sett udefinert.
Autophagy er en cellulær prosess der makromolekyler og organeller blir degradert i perioder av cellulært stress forbundet med næringsutarming, infeksjon, eller apoptose [9]. Nyere
in vitro
data viser at ATO kan indusere autofagi og autofagi-assosiert celledød i PC3 prostatakreftceller [9]. På bakgrunn av dette, induksjon av autophagy gir en potensiell mekanisme gjennom hvilken hemming av prostatacancer progresjon av ATO kan utføres. I PC3 prostata kreft celler, induserer ATO autophagic flux, cellesyklus arrest og celledød [9]. I denne prosessen, induksjon av autophagy ser ut til å være et nødvendig trinn før celledød [9], [12].
mirnas er små ikke-kodende RNA som kontrollerer genekspresjon ved å utløse oversettelse undertrykkelse eller degradering av mRNA [13], [14]. mirnas synes å være involvert i regulering av et bredt område av cellulære prosesser, og endrede mønstre av miRNA ekspresjon er sett i en rekke patologiske tilstander. Samle bevis tyder på at miRNA uttrykket endres i kreft i flere områder, blant annet prostata [15], [16], [17]; endringer i ekspresjonen av spesifikke mirnas kunne tilveiebringe en mekanisme som farmakologiske midler og diett manipulasjoner kan hemme induksjon av kreft og /eller progresjon. I tillegg kan miRNA profilering være nyttig ved karakterisering av molekyl signaturer av neoplasmer [18] og identifisere potensielle mål for utvikling av anticancer legemidler [19]. For eksempel er ekspresjon av mirnas i kreftceller modulert ved kreftbehandling som doksorubicin og trastuzumab [20], [21]. Likeledes kan modulering av miRNA ekspresjon av diett komponenter som folat, retinoider, og curcumin til grunn for sine kreftforebyggende aktivitet [18]. På bakgrunn av dette, hypotese vi at endringer i miRNA uttrykket kan være ansvarlig for, eller assosiert med, ATO handling i prostatakreftceller, og at endret uttrykket av spesifikke miRNAs er knyttet til induksjon av autophagy av ATO.
materialer og metoder
Reagenser
Atorvastatin (ATO) ble levert av chemopreventive Agent Repository vedlikeholdes av Seksjon for Cancer Prevention, National Cancer Institute, Rockville, MD. ATO ble oppløst i DMSO (50 mM) og ble lagret ved -20 ° C før bruk. Geranylgeraniol (GGOH), farnesol (FOH), Q10, squalen, og MTT (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid) ble innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO ).
cellelinjer, cellekultur og celleproliferasjonsanalyse
Menneskelige prostatakreftceller (PC3 celler og LNCaP celler) ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Underlinjer av PC3 celler (kloner 7, 19 og 20) som ble etablert gjennom klonal seleksjon [22] ble vennlig levert av Dr. Ann R. Kennedy ved University of Pennsylvania. Alle prostatakreftcellelinjer ble dyrket i RPMI medium inneholdende 10% FBS. Celleproliferasjon ble kvantifisert ved anvendelse av MTT-analysen eller krystallfiolett (CV) analyse, eller ved direkte celle-telling ved hjelp av et Z2 Coulter partikkelteller (Beckman Coulter, Brea, CA). Foreløpige studier som er utført i vårt laboratorium har vist at absorbans (OD verdien) for både MTT og CV-analyser er proporsjonal med celletallet.
Western Blot analyse
ved 40-50% konfluens, celler ble utsatt for ATO i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Etter eksponering ble cellelysater fremstilt, og 50 ug totalt protein ble påsatt for western blot-analyse. LC3-II polyklonale antistoff ble kjøpt fra Abgent (San Diego, California). BCL2 og p21 mus monoklonale antistoffer var fra NeoMarker (Fremont, CA). Actin polyklonale antistoff og α-tubulin, p53 og PCNA monoklonale antistoffer og alle sekundære antistoffer ble innkjøpt fra Santa Cruz Biotech (Santa Cruz, California).
Microarray analyse
PC3 og LNCaP celler ble sådd i kulturskåler, slik at cellene nådde ~ 30% konfluens på dag 2. på dette tidspunkt kulturmedium ble erstattet og cellene ble utsatt for ATO (10 uM) i 24 timer. Total RNA som skal brukes i både mRNA og miRNA analyser ble isolert og renset ved anvendelse av Ribopure RNA isolering sett (Invitrogen, Grand Island, NY). mRNA microarray og miRNA rekke profilering ble utført av slekten BIOSYSTEM (Northbrook, IL) ved hjelp av Agilent menneske v2 GE 4x44K arrays og Agilent menneskelige miRNA v14 Rev.2 arrays, henholdsvis; parallell microarray og miRNA profilering ble utført ved hjelp av de samme totale RNA prøver. Data ble analysert ved hjelp av Agilent Feature Extraction og GeneSpring GX v7.3.1 programvarepakker. Microarray-filer for de 4 prøvene analyseres i denne rapporten er tilgjengelig på GEO, tiltredelse GSE46376.
Kvantitativ RT-PCR
Total RNA ble ekstrahert med TRIzol reagens (Invitrogen), og mRNA analyser ble utført som tidligere beskrevet [23]. To RT reaksjoner for hver prøve ble slått sammen og fortynnet med en lik mengde av DNase /RNase-fritt vann. Real-time PCR ble utført med 2 mL fortynnet RT produkt i en MyiQ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, Hercules, CA) ved hjelp av iQ ™ SYBR Grønn PCR Supermix (Bio-Rad) i henhold til produsentens instruksjoner [24] . Gene-spesifikke primere ble utformet med Primer 3 (https://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). Aktin ble anvendt som en referanse gen for normalisering av data. Fold inductions ble beregnet ved hjelp av formelen 2
– (ΔΔCt), hvor ΔΔCt er ΔCt
(behandling) – ΔCt
(kontroll), er ΔCt Ct
(mål gen) – Ct
(aktin) og Ct er syklusen hvor terskelen er krysset
for miRNA analyse ble 20 ng av total RNA brukes for cDNA syntese av Taqman mikroRNA Reverse Transcription kit (Invitrogen).; miRNA uttrykket nivåer ble kvantifisert ved bruk av Taqman mikroRNA analysen (Invitrogen) ved å følge produsentens instruksjoner. Relative uttrykk nivåer av miRNA ble normalisert til U6 snRNA og beregnes som tidligere rapportert [25].
miRNA Transfeksjon
miRNA transfections ble gjennomført i PC3 celler ved hjelp lipofectomine 2000 (Invitrogen) etter produsentens protokoll . PC3-celler ble dyrket over natten i normal vekstmedium, så transfektert med MIR-182 etterligne (Sigma) eller MIR-182-inhibitor eller negativ kontroll i OPTI-MEM (Invitrogen) inneholdende 3% FBS i 18-28 timer. Den miRNA ligner, inhibitor for MIR-182, og negativ kontroll (Invitrogen) ble hver anvendt i en sluttkonsentrasjon på 20 nM. Transfekterte celler ble deretter dyrket i normal vekstmedium med eller uten ATO behandling for forskjellige tidsperioder.
Statistical Analysis
normalt fordelt parametriske data er presentert som gjennomsnitt ± SD, og ble analysert ved Students t -test eller enveis ANOVA;
post-hoc
analysene ble utført ved hjelp av Tukey multiple sammenligningstest. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av GraphPad programvare (San Diego, California) og Microsoft Office Excel. Forskjeller mellom midler ble ansett for å være signifikant på p. 0,05
Resultater
Differensial Effekter av atorvastatin i LNCaP og PC3 prostata kreft celler
Når administreres ved konsentrasjoner fra 0 -20 uM, ATO hemmet celleproliferasjon i begge LNCaP og PC3-celler i en dose- og tidsavhengig måte; laveste effektive dose i begge cellelinjene var 2,5 mikrometer (data ikke vist). Representative vekstkurver for LNCaP og PC3-celler dyrket i fravær og nærvær av ATO (10 uM) er gitt i fig. 1A. Ved en konsentrasjon på 10 uM, ATO induserte en sammenhengende, tidsavhengig inhibering av LNCaP-celleformering i løpet av den 6-dagers eksponeringsperiode; ingen tegn på celledød ble sett i LNCaP-celler eksponert for ATO ved 10 pM i denne perioden. I PC3-celler, ble ATO hemming av celleproliferasjon sett på dag 2; betydelig celledød i PC3-celler ble observert på dagene 4 og 6, som celletellinger i ATO-behandlede grupper i disse tider var under det antall celler som opprinnelig sådd. Disse dataene antyder at (a) PC3 celler er mer følsomme for ATO enn er LNCaP celler, og (b) virkningsmekanismer av ATO i de to prostatakreft cellelinjer kan være forskjellig.
(A) LNCaP og PC3-celler ble sådd ut i 6 brønners plater (36000 celler /brønn) og inkubert over natten og deretter behandlet med DMSO (kontroll) eller 10 pM ATO for 2, 4 og 6 dager. Celle tall er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, n = 3 (B) Mikroskopi av LNCaP og PC3-celler etter behandling with10 uM ATO for 2 og 4 dager. C: LNCaP og PC3-celler ble behandlet med 5 uM ATO i 24 og 48 timer, ble cellelysater oppsamlet for LC3-II-ekspresjon ved hjelp av western blot-analyse. ATO indusert LC3-II uttrykk bare i PC3 cellene.
Virkningene av ATO (10 mm) på celletetthet og cellulær morfologi i LNCaP og PC3 celler etter to og fire dager med eksponering er vist i figur 1B. Morfologiske endringer var til stede i begge LNCaP og PC3 celler eksponert for ATO; endringer celletetthet var i overensstemmelse med endringer i celle tall som er rapportert ovenfor. I prosessen med autophagosome dannelse, er cytosoliske mikrotubulus-assosiert protein lettkjede 3 (LC3) konjugert med fosfatidyletanolamin (PE) ved sin karboksylenden [26], [27]. Det konjugerte LC3 (identifisert som LC3-II) blir deretter satt inn autophagic vesikkelmembranen. LC3-II kan påvises ved immunblot eller farging, og er mye brukt som en biokjemisk markør for celle autofagi [28], [29]. Ved hjelp av LC3-II som en biomarkør for autophagy, western blot analyser viste at ATO-indusert autophagy i PC3-celler, men ikke i LNCaP-celler (fig. 1C). Disse resultatene knytte induksjon av autophagy ved ATO i PC3 prostata kreft celler med celledød i disse cellene; verken autofagi eller celledød ble indusert ved ATO i LNCaP celler.
Effekter av Atorvastatin på celleproliferasjon og LC3-II Expression i PC3 celler
For å bekrefte sammenhengen mellom autofagi og celledød i PC3 prostata kreft celler eksponert for ATO, må vi først preget effektene av ATO på celletall i foreldre PC3 celler og flere PC3 underlinjer [22]. Eksponering av foreldre PC3 celler til ATO (5 mm) hemmet celleproliferasjon med 38% på dag 2 (p 0,01) og 85% (p 0,001) på dag 4 (Fig 2A.). Alle underlinjer (klon 19, 7 og 20) (Fig. 2B-D) var som reagerer på ATO behandling, men PC3 klon 19 var mest følsomme overfor ATO blant de tre testede kloner: etter to og fire dager med eksponering, ATO ( 5 uM) inhiberte proliferasjon av PC3 klon 19 celler ved 70% og 95%, henholdsvis (p 0,001 for begge sammenligninger, fig. 2B); mens to andre kloner (klon 7 og 20) svarer til ATO-systemet på en lignende måte som parentale celler med en viss variabilitet. Dessuten ble det observert signifikant celledød i alle cellelinjene på dag 4. Derfor foreldre og den mest følsomme klon ble valgt for ytterligere karakterisering av LC3-II-ekspresjon. I begge PC3 foreldre og PC3-klone 19 celler, ATO indusert LC3-II uttrykk i en tidsavhengig måte (Fig 2E.); imidlertid, i de følsomme PC3-klon 19 celler, LC3-II viste en raskere og kvantitativt større induksjon av ATO. Disse dataene tyder på at ATO-indusert autofagi aktivitet korrelerer med cellulære følsomhet i respons til ATO, og at autophagy kan være involvert i celledød indusert av ATO i PC3-celler.
(A-D) PC3 foreldre (A) og PC3 klon 19 (B), 7 (C) og 20 (D) celler ble dyrket i 6-brønners plater og behandlet med 5 uM ATO for 2 eller 4 dager. Celle tall er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, n = 3. (C) PC3 paren og PC3-klone 19-celler ble behandlet med 5 uM ATO side om side med den proliferasjonsanalyse (A og B) i 24 timer, 48 timer eller 72 timer. Cellelysater ble samlet for western blot analyse av LC3-II uttrykk.
Effekter av Atorvastatin på genuttrykk i LNCaP og PC3 celler (Microarray Studier og Pathway Analysis)
Microarray analyser var utført for å bestemme effektene av ATO-systemet på genekspresjon og miRNA ekspresjon i LNCaP og PC3-celler; side ved side sammenligninger ble utført ved anvendelse av total RNA prøver isolert fra celler behandlet med ATO (10 μ M) i 24 timer. ATO indusert statistisk signifikante endringer i uttrykket av 1427 gener i LNCaP celler og 3755 gener i PC3 foreldre celler (fig. S1). KEGG trasé analyse av 1427 differensielt uttrykte gener i LNCaP celler identifisert 7 funksjonelle trasé som differensial uttrykk for komponent gener var statistisk signifikant på
p
≤0.01 (tabell S1). Enkelte baner (
f.eks
, kolesterolbiosyntesen, steroid biosyntese.) Var forutsigbar på basis av den kjente aktiviteten til ATO-systemet som en inhibitor av HMG Co-A reduktase; andre kan være representative for den antiproliferative aktivitet av ATO i LNCaP-celler. Som forventet ble det en mye større antall endrede funksjonelle baner (46 pathways) identifisert gjennom KEGG analyse av forskjellig uttrykt gener i PC3 celler eksponert for ATO (tabell S2). I tillegg til veier som overlappet er identifisert i LNCaP celler, ATO modulert flere veier med klare koblinger til celledeling og celledød; disse funksjonelle trasé inkludert DNA replikasjon, cellesyklus, og MAPK signal.
Microarray Studier av atorvastatin og Mirna uttrykk i LNCaP Og PC3 celler
ATO indusert differensial uttrykk for mange miRNAs i LNCaP og PC3 celler . Ved hjelp av cutoff-verdier på 1,5 for fold-endring forskjeller i uttrykk og p 0,05 for statistisk signifikans, ble 131 mirnas forskjellig uttrykt i LNCaP celler eksponert for ATO, og 111 mirnas ble uttrykt forskjellig i PC3 celler eksponert for ATO (Fig S1.).
for å identifisere mirnas hvis differensial uttrykket kan ligge til grunn for ATO cytotoksisitet i PC3 celler, en fold endring cutoff av ≥2.00 ble brukt til PC3 data, etterfulgt av fjerning av miRNAs som retningsendringer i uttrykket var de samme i PC3 og LNCaP celler. Denne strategien identifisert totalt 42 mirnas som ble ulikt regulert av ATO spesielt i PC3 celler (tabell S3).
Mir-182 er opp-regulert av Ato I PC3 celler
For å bekrefte miRNA array-data i PC3 cellene ble QRT-PCR (Taqman teknikk) som brukes til å bekrefte differensial uttrykk for tre mirnas (MIR-555, MIR-654 og MIR-182) identifisert som oppregulert ved ATO og tre mirnas (speil 494, MIR-1255a og MIR-550A) som ble nedregulert ved ATO. Disse spesifikke mirnas ble valgt for videre studier på grunnlag av fold-endring forskjeller i uttrykk sett i microarray studier. MIR-182 (som ble oppregulert ved fire ganger i PC3-celler eksponert for ATO) ble også valgt på grunn av dens kjente forhold til celle spenning [29].
ATO oppregulering av MIR-182 i PC3-celler ble bekreftet ved QRT-PCR (figur 3A.); andre mirnas ble funnet å bli uttrykt kun ved svært lave nivåer, og ekspresjonsnivåene av disse mirnas viste vesentlige forskjeller mellom prøvene. MIR-182 uttrykk ble økt med 56% (p 0,01) på 24 timer og 66% (p 0,01) på 48 timer i PC3 celler eksponert for ATO (fig 3A.). I motsetning til ATO nedregulert MIR-182 i LNCaP-celler med 24% (p 0,01) ved 48 timer (figur 3B.). Disse data tyder på at Mir-182 regulering av ATO i prostatakreftceller er celle-spesifikk, og at oppregulering av MIR-182 kan være involvert i ATO aksjon i PC3 cellene.
(A) PC3 cellene utsatt for 5 uM ATO i 24 timer og 48 timer. Total RNA ble isolert og utsatt for Taqman QRT-PCR analyse ved hjelp primersett for MIR-182. (B) LNCaP-celler ble utsatt for 5 uM ATO i 48 timer, etterfulgt av analyse av MIR-182 uttrykk. Data er sammenfattet fra 3 uavhengige eksperimenter og uttrykt som gjennomsnitt ± SD. ** P. 0,01
Mir-182 Oppregulering av Ato I PC3 celler reverseres ved Geranylgeraniol Co-behandling og er uavhengig av P53 Expression
Vi har tidligere rapportert at MIR-182 er en stress-responsive miRNA i bryst epitelceller [29]. Siden MIR-182 er oppregulert ved ATO, og ATO kan føre cellulært stress ved å hemme mevalonat biosyntese [3], [9], hypotese vi at MIR-182 oppregulering av ATO kan skyldes ATO-indusert cellulært stress. Dersom denne hypotesen er korrekt, vil fjerning av ATO stresset reversere MIR-182 oppregulering. For å evaluere denne hypotese, ble MIR-182 uttrykk kvantifisert i PC3-celler behandlet med ATO ± flere mevalonat metabolitter som syntese inhiberes som et resultat av ATO undertrykkelse av mevalonat biosyntese. Agenter studert medfølgende geranylgeraniol (GGOH), farnesol (FOH), co-enzym Q10 (CoQ10), og squalene. I en forstudie, bare GGOH snudd effektene av ATO på Mir-182 uttrykk i PC3 celler. På bakgrunn av dette ble en definitiv serie eksperimenter utført ved hjelp GGOH og FOH. I samsvar med resultatene av den foreløpige studien, reverseres GGOH effekten av ATO på Mir-182 uttrykk; FOH hadde ingen effekt (Fig. 4A). Vi evaluerte også effekten av GGOH og FOH på ATO-mediert inhibering av celleproliferasjon og induksjon av autophagy i PC3-celler. Som vist på fig. 4B, GGOH reversert også effekten av ATO på celleproliferasjon og LC3-II-ekspresjon; FOH hadde ingen effekt. Disse data viser tydelig at ATO-mediert hemming av biosyntesen av geranylgeraniol, men ikke farnesol, resulterer i oppregulering av MIR-182, undertrykkelse av spredning og induksjon av autofagi.
(A) PC3 celler ble behandlet med 5 mikrometer ATO i 48 timer i nærvær og fravær av metabolittene, inkludert geranylgeraniol (10 uM) og farnesol (10 uM), miR182 ekspresjon ble deretter påvist ved QRT-PCR. (B) PC3-celler ble behandlet med 5 uM ATO for 2 eller 4 dager i nærvær og fravær av geranylgeraniol (10 uM) og farnesol (10 uM), celleproliferasjon (4-dagers behandling) ble evaluert ved MTT-analyse og LC3-II uttrykket (2 dagers behandling) ble undersøkt ved western blot. (C) PC3-celler ble dyrket i normal vekst-medium (10% FBS) over natten, og ble deretter understreket ved dyrking i lavt serum-medium (1% FBS) i 48 timer, etterfulgt av kvantifisering av MIR-182-ekspresjon ved QRT-PCR. (D) p53-ekspresjon ble undersøkt ved western blot-analyse i PC3-celler, MDA-MB-231 brystcancerceller tjente som en positiv kontroll for p53-ekspresjon. For alle søylediagrammer, er data uttrykt som gjennomsnitt ± SD; for QRT-PCR-analyser, n = 3; for MTT-analyse, n = 8; * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001
Vi brukte en annen belastning modell – serum deprivasjon – å bestemme spesifisiteten av MIR-182 svar til ATO og til. bestemme hvorvidt MIR-182 uttrykk er også forsterkes av andre typer stress i PC3-celler. PC3-celler ble dyrket i vekstmedium inneholdende 10% FBS, etterfulgt av dyrkning i to dager i vekstmedium inneholdende bare 1% FBS. Serum deprivasjon for 2 dager økt Mir-182 uttrykk med 26% (p 0,001 Fig. 4C), noe som tyder på at MIR-182 oppregulering i PC3 celler indusert av ulike typer stressfaktorer
p53 er. anses for å være tett forbundet med celle-spenning [30]. På grunn regulering av MIR-182 er nylig blitt rapportert å være p53-avhengig [20], vi undersøkte nivåene av p53-ekspresjon i PC3-celler med eller uten eksponering for ATO. p53 protein er ikke uttrykt i PC3 cellene under enten tilstand (fig. 4D), som viser at MIR-182 regulering av ATO i PC3 cellene er p53-uavhengig.
Ato Regulerer BCL2 Og P21, som er potensielle mål for Mir-182 i PC3 celler
effektene av ATO om potensielle målgener av MIR-182 ble undersøkt for å vurdere hypotesen om at ATO modulering av Mir-182 uttrykk induserer endringer i reguleringsfunksjon. For å møte denne hypotesen, TargetScan (https://www.targetscan.org/) og PicTar (https://pictar.mdc-berlin.de/) ble brukt for å identifisere potensielle mål gener fra Mir-182; gener er identifisert ved hjelp av disse datasimuleringsprogrammer ble siktet ved å bruke microarray data. Gjennom denne iterativ prosess, ble 41 potensielle målgener av MIR-182 identifisert; 24 gener ble oppregulert og 17 gener ble nedregulert ved ATO (tabell S4).
Fordi MIR-182 ble oppregulert ved ATO, de direkte målene for MIR-182 er mest sannsynlig å bli nedregulert. Ved hjelp av differensial genuttrykk cutoff verdier av ≥2.0 med statistisk signifikans satt til p≤0.05 identifiserte vi fem Mir-182 mål gener som ble nedregulert ved ATO i PC3 celler; gener er identifisert gjennom denne prosessen var BCL2, BNC2, FRMD4A, ELL og AMOTL2. QRT-PCR-analyser bekreftet at BCL2 og FRMD4A hver er nedregulert med 65% i PC3-celler eksponert for ATO (p 0,001 for begge gener, og data for BCL2 er vist i figur 5A.). Nedregulering av BCL2 av ATO ble også bekreftet ved proteinnivå (figur 5A).
(A) og amp.; (B) PC3-celler ble behandlet med 5 uM ATO i 48 timer, etterfulgt av QRT-PCR og western blot-analyse av BCL2 (A) og p21 (B). Data er uttrykt som gjennomsnitt ± SD. n = 3. ATO redusert både mRNA og protein uttrykk for BCL2 mens økt både mRNA og protein uttrykk for p21. (C) og amp; (D) PC3-celler ble transfektert med en negativ kontroll (NegCon), MIR-182 etterligne (miR182-mi), eller MIR-182 inhibitor (miR182-i) i 24 og /eller 48 timer, etterfulgt av analyse av ekspresjon av mir -182 (C), BCL2 og p21 (D). C bekrefter vellykket transfeksjon av miR182-mi og miR182-in ved påvisning av økt eller redusert uttrykk av MIR-182. D viser BCL2 og p21 uttrykk status på mRNA (øverst) og proteinnivåer (nederst) på 48 timer etter transfeksjon. MIR-182 overekspresjon redusert BCL2 mRNA uttrykk, men hadde minimal effekt på protein uttrykk; mens MIR-182 knock-down hadde ingen effekt på BCL2 mRNA uttrykk, men økt protein uttrykk. p21 ble positivt korrelert til Mir-182 uttrykk både mRNA og proteinnivåer. Actin eller α-tubulin fungerte som laste kontroller for protein uttrykk.
Vi har også funnet ut at p21 CDK-hemmer, en viktig negativ regulator av cellesyklus, er konsekvent oppregulert i PC3 cellene eksponert for ATO , oppregulering av p21 ved ATO ble demonstrert både på mRNA og proteinnivåene (fig. 5B).
En serie transfeksjonsteknikker studier ble utført for å belyse forholdet mellom ATO eksponering, MIR-182 uttrykk, og BCL2 og P21 mRNA og protein uttrykk i PC3 celler. Som vist på fig. 5C, transfeksjon av MIR-182 ligne økt Mir-182 uttrykk ved 400-500 ganger i begge 24 timer og 48 timer etter transfeksjon; derimot, transfeksjon av MIR-182 inhibitor trykt Mir-182 uttrykk ved 98%. Overekspresjon av MIR-182 sank BCL2 mRNA nivåer med 26% (p 0,05), men hadde ingen signifikant effekt på BCL2 protein uttrykk på 48 timer. Transfeksjon av MIR-182-inhibitor hadde ingen effekt på BCL2 mRNA-ekspresjon, men kunne i betydelig grad øke BCL2 protein ekspresjon (fig. 5D). Disse data tyder på at BCL2 er et direkte mål på MIR-182 i PC3 celler; Siden basalproteinnivået BCL2 allerede var lav, var det lite protein ekspresjon rådighet, som viser ytterligere nedregulering gjennom MIR-182 overekspresjon. Resultatene tyder også på at Mir-182 ikke kan bidra til BCL2 nedregulering i respons til ATO i PC3 cellene.
I motsetning ble p21 ikke identifisert som et direkte mål for MIR-182 ved enten TargetScan eller PicTar . Interessant, p21 uttrykk ble positivt korrelert med Mir-182 uttrykk på både mRNA og proteinnivåer (Fig. 5D). Overekspresjon av MIR-182 økt p21 mRNA uttrykk med 57% (p 0,05), mens knock-down av MIR-182 ved trans MIR-182 hemmer redusert p21 mRNA uttrykk med 36% (p 0,05). Disse data tyder på at p21 er et indirekte mål på MIR-182, og at MIR-182 kan bidra på noen måte til p21 oppregulering av ATO i PC3 cellene.
Effekt av Mir-182 uttrykk på Cell Proliferation som svar på Ato i Pc 3 Cells
for å undersøke den funksjonelle rollen MIR-182 som en formidler av ATO svar, Mir-182 uttrykk ble manipulert ved trans Mir-182 etterligne eller MIR-182 inhibitor i PC3 celler . Transfekterte celler ble utsatt for en lav konsentrasjon av ATO (2,5 uM) i 4 dager, etterfulgt av kvantifisering av celleproliferasjon ved MTT (Fig. 6A) eller CV-analyse (Fig. 6B). 2,5 uM konsentrasjon av ATO ble anvendt for å muliggjøre studier av differensielle responser som følge av manipulasjon av MIR-182 uttrykk. Som vist på fig. 6A, overekspresjon av MIR-182 i ubehandlede celler hemmet spredning med 36% (p 0,001); knock-down av MIR-182 i ellers ubehandlede celler økt spredning med 43% (p 0,001). MIR-182 overekspresjon endret ikke PC3 celle svar på ATO; imidlertid, knock-down av MIR-182 reduserte aktiviteten av ATO-systemet som en inhibitor av celleproliferasjon (fig. 6A). I nærvær av ATO, absorbansen som genereres av MIR-182 hemmer-transfekterte celler økte med 89% (p 0,001, n = 8) i forhold til negative kontroll-transfekterte celler. Fig. 6B viser bilder av CV flekker på 4 dager etter transfeksjon av Mir-182 etterligne og MIR-182 inhibitor i PC3 celler. CV-analysen viste liknende resultater (data ikke vist) som MTT analyse. Disse resultater viser at MIR-182 direkte inhiberer proliferasjon av PC3-celler, og kan også mediere undertrykkelse av celleproliferasjon indusert av ATO.
(A), PC3-celler ble transfektert med MIR-182 etterligne (miR182-mi , 20 nM) og MIR-182 inhibitor (miR182-i, 20 nM) i henholdsvis 48 brønners plater med en miRNA ligne som bekreftet å ha minimal sekvensidentitet med mirnas i human- som en negativ kontroll (NegCon, 20 nM) og deretter behandles med 2,5 uM ATO i 4 dager, ble celleformering bedømt ved MTT-analyse. Absorbans verdier er uttrykt som gjennomsnitt ± SD, *** p 0,001, n = 8. (B) PC3-celler ble transfektert som beskrevet i A, og dyrket i ytterligere 4 dager etter transfeksjon, ble cellene deretter farget med krystallfiolett ved hjelp av standard CV analyseprosedyren; bilder av status celleproliferasjon ble registrert med mikroskopi. (C) PC3-celler ble transfektert med en negativ kontroll eller MIR-182-inhibitor og deretter behandlet med 2,5 uM ATO i 48 timer, ble cellene samlet opp for western blot analyse av LC3-II-ekspresjon. Actin fungerte som en lasting kontroll. En representativ Western blot er vist. Verdiene under hvert bånd representerer normalisert LC3-II intensitet (piksler totalt) i fremlagt western blot som bestemmes av FN-SCAN-IT programvare (Silk Scientific Inc., Orem, UT).
siden ATO induserer autofagi i PC3 celler, brukte vi vestlige blotter og FN-SCAN-IT programvare for å fastslå effekten av MIR-182 på LC3-II uttrykk. Transfeksjon med MIR-182 inhibitor (MIR-182-i) reduserte basal ekspresjon av LC3-II med ~ 30% (n = 3, er en representativ Western blot er vist i fig. 6C).
