Abstract
De tre slit ligander og deres fire ROBO reseptorer har grunnleggende roller i pattedyr utvikling ved å fremme apoptose og repulsing avvikende cellemigrasjon.
spaltene Hotell og
Robos
har dukket opp som kandidat tumorsuppressorgener hvis uttrykk er sperret i en rekke epiteltumorer. Vi viste at deres uttrykk kan bli negativt regulert av kortisol i normale eggstokkene luteal celler. Vi hypotese at etter eggløsning lokalt produsert kortisol ville hemme
SLIT /ROBO
uttrykk i eggstokkene overflaten epitel (OSE) for å lette sin reparasjon, og at dette regulatoriske veien var fortsatt til stede, og kan bli manipulert, i eggstokkene epiteliale kreftceller. Her undersøkte vi uttrykket og regulering av slit /ROBO sti i OSE, eggstokkreft epitelceller og eggstokkreft tumor cellelinjer. Basal
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
uttrykk var lavere i primærkulturer av eggstokkreft epitelial celler sammenlignet med normal OSE (
P
0,05) og i dårlig differensiert Skov-3 celler i forhold til de mer differensierte PEO-14 celler (
P
0,05). Kortisol redusert uttrykk for visse
spaltene Hotell og
Robos
i normal OSE og PEO-14 celler (
P
0,05). Videre CAULKING /ROBO aktivitet redusert apoptose i begge PEO-14 og Skov-tre tumorceller (
P
0,05). Interessant
SLIT /ROBO
uttrykk kan økes ved å redusere uttrykk for glukokortikoid reseptoren ved hjelp av siRNA (
P
0,05). Samlet våre funn tyder på at i den post-ovulatory fase en rolle av kortisol kan være midlertidig hemme SLIT /ROBO uttrykk for å lette regenerering av OSE. Derfor denne veien kan være et mål å utvikle strategier for å manipulere SLIT /ROBO system i eggstokkreft
Citation. Dickinson RE, Fegan KS, Ren X, Hillier SG, Duncan WC (2011) Glukokortikoid Regulering av SLIT /ROBO Tumor suppressor gener i eggstokk Surface Epitel og eggstokkreft celler. PLoS ONE 6 (11): e27792. doi: 10,1371 /journal.pone.0027792
Redaktør: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, USA
mottatt: 04.04.2011; Godkjent: 25 oktober 2011; Publisert: 23.11.2011
Copyright: © 2011 Dickinson et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Wcd er støttet av en skotsk Senior klinisk Fellowship fra den skotske Funding Council og dette arbeidet ble finansiert av CSO (SCD /02). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
skilles Slit glykoprotein og dens robo reseptor ble opprinnelig identifisert som viktige axon veiledning molekyler i utviklings
Drosophila
nervesystemet [1], [2]. Deres rolle er evolusjonært bevares som virveldyr SLIT (SLIT1, SLIT2, SLIT3) og ROBO (ROBO1, ROBO2, ROBO3, ROBO4) også hemme avvikende nevron migrasjon [3]. Men de fleste medlemmer av virveldyr slit og ROBO familier er også uttrykt utenfor nervesystemet og har vært knyttet til utviklingen av en rekke organer, inkludert melkekjertlene og eggstokk [4], [5]. Under organogeneseperioden spalten /ROBO samhandling er tenkt å regulere mange prosesser, inkludert celleproliferasjon, apoptose, adhesjon og migrasjon av ikke-nevronale celler [6], [7].
Molekyler som har viktige roller i utviklingen er ofte dysregulerte i kreft [8]. Faktisk
spaltene Hotell og
Robos
er kandidat tumorsuppressorgener hvis uttrykk er redusert i mange epiteliale tumor celletyper, hovedsakelig gjennom sletting, tap av heterozygositet og promoter region hypermethylation [9]. Dette inkluderer kreft stammer fra reproduktive vev inkludert cervical, prostata og bakterie linjer svulster på eggstokkene [10] – [13]. Nyere funksjonelle studier har også støttet teorien om at spaltene og Robos har svulst suppressor aktiviteter. Slissen /ROBO sti fremmet programmert celledød og /eller redusert spredning av fibrosarkom, øsofagale, hepatocellulær, kolorektal, prostata og bryst carcinoma celler [14] – [17]. SLIT2 også hemmet invasjon av mange forskjellige typer kreftceller, inkludert de fra prostata, bryst, endometrium og eggstokk [13], [18], [19].
SLIT /ROBO veien har nå også vært vist seg å ha fysiologiske roller i normale reproduktivt vev [6]. SLIT /ROBO signale synes å regulere placenta angiogenese og trophoblast funksjon i en autokrin og /eller parakrint måte [20]. I tillegg er de fleste av slissene og Robos er også tidsmessig regulert under normal menstruasjonssyklus i endometrium og er uttrykt i egglederen [21]. Videre er det økt uttrykk for
spaltene Hotell og
Robos
i voksen corpus luteum under sen-lutealfasen av eggstokkreft syklus. På dette tidspunkt slissen /ROBO interaksjonen kan virke til å fremme dens desintegrering ved å stimulere apoptose og hemme migrering av luteal-celler [22]. I corpus luteum og endometrium uttrykk for spalter og Robos er hormonelt regulert. Det ble redusert
SLIT /ROBO
uttrykk i decidualised endometrium på tidlig graviditet [21]. I tillegg luteotrop molekyler, humant choriongonadotropin [23] og kortisol [24], som er økt tidlig i svangerskapet, reduserer uttrykk for
spaltene Hotell og
Robos
i luteal celler [22] .
Rundt 90% av eggstokkene maligniteter er klassifisert som epiteltumorer som antas å stamme fra eggstokkene overflaten epitel (OSE) [25]. Risikoen for kreft i eggstokkene er positivt korrelert med antallet ovulations [26]. Dermed tilbakevendende skader og påfølgende reparasjon av OSE under eggløsningen kan disponere dette vevet til neoplasi [27]. Eggløsning er en inflammatorisk hendelse forstyrre OSE, men krever oppløsning. Denne reparasjonen er tilrettelagt av en økt lokal produksjon av anti-inflammatorisk steroid kortisol via oppregulering av 11ß-hydroksysteroiddehydrogenase type 1 [28].
Vi hypotese at Oslo Børs uttrykke åpninger og Robos og at kortisol kan midlertidig redusere ekspresjonen av disse tumorsuppressorgener å lette overlevelse, formering og migrering av disse cellene i løpet av reparasjonsprosessen. Hvis dette var tilfelle denne veien kan ha en rolle i kreft progresjon eggstokkreft og hvis den forblir aktiv i maligne OSE celler kan det gi terapeutiske strategier for å manipulere disse genene. Vi undersøkte derfor uttrykket, lokalisering og regulering av slit /ROBO sti i OSE. Vi har også undersøkt om spaltene og Robos ble abnormt uttrykt og hormonelt regulert i eggstokkreft celler. Videre analyserte vi den funksjonelle betydningen av en opprørt SLIT /ROBO sti i eggstokkreft celler.
Resultater
spalten /ROBO veien er forskjellig uttrykt i menneskelig OSE, eggstokkreft celler og eggstokkreft tumor celle linjer
SLIT2 og ROBO1 kunne immunolocalised til den normale humane ovarie flate epitel (fig. 1 A-C). RT-PCR-analyse bekreftet uttrykk for
SLIT2 Hotell og
ROBO1
i primærkulturer av OSE og viste at det ikke var noen uttrykk for
SLIT3
,
ROBO2
og
ROBO4
i disse cellene (fig. 1 D). Vi deretter undersøkt uttrykket av disse genene i primærkulturer av ondartede celler avledet fra ascitesvæske av kvinner med ovarialcancer.
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
ble også uttrykt i disse cellene, men kvantitativ analyse viste at de ble redusert med 25-82% i forhold til primærkulturer av normal OSE (fig 2A.) (
P
0,05).
A) Lys-felt mikroskopi av eggstokk viser spesifikk farging for SLIT2 (brun) i Oslo Børs. B) På samme måte positiv ROBO1 (brun) farging ble også observert i OSE. C) Ingen farging ble observert i negative kontroller. Skala barer representerer 100 mikrometer. D) RT-PCR for
spaltene Hotell og
Robos
i kultivert slangen. Med unntak av
SLIT1 Hotell og
ROBO3
medlemmene av
SLIT
og
ROBO
familier ble uttrykt i slangen. FB = fosterets hjerne positiv kontroll; -RT = RT negativ negativ kontroll.
A) Real-time kvantitativ PCR som viser økt
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
i primærkulturer av slange sammenlignet med maligne epiteliale celler dyrket fra ascites av eggstokkreft pasienter. B) RT-PCR viser at både Skov-3 og PEO-14 cellelinjer uttrykte
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1 Hotell og
ROBO2
. C) Real-time kvantitativ PCR viser
SLIT2
,
SLIT3 Hotell og
ROBO2
transkripsjoner ble rikere i godt differensierte PEO-14 celler i forhold til dårlig differensiert SKOV- 3 celler. FB = fosterets hjerne positiv kontroll; -RT = RT negativ negativ kontroll; – = DNA negative negativ kontroll; * =
P
0,05; ** =
P
0,01; *** =
P
0,005
For å bekrefte at ondartede OSE celler hadde redusert uttrykk for
spaltene
og
Robos
vi undersøkt deres uttrykk i to forskjellige eggstokkene tumor cellelinjer. Den PEO-14 cellelinjen er avledet fra en godt differensiert eggstokkene adenokarsinom og har likhetstrekk med flere godartede eggstokkene epitelceller og tidlig eggstokkreft. I motsetning til dette er det SKOV-3 cellelinje avledet fra en dårlig differensiert ovarian adenokarsinom, og er mer karakteristisk for et avansert tumor [29]. Begge disse cellelinjene uttrykte
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1 Hotell og
ROBO2 plakater (Fig. 2B). Men parallelt våre resultater i primærcellekultur,
SLIT2
,
SLIT3 Hotell og
ROBO2
uttrykk ble redusert med mellom 58% og 97% i dårlig differensiert SKOV- 3-celler i forhold til de godt differensierte PEO-14-celler (figur 2C.) (
P
0,05). Selv PEO-14 og Skov-3 celler kan avvike i andre aspekter så vel som deres differensiering status disse dataene tyder på at uttrykk for
SLIT /ROBO
tumorsuppressorgenet veien kan bli redusert under svulst utvikling eller progresjon.
Blokkerings spalten /ROBO interaksjon reduserer apoptose i ovarietumorceller
effekten av slit /ROBO sti på celle overlevelse ble undersøkt ved hjelp av en rekombinant ROBO1 /Fc chimera, som fungerer som en ligand felle å hemme sLIT /ROBO samhandling og direkte hemming av
SLIT2
hjelp siRNA. Behandling av PEO-14 og SKOV-3-celler med ROBO1 /Fc-kimæren ikke påvirke celleformering (
P
0,05, data ikke vist). Men i begge PEO-14 og Skov-3 celler CAULKING handling med ROBO1 /Fc chimera redusert apoptose med 20-21% målt ved en aktivert caspase-3/7 assay (
P
0,05 ) (fig. 3A). Transient transfeksjon av
SLIT2
siRNA redusert utelukkende
SLIT2
uttrykk i både PEO-14 og Skov-3 celler. PEO-14 og Skov-3 celler med redusert
SLIT2
uttrykk hatt en betydelig 17-26% reduksjon i kløyvde caspase-3 og -7 aktiviteter (
P
0,05, paret t- test) (fig. 3B). Dette tyder på at en reduksjon i slissen /ROBO genet vei er assosiert med økt celleoverlevelse.
A) Behandling med ROBO1 /Fc-kimæren redusert caspase-3/7-aktivitet, sammenlignet med behandling PBS /0,1% (vekt /volum) BSA (kontroll) i begge PEO-14 og SKOV-3-celler. B) Transfeksjon med
SLIT2
siRNA redusert caspase-3/7-aktivitet, sammenlignet med behandling med en egge siRNA kontroll. * =
P
. 0,05
Kortisol regulerer negativt uttrykk for
spaltene Hotell og
Robos
i OSE og et godt differensiert ovarian cancer cellelinje
Vi deretter undersøkt hvorvidt ekspresjonen av slissen /ROBO banen i eggstokkene epitelceller ble regulert. I menneskelige eggstokkene luteal celler spalten /ROBO veien kan bli fysiologisk hemmet av kortisol [22]. Som kortisol produseres lokalt i Oslo Børs, og har en anti-inflammatorisk rolle etter eggløsning [30] undersøkte vi om kortisol kunne regulere SLIT /ROBO uttrykk i OSE.
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
uttrykk ble redusert med 25-30% i kortisol ( 1000 nM) behandlet primærkulturer av normal OSE (
P
. 0,05) (figur 4A). Men i primærkulturer av ondartet epitelceller kortisol førte ikke til noen ytterligere reduksjon i uttrykket av disse genene (
P
0,05) (figur 4B.)
A) Real. -time kvantitativ PCR viser at Kortisol (1000 nM), sammenlignet med etanol carrier kontroll, redusert
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2
og
ROBO4
uttrykk i primærkulturer av slangen. B) Kortisol forandret ikke uttrykk for
spaltene Hotell og
Robos
i primærkulturer av eggstokkene epiteliale kreftceller. C)
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1 Hotell og
ROBO2
uttrykk ble betydelig redusert ved Kortisol i mer differensierte PEO-14 celler. D) Men uttrykket av disse
spaltene Hotell og
Robos
ikke ble regulert av cortisol i dårlig differensierte Skov-3 celler. E) Cortisol reduserte nivåer av utskilt SLIT2 protein i PEO-14-celler (kontroll sekresjon er 0,5 ng /ml). F) Cortisol påvirket ikke utskilte nivåer av SLIT2 protein i SKOV-3-celler (kontroll sekresjon er 0,5 ng /ml). * =
P
0,05; ** =
P
. 0,01
De PEO-14 og Skov-3 ovarian tumor cellelinjer har også potensial til å svare på kortisol behandling som de uttrykker glukokortikoid reseptor (GR). I tillegg uttrykker de den mineralkortikoid-reseptoren (MR), men uttrykker ikke progesteronreseptoren (PR) (Fig. 5A). I de mer differensierte PEO-14 celler, kortisol redusert uttrykk for
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1 Hotell og
ROBO2
av 13-31% (
P
0,05) (fig. 4C). Videre kortisol behandling redusert utskilt SLIT2 proteinkonsentrasjonen med 53% (
P
0,05) (Fig. 4E). I likhet med de primære cellekulturer, regulering av disse
slisser
og
Robos
, samt det utskilte SLIT2 proteinet, ble tapt i flere ondartete, og mindre differensierte, SKOV-3-celler (
P
0,05) (figur 4D, F).. Dette tyder på at kortisol kan ha en fysiologisk rolle i å redusere slit /ROBO samspill under reparasjon av OSE og at denne veien kan fortsatt være aktiv i noen tidlig stadium eggstokkreft.
A) RT-PCR viser at PEO -14 og Skov-3 celler uttrykte
GR Hotell og
MR
men ikke
PR
. Brysttumorcellelinjen HTB-19 ble anvendt som en positiv kontroll og -RT ble anvendt som en negativ kontroll. B) Real-time kvantitativ PCR viser at transfeksjon med
GR
siRNA redusert
GR
uttrykk i begge cellelinjer i forhold til egge (sc) siRNA kontroll. C) Bekreftelse på at
GR
siRNA ikke påvirke
MR
uttrykk i PEO-14 og Skov-3 celler. D) Kvantitativ Real-time PCR viser en økning i
SLIT2
,
ROBO1 Hotell og
ROBO2
uttrykk etter
GR
slå ned etter
GR
siRNA i PEO-14 celler. E) Demonstrasjon at
GR
siRNA transfekterte Skov-3 celler hadde også økt
SLIT2 Hotell og
ROBO1
uttrykk. * =
P
0,05
Manipulering av
spaltene Hotell og
Robos
i ovarietumorceller ved å målrette den glukokortikoid reseptoren
Således, selv om glukokortikoider har en teoretisk skadelig virkning på tidlig eggstokkkreftceller, betyr det at manipulering av GR, med sikte på å øke
slit /ROBO
genekspresjon, er et potensielt terapeutisk mål. Vi har derfor «slått ned»
GR
bruker
GR
siRNA i kortisol-responsive PEO-14 celler. Transfeksjon av
GR
siRNA i 48 timer forårsaket en signifikant 63% reduksjon i
GR
uttrykk (
P
0,001) (Fig. 5B) uten å påvirke
MR
uttrykk (fig. 5C). Dette økte uttrykk for
SLIT2
,
ROBO1 Hotell og
ROBO2
tumorsuppressorgener (
P
0,05) (Fig. 5D). I tillegg transfeksjon av
GR
siRNA resulterte i en tilsvarende reduksjon i
GR
uttrykk i kortisol-svarer Skov-3 celler (
P
0,01) ( fig. 5B). Viktigere uttrykk for
SLIT2 Hotell og
ROBO1
tumorsuppressorgener ble også forsterket av
GR
siRNA transfeksjon (
P
0,05) (fig . 5E).
PEO-14 og SKOV-3-celler ble også behandlet med mifepriston (RU486), som fungerer som en GR-antagonist. RU486 behandling alene ikke påvirke uttrykk for
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
eller
ROBO2
i enten cellelinje (
P
0,05, data ikke vist). Men RU486 behandling gjorde avskaffe kortisol formidlet negativ regulering av
SLIT /ROBO
uttrykk i PEO-14 celler (data ikke vist). Dette tyder på at det kan være ligand uavhengige effekter av GR på SLIT /ROBO uttrykk og bekrefter at selv i dårlig differensiert kreftceller manipulering av GR kan regulere uttrykket av tumorsuppressorgener.
Diskusjoner
i denne studien har vi etablert at normal voksent menneske OSE uttrykker, på RNA-nivå,
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
. Ved hjelp av immunhistokjemi viste vi også at SLIT2 og ROBO1 er også uttrykt på proteinnivå. Som hver av spaltene er i stand til å samhandle med hver av Robos, med mulig unntak av ROBO4, er det sannsynlig at SLIT /ROBO samhandling skjer i OSE. Dette er ikke overraskende som disse molekylene er uttrykt i andre eggstokkene celler inkludert granulosa- lutein, theka lutein og luteal fibroblaster celler av den voksne corpus luteum [22] og de pre-granulosa celler og eggceller av opprinnelige follikler innenfor utviklingsfoster eggstokk [5 ]. Den normale eggstokk er derfor et område av de fysiologiske autokrine eller parakrine handlinger av slissen /ROBO system.
Vi fant at i normal OSE slissen /ROBO system kan reguleres ved kortisol. Kortisol redusert uttrykk for
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
i primærkulturer av OSE celler . Vi har tidligere vist at den samme konsentrasjonen av kortisol kan hemme ekspresjonen av
SLIT2
og
SLIT3
i primærkulturer av luteinised granulosa celler og luteal fibroblast-lignende celler [22]. Etter eggløsning er det en økning i den lokale produksjon av kortisol i OSE som kan virke til å fremme vevsreparasjon og fornyelse [28]. I området for de fysiologisk relevante konsentrasjoner i OSE celler kortisol har vist seg å ha en anti-inflammatorisk virkning og kan blokkere interleukin-1-stimulerte MMP-9 uttrykk [30], [31]. I tillegg har vi tidligere vist at kortisol, med negativt regulerer uttrykket av spaltene og Robos, hemmer apoptose og letter cellemigrasjon [22]. Dette innebærer at etter eggløsning en av virkningene av lokalt produsert kortisol kan være å midlertidig redusere ekspresjonen av slissen /ROBO tumorsuppressorgener for å lette reparasjon av den skadede OSE.
I mange epiteliale cancere er det en tilhørende tap av ekspresjon av medlemmer av slissen /ROBO familie [9]. For eksempel redusert uttrykk for
SLIT Hotell og
ROBO
transkripsjoner har blitt observert i spiserørs plateepitelkarsinom, hepatocellulær, lunge, prostata og brystkreft [10], [15], [16], [ ,,,0],32], [33]. Denne reduksjonen i uttrykket er imidlertid ikke universell og enkelte krefttyper, som for eksempel hjernesvulst [34] og tilbakevendende livmorkreft [35] opprettholde eller øke SLIT /ROBO veien. Men endringer i uttrykket av denne veien i maligne epitelceller fra eggstokkreft ikke tidligere undersøkt.
Vi dyrket ondartede epitelceller fra ascitesvæske av pasienter med avansert ovarialcancer og sammenlignet SLIT /ROBO uttrykk til som i normal OSE. Vi fant redusert uttrykk for
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2 Hotell og
ROBO4
i ondartede celler. Selv om vi mener at disse kulturene er rene kulturer av maligne eggstokkceller [36], er det mulig at det kan være ikke-maligne celler forstyrrende i noen kulturer. Vi har derfor også sammenlignet de godt differensierte PEO-14 celler med dårlig differensierte Skov-3 celler. I begge tilfeller er mer ondartede cellene hadde lavere ekspresjon av slissene og noen av de robos. Det er derfor sannsynlig at eggstokkreft kan legges til listen av svulster med redusert slit /ROBO uttrykk.
Vi gikk på å undersøke hvilke effekter en mindre aktiv SLIT /ROBO sti kan ha på cellefunksjonen. Nyere studier har antydet at SLIT2 kan hemme invasjonen av endometrial og eggstokkreft tumorcellelinjer [19]. Vi har også vist at hemming av slit /ROBO signalisering i primærkulturer luteal fibroblaster fremmet celle migrasjon [22]. I tillegg CAULKING handling i luteal-celler fra normale eggstokk hemmet apoptose og redusert i Caspase-3/7-aktivitet [22]. Det var en nedgang i caspase-3/7 mediert apoptose i PEO-14 og Skov-3 celler når SLIT /ROBO signale ble hemmet ved å blokkere SLIT aktivitet ved hjelp av en ROBO1 /Fc Chimera og SLIT2 syntese ved hjelp av siRNA teknologi. Økt apoptose, assosiert med redusert uttrykk av Bcl-2 og Bcl-xl anti-apoptotiske molekyler, ble sett i SLIT2 transfekterte fibrosarkomer og øsofagus plateepitelkarsinom [16]. SLIT2 kan også indusere apoptose forbundet med aktivering av caspase 3 i bryst og lunge kreftcellelinjer [37]. Alt i alt en reduksjon i SLIT /ROBO aktivitet er forbundet med økt celleoverlevelse og migrasjon, og dette vil trolig være relevant i eggstokkreft og dets progresjon.
Hvis glukokortikoid-mediert hemming av spalten /ROBO veien er fortsatt manifestert i maligne epitelceller i eggstokkreft deretter kortisol kan ha effekter på celle overlevelse og migrering som ville være skadelig for pasienten. I våre primærkulturer av fremskreden kreft i eggstokkene, samt dårlig differensiert SKOV-3 eggstokk-kreft cellelinje, ble reguleringen av slisser og Robos av kortisol tapt. Men det ble opprettholdt i mer differensiert PEO-14 tumorcellelinje. Dette innebærer at veien kan fortsatt være aktiv i de tidlige stadier av eggstokkreft eller mindre ondartede fenotyper. Interessant glukokortikoider kan hemme apoptose under fibrosarkom utvikling [38] og i eggstokkene tumorcellelinjer og celler fra ascitesvæske av eggstokkreft pasienter [39]. Deksametason kan også skjære apoptose indusert ved kjemoterapi ved en rekke forskjellige tumortyper, inkludert bryst, prostata, cervical og eggstokk-carcinoma celler [40] – [42]. Derfor glukokortikoid hemming av slisser og Robos kan fortsatt være mulig i noen ondartede celler.
Som oppregulering av slissene har vist seg å ha hemmende effekt på tumorvekst og invasjon det er mulig at manipulasjon av glukokortikoid pathway har terapeutisk nytte. RU486, en GR og PR-antagonist, kan indusere apoptose i prostata og eggstokkreft celler [43], [44]. Blokade av kortisol aktivitet i PEO-14 og Skov-3 celler, som mangler PR, ved hjelp av RU486 ikke påvirke uttrykk for
spaltene Hotell og
Robos
i begge cellelinje. Men RU486 gjorde avskaffe negative regulering av
SLIT /ROBO
uttrykk i PEO-14 celler.
Enda viktigere når vi hemmet endogen
GR
uttrykk, ved hjelp av siRNA, var det en økning i ekspresjonen av visse
slisser
og
Robos
i begge PEO-14 og SKOV-3-celler. Dette innebærer at
spaltene Hotell og
Robos
kan bli regulert, på transkripsjonsnivået ved GR og at en stor rolle for GR i å kontrollere
SLIT /ROBO
uttrykk kan være ligand uavhengig. Vår bioinformatiske analyse avdekket flere GR-responsive og relaterte elementer (Gres) i promotorområdene av
SLIT2
,
SLIT3
,
ROBO1
,
ROBO2
og
ROBO4
. Forbløffende nok i neuroblastom celler, aktiverte GR samhandler direkte med p53 og hemmer p53 avhengige cellesyklus og apoptose [45]. Imidlertid GR kan fungere som en tumor suppressor i andre typer av tumorer, inkludert hudkreft [46]. Derfor er den nøyaktige funksjon av GR i kreft kan være avhengig av tumortypen.
I sammendrag, har denne studien gitt ytterligere bevis på at slissen /ROBO bane har en rolle i normal eggløsnings fysiologi og er regulert av hormoner inkludert glukokortikoider. Vi har også vist at slissene og Robos synes å være avvikende uttrykt i eggstokkreft. Videre reduksjon av denne veien kan utfylle tumorgenesen og progresjon gjennom en feilregulering av cellulære prosesser, inkludert apoptose og frastøting av celle migrasjon. Samlet disse data støtter konseptet at reduksjonen av slissen /ROBO veien er viktig i ondartet utvikling og progresjon. Denne forskningen tyder også på at målretting deres fysiologiske reguleringen av steroider kan ha nytte i eggstokkreft.
Materialer og metoder
Cell og vev samling
Alle celler og vev ble oppnådd med informert skriftlig samtykke etter godkjenning fra Lothian medisinsk forskningsetiske komité. Menneske OSE celler ble hentet fra eggstokkene til premenopausale kvinner (n = 5) elektiv kirurgi for ikke-maligne gynekologiske tilstander som beskrevet tidligere [29]. Maligne epitelceller ble oppnådd fra ascitesvæske av kvinner (n = 8) med kirurgi for avansert ovarialcancer som tidligere beskrevet [36]. Normal menneskelig eggstokkvev hadde blitt samlet inn for en gratis undersøkelse [47]. Den Skov-3 og PEO-14 cellelinjer ble vennlig levert av P. Pujol, INSERM, Montpellier, Frankrike og S. Langdon, University of Edinburgh, Edinburgh, UK.
Cell kultur og behandlinger
primær~~POS=TRUNC OSE elementer og eggstokkreft celler ble rutinemessig opprettholdt i dyrkingsmedier som består av Medium 199 (Invitrogen, Paisley, UK) og MCDB105 (Sigma-Aldrich Corp, Gillingham, UK) (pH 7,3, 01:01 vv
-1) supplert med 15% (v /v) føtalt bovint serum, 50 IU /ml penicillin, 50 ug /ml streptomycin og 2 mM L-glutamin. PEO-14 og SKOV-3-celler ble dyrket i det samme mediet, men det ble supplert med 10% (v /v) FBS. For kortisol behandlingsstudier-celler ble sådd ut i seks-brønns plater ved en densitet på 2 x 10
5-celler /brønn. Etter 24 timer friskt medium inneholdende enten 1 000 nM Cortisol [22], [30], [31] i etanol med eller tilsvarende volum av etanol (0,001% v /v) ble tilsatt til cellene. I andre forsøk 50 uM RU486 [24] (Sigma) med og uten kortisol ble anvendt. Hver behandling ble utført i triplikat teknisk. Etter 24 timer ble 1 ml medium ble fjernet fra hver brønn og lagret ved -20 ° C for enzymbundet immunosorbent analyse (ELISA) eksperiment og RNA ble ekstrahert fra cellene som beskrevet nedenfor.
For ROBO1 /Fc behandlingsstudier-celler ble sådd ut ved 2 x 10
4 celler /brønn i 96-brønners plater. Etter 24 timer friskt medium inneholdende enten rekombinant rotte ROBO1 /Fc-kimær (R & D Systems, Inc., Abingdon, UK, 1 ug /ml) eller det tilsvarende volum av PBS /0,1% (w /v) BSA ble tilsatt til celler. Behandlinger ble utført i teknisk kvadruplikat. Førti-åtte timer senere cellene ble analysert for apoptose ved hjelp av caspase-Glo 3/7 analyse som beskrevet nedenfor.
Short interfering RNA teknologi
Tjuefire timer før transfeksjon PEO-14 eller SKOV-3-celler ble sådd i antibiotikafritt medium, slik at cellene var 50% konfluent på tidspunktet for transfeksjon. Korte interfering RNA oligonukleotider mot GR og SLIT2 samt en negativ kontroll, med ingen signifikant sekvenslikhet til menneskelige gensekvenser, ble oppnådd fra Applied Biosystems (Warrington, UK). De ble transient transfektert inn i cellene ved hjelp Oligofectamine transfeksjon reagens i henhold til produsentens instruksjoner (Invitrogen). Kort sagt ble de siRNA oligonukleotidene fortynnet til en sluttkonsentrasjon på 200 nM i Opti-MEM I Redusert Serum media (Invitrogen) og kombinert med fortynnet Oligofectamine å tillate siRNA:Oligofectamine komplekser for å danne ved romtemperatur. Den siRNA:Oligofectamine Komplekset ble deretter dråpevis tilsatt til hver brønn og cellene ble deretter inkubert ved 37 ° C, 5% CO
2 i 48-72 timer. For ekspresjons-analyse eksperimenter ble cellene dyrket i 6-brønners plater, og hver transfeksjon ble utført i tre eksemplarer. For kaspase-3/7-aktivitet analyse eksperimenter ble cellene dyrket i 96-brønners plater, og hver transfeksjon ble utført i fire eksemplarer.
Expression analyse
RNA ble ekstrahert fra hver brønn av cellene ved bruk av RNeasy Mini kit (Qiagen Ltd., Crawley, UK) og behandlet med deoksyribonuklease i (QIAGEN). RNA ble anvendt som et templat for cDNA-syntese ved anvendelse av TaqMan revers transkriptase reagenser (Applied Biosystems). Primere spesifikke for
spaltene Hotell og
Robos
har tidligere blitt beskrevet i detalj [22]. PCR ble utført på en Eppendorf Mastercycler gradient autorisert termo (PerkinElmer, Inc., Waltham, MA) ved hjelp GoTaq Flexi DNA polymerase (Promega Ltd., Southampton, UK). PCR thermocycle bestod av en innledende denaturering på 5 min ved 95 ° C etterfulgt av 35 sykluser av 95 ° C i 30 sekunder, annealing temperatur i 30 sekunder, 72 ° C i 30 sek, og en endelig forlengelse på 10 min ved 72 ° C. PCR-produkter ble visualisert på en 2% (w /v) agarosegel med etidiumbromid tilsatt.
Sanntids kvantitativ PCR
RNA ble ekstrahert og revers transkribert som beskrevet ovenfor. En standardkurve ble generert med serielle fortynninger av cDNA syntetisert fra humant føtalt hjerne total RNA (Stratagene Europa, Amsterdam, Nederland). Real-time PCR amplifisering ble deretter utført i duplikat 10 pl reaksjoner ved bruk av
Strøm
SYBR Grønn PCR Master Mix (Applied Biosystems) etter produsentens instruksjoner og bruk av ABI 7500HT rask real-time PCR system instrument (Applied Biosystems) . Primere som ble anvendt var de samme som for ekspresjonen analyse og er blitt beskrevet tidligere [22]. ABI instrumentstandardinnstillinger ble anvendt for sykkel program og smeltekurven analyse.
ABI analyseprogram beregnet kvantitative verdier for hver prøve ved å sammenligne prøveterskelsyklusen nummer, hvor økningen i signal forbundet med eksponentiell
