Abstract
Den globale genet regulator Spesial AT-rik sekvens-bindende protein-1 (SATB1) har blitt rapportert å indusere EMT-liknende forandringer og bli assosiert med dårlig klinisk utfall i flere kreftformer. Denne studien tar sikte på å vurdere om SATB1 påvirker de biologiske atferd av blæren overgangsordning celle carcinoma (BTCC) og videre belyse om denne effekten fungerer gjennom en epitelial-mesenchymale overgang (EMT) veien. Ekspresjonen av SATB1, E-cadherin (epiteliale markører), vimentin (mesenchymale markører) i BTCC vev og tilstøtende noncancerous vev, så vel som i to cellelinjer av blærekreft ble undersøkt. Hvorvidt SATB1 ekspresjon er assosiert med clinicopathological faktorer eller ikke var statistisk analysert. Celle invasjon og migrasjon, cellesyklus, celleproliferasjon og apoptose ble evaluert i SATB1 knockdown og overuttrykte cellelinjer. Våre resultater viste at uttrykket av SATB1 var bemerkelsesverdig oppregulert både i BTCC vev og i blære kreft cellelinjer med høyt potensial for metastasering. Resultatene ble også assosiert med EMT markører og dårlig prognose av BTCC pasienter. Videre SATB1 indusert EMT prosesser gjennom nedregulering av E-cadherin, oppregulering av E-cadherin repressors (sneglen, Slug og vimentin). SATB1 også fremmet cellecyklusprogresjonen, celleproliferasjon, celle invasjon og cellemigrasjon, men endret ikke celle overlevelse. I konklusjonen, våre resultater tyder på at SATB1 spiller en avgjørende rolle i utviklingen av blærekreft ved å regulere gener som kontrollerer EMT prosesser. Videre kan det være en roman terapeutisk mål for aggressive blærekreft
Citation. Wan F, Cheng C, Wang Z, Xiao X, Zeng H, Xing S, et al. (2015) SATB1 Overuttrykte Regulerer utvikling og progresjon i blærekreft gjennom EMT. PLoS ONE 10 (2): e0117518. doi: 10,1371 /journal.pone.0117518
Academic Redaktør: Neil A. Hotchin, University of Birmingham, STORBRITANNIA
mottatt: 7 august 2014; Godkjent: 26 desember 2014; Publisert: 23 februar 2015
Copyright: © 2015 Wan et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er innenfor papir
finansiering:.. forfatterne fikk ingen spesifikke midler til dette arbeidet
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Blærekreft (BC) er en av de vanligste ondartede svulster som påvirker slimhinnen i urinblæren, med anslagsvis 386,300 nye tilfeller og 150,200 dødsfall fra sykdommen på verdensbasis, per år [1]. I Kina, er det blitt rapportert at BC er den vanligste urin malignitet, og forekomsten av denne sykdom er økt i løpet av de siste tiårene [2]. På grunn av den høye lokale tumor tilbakefall, ytterligere progresjon og fjernmetastaser, har dårlig klinisk resultat er vist for BC pasienter, til tross for de betydelige forbedringer i kirurgiske teknikker og adjuvant terapi [3-6]. I mellomtiden er de kompliserte trasé under onkogenese og uforutsigbar biologiske oppførsel av kreft fortsatt dårlig forstått og påvirkes av miljømessige og genetiske faktorer [7]. Derfor er identifiseringen av nye molekylære markører som kan tjene som standard prognostiske faktorer som er nødvendig for tidlig diagnose og for utvikling av mer effektiv behandling for BC pasienter.
Det har generelt vært erkjent at dårlig prognose av maligniteter er tilknyttet tumor aggressivitet. Dette forekommer når ikke-invasiv cellene bli invaderende metastatiske gjennom flere trinn, slik som epitelceller miste polaritet og videre invaderende vaskulære og lymfatiske kamrene [8]. Epithelial mesenchymale overgang (EMT) er nøkkelen prosess som først oppstår i kritiske faser av fosterutviklingen der cellene mister sin epitelceller egenskaper og celle-celle kontakter, og samtidig skaffe trekkende og invasive egenskapene til mesenchymalceller [9-11]. Videre kan tilsvarende EMT-lignende prosesser forekommer i løpet av tumorprogresjon i karsinomer og ha en aktiverende rolle i å forhindre apoptose og begynnende alderdom av tumorceller, noe som bidrar til immunsuppresjon [12]. Tap av E-cadherin uttrykk er et kjennetegn på EMT prosessen [9]. Igjen, i nyere studier, transkripsjonsfaktorer slik som sneglen og Slug har blitt identifisert som direkte repressorer av E-cadherin og induktorer av EMT, noe som ytterligere fremkaller fullstendig emts på både morfologiske og atferdsmessige nivåer når den overuttrykkes i epitel-celler [13-15] . I tillegg er en økende mengde bevis tyder på at EMT spiller en sentral rolle i initiering og utvikling av metastaser i løpet av tumorinvasjon og progresjon av blærekreft
in vivo Hotell og
in vitro product: [16 -18].
Spesielle aT-rik bindende protein 1 (SATB1) er en kjernematrise festeområde (MAR) DNA-bindende protein som virker som et genom arrangøren og genet regulator gjennom modulering av romlig konformasjon av kromatin. Det deltar også i en rekke biologisk viktige prosesser som proliferasjon, differensiering, apoptose og omprogrammering av ekspresjonsprofiler [19-21]. I senere studier har oppregulering av SATB1 er funnet å være korrelert med invasjon og metastasering av mange typer malignances, inkludert magekreft, brystkreft, endetarmskreft, leverkreft, og prostatakreft. Disse funnene tyder på at SATB1 er en uavhengig prognostisk faktor og en potensiell terapeutisk mål i kreft hos mennesker [21-26]. For eksempel, Han et al fant at SATB1 tømming kunne reversere EMT prosessen gjennom nedregulering av E-cadherin repressorer som sneglen og SIPI og oppregulering av E-cadherin i spesielt aggressive (MDA-MB-231) cancerceller [21] . En annen studie rapporterte at kjemoterapeutisk undertrykkelse av MIR-448 øker mRNA nivåer av SATB1 og fremmer EMT. Disse funnene gir potensielle nye terapeutiske tilnærminger for blærekreft.
Mens blære overgangsordning celle carcinoma (BTCC) er en av de mest vanlige undertyper av BC, den nåværende kunnskap om den spesifikke mekanismen av BTCC invasjon og metastasering er fortsatt begrenset. I en fersk undersøkelse, fant Bin Han et al at SATB1 ble overuttrykt i human blærekreft og forbundet med svulst klasse og scene. I tillegg fant de også at SATB1 uttømming redusert celleproliferasjon og øket celle apoptose i 5637 og T24-celler [27]. Men hvordan uttrykk for SATB1 påvirker biologisk atferd BTCC og om SATB1 induserer EMT i blærekreft er fortsatt uutforsket. I denne studien, vurderte vi uttrykk for SATB1 i BTCC prøver og blærekreft cellelinjer skjønt immunhistokjemisk farging, real-time RT-PCR-analyser og western blotting analyse og funnet ut at det uttrykket er korrelert med klinisk patologiske egenskaper. I etablerte menneske blærekreft cellelinjer, vi videre vist at overuttrykt eller forstummet SATB1 regulert cellen migrasjon, invasjon og spredning, sammen med cellesyklusen.
Materialer og metoder
Materialer
Primær blærekreft prøver og matchet ikke-kreft vev ble innhentet fra 126 pasienter (gjennomsnittsalder 65,2 år, range 45-78) diagnostisert med blærekreft som gjennomgikk kirurgisk reseksjon for immunhistokjemiske analyser på Union Hospital i Department of Urology (Wuhan , Kina) mellom april 2007 og oktober 2012. Deler av vevsprøver ble fiksert i formalin og innstøpt i parafin. Alle pasientene mottok ikke preoperativ behandling, slik som kjemoterapi eller stråling. Alle deltakerne gitt sitt skriftlige samtykke til å delta i denne studien, og studien ble godkjent av etikkomiteen av Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology (Hust). Klinisk og patologisk informasjonen ble hentet fra en retrospektiv gjennomgang av veldokumenterte medisinske poster. Svulster ble klassifisert histologisk som ikke-muskel-invasiv blærekreft (NMIBC) (scenen PTA) eller muskel invasiv blærekreft (MIBC) (scenen pT3) i henhold til tumor-noder-metastase (TNM) klassifikasjon for scenen [28]. Karakteren ble tildelt i henhold til Verdens helseorganisasjons klassifikasjon av svulster i urinveiene og mannlige kjønnsorganer (2004) [28]. Alle dødsfallene skyldtes blærekreft. Pasient egenskaper er beskrevet i tabell 1. Menneske blærekreft cellelinjer BIU-87 og T24 ble opprettholdt i vårt laboratorium (Central Laboratory of Union Hospital, Tongji Medical College, Hust, Wuhan, Kina). BIU-87-celler ble avledet fra en klasse II, ikke-muskel-invasiv (PT1) humane BTCC i urinblæren. T24 celler, som er dårlig differensiert og besitter et større potensial for metastasering og viser en typisk fibroblastisk morfologi mikroskopisk var avledet fra en klasse III blære carcinoma [29]. Cellene ble dyrket i RPMI-1640 medium supplert med 10% føtalt bovint serum og 100 ug /ml penicillin-streptomycin (Gibco, Carlsbad, CA, USA) og inkubert med en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 ved 37 ° C.
immunhistokjemisk farging analyse
Protein ble bestemt ved immunhistokjemisk farging for SATB1, E-caderin og vimentin, med streptavidin biotin-peroksidase kompleks metode med SABC kits (BOOSTER Ltd, Wuhan, Kina) i henhold til produsentens protokoll. Kort sagt ble vevsprøver fiksert i 10% nøytral bufret formalin, dehydrert og innstøpt i parafin. Deretter ble seksjonene deparaffinized og vannes ut. Hydrogenperoksyd ble anvendt for å blokkere endogen peroksyd-aktivitet i 10 min. Etter antigen hentes ved hjelp av en mikrobølgeovn, ble delene behandlet med 10% normalt geiteserum i 10 minutter ved romtemperatur for å redusere den ikke-spesifikke bindingskapasitet. Snittene ble deretter inkubert med kanin-polyklonalt antistoff SATB1, E-caderin og vimentin (Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) ved en fortynning på 1:70. Disse ble etterlatt i et fuktet kammer over natten ved 4 ° C. Etter vasking tre ganger med fosfat-bufret saltvann (PBS) i 5 min hver gang, ble seksjonene inkubert med sekundært antistoff i 40 minutter og deretter med streptavidin-biotin-peroksidase-komplekset i 40 minutter ved 37 ° C. Etter skylling, diaminobenzidin (DAB, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) ble brukt som kromogen, og seksjonene ble motfarget med hematoksylin. Prøvene ble inkubert med PBS i stedet for det primære antistoff tjente som negative kontroller. SATB1staining i kjernekraft ble definert som påvisbare immunreaksjoner og E-caderin og vimentin flekker i plasmalemma eller cytoplasma ble definert som påviseimmunreaksjoner. Den positive farging ble scoret basert på intensiteten og prosentandelen av celler med SATB1 atom farging. I henhold til den dominerende intensitet, ble fargeintensitet betegnet på følgende skala: 0 poeng, negativ nukleær farging for alle tumorceller; scorer ett, svak kjernekraft farging; scorer to, moderat nukleær farging; scorer tre, sterke kjerne farging. Ifølge prosentandelen av positivt fargede celler, ble poengsummen for flekker tetthet gitt som følger: 0, mindre enn 5%; 1, 5 til 25%; 2, 25 til 50%; 3, mer enn 50%. Sluttresultatet ble beregnet ved å legge de to ovennevnte score. Resultater av 0-2 ble definert som lav uttrykk score, og 3-6 ble definert som høy score.
RNA ekstraksjon og kvantitative real-time PCR-analyser
Total RNA ble ekstrahert og renset fra hver vevsprøve og cellelinjer ved hjelp av Trizol reagens (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av reverstranskripsjon sett (Takara Biotechnology Dalian, Kina) med følgende betingelser: revers transkripsjon ved 37 ° C i 25 min, etterfulgt av inkubasjon ved 85 ° C i 5 sekunder i 20 pl reaksjonsvolum. Deretter ble cDNA ble fremstilt og anvendt som et templat for kvantitativ sanntids-polymerase kjedereaksjon (PCR-PT) utføres på en ABI StepOnePlus Real-Time PCR System (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) ved anvendelse av SYBR grønn Real- time PCR Master Mix (Takara Clontech, Kyoto, Japan). Dette ble gjort med de følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 30 sekunder, etterfulgt av 40 sykluser med amplifikasjon (95 ° C i 5 sekunder, 60 ° C i 30 sekunder). Primere ble utformet ved hjelp NCBI Primer-BLAST som følger: SATB1 (forover, 5′-GTGGAAGCCTTGGGAATCC-3 «; omvendt, 5′-CTGACAGCTCTTCTTCTAGTT-3′), E-cadherin (forover, 5»-CTG GACGCTCGGCCTGAAGT-3 «; revers , 5»-GGGTCAGTATCAGCCGCTTT-3 «), vimentin (forover, 5′-ACAGGCTTTAG CGAGTTATT-3′, omvendt, 5»-GGGCTCCTAGCGGTTTAG-3 «), Twist (forover, 5′- CAGCGCACCCAGTCGCTGAA-3», omvendt, 5 « -CCAGGCCCCCTCCATCCTCC-3 «), sneglen (forover, 5′-ATCCGAAGCCACACGCTGCC-3′, omvendt, 5»-CACGGCTGCAGTGGGGACAG-3 «), Slug (forover, 5′-CGCTCCTTCCTGGTCAAGA-3′, omvendt, 5»-TTGCGTCACTCAGTGTGC-3- «), ZEB1: (forover, 5′-TGCTCCCTGTGCAGTTACACCTT-3′, omvendt, 5»-CCAGACTGCGTCACATGTCTTTGA-3 «), ZEB2: (forover, 5′-ATACCGCGGTGCCATCCTTGTACAGTGGTT-3′, omvendt, 5′-GCGCTGCAGAGTAATTGGAAAAAAACAAA-3) , GAPDH (forover, 5»-TCGGAGTCAACGGATTTGGTCGT-3 «, omvendt, 5′-TGCCATGGGTGGAATCATATTGGA-3»). Primerne ble utformet for å være intron-dekkende. Syklusen terskel (CT) verdier ble standardisert til CT verdier av GAPDH. De relative nivåer av enkelte mRNA i hver prøve transkripsjon sammenlignet med kontroll GAPDH ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCt metode.
Western blotting-analyse
Totalt protein ble ekstrahert fra hver vevsprøve og cellelinje ved hjelp av RIPA buffer (Sigma, St. Louis, MO, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Proteinkonsentrasjoner ble bestemt med en BCA Protein Assay Kit (BOOSTER Ltd, Wuhan, Kina). Like mengder av høstet proteinprøver ble løst i en 10% natrium-dodecyl-sulfat-polyakrylamid-gelelektroforese (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) og overført til PVDF-membraner (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) etterfulgt av blokkering med TBST-buffer bestående av 50 mM Tris (pH 7,6), 150 mM NaCl og 0,05% Tween supplert med 5% fettfri melk ved 4 ° C i 2 timer. Den utslettet Membranene ble inkubert over natten ved 4 ° C med kanin polyklonale antistoff SATB1, E-cadherin, vimentin (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (1: 800), ZEB1, ZEB2, Snail og Slug (Santa Cruz Biotechnology Inc ., Santa Cruz, CA, USA) (1: 500). Vi brukte GAPDH (BOOSTER Ltd, Wuhan, Kina) som en lasting kontroll. Antistoffbinding ble påvist ved hjelp av konjugert sekundære antistoffer (BOOSTER Ltd, Wuhan, Kina) i ytterligere 2 timer ved romtemperatur i henhold til produsentens instruksjoner. De immunreaktive bånd ble visualisert ved forbedret Western blotting deteksjonssystem ECL (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA) og intensiteten av de oppdagede båndene ble analysert ved hjelp av et bilde J program.
SATB1-knockdown celler
En tidligere validert shRNA ble brukt [21]. Sekvensen av shRNA var som følger: 5′-GGATTTGGAAGAGAGTGTC-3 «. Den shRNA ble syntetisert og klonet inn i pGenesil2 vektor (GenePharma Co, Ltd Shanghai, Kina) og deretter transfektert inn 50% -confluent T24 cellelinje sammen med en pGenesil2 kontroll vektor bruker Lipofectamine 2000 Reagens (Invitrogen) i henhold til produsentens anvisninger . Sammenslåtte populasjoner av knockdown-celler ble oppnådd etter to ukers medikamentseleksjon med 400 ug /ml G418, etter inkubering i 24 timer. Da de stabile RNA-interferens-mediert SATB1-knockdown cellelinjer ble betegnet som pGenesil2-SATB1-shRNA og var videre dyrket i de etterfølgende eksperimenter. T24 celler behandlet med pGenesil2-egge-shRNA (5»-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 «) som er ikke rettet mot noen bestemt gen ble brukt som kontrollgruppene.
SATB1-overekspresjon celler
Den menneskelige full-lengde SATB1 cDNA ble klonet inn i pcDNA3.1 ekspresjonsvektoren kjøpt fra GenePharma Co., Ltd (Shanghai, Kina). Etter å ha blitt bekreftet ved DNA-sekvensering, ble det pcDNA3.1-SATB1 ekspresjonsvektor og pcDNA3.1 kontroll vektor transfektert inn i 50% -confluent BIU-87 celler ved anvendelse av Lipofectamine 2000 henholdsvis (Invitrogen). Etter transfeksjon ble stabile cellelinjer valgt etter inkubasjon med 600μg /ml G418 i RPMI-1640 medium supplementert med 10% føtalt kalveserum i to uker. Disse ble deretter dyrket for de etterfølgende eksperimenter. De SATB1-overekspresjon Biu celler ble etablert og SATB1 uttrykk nivåer som vises av disse cellene ble bekreftet ved hjelp av Real-Time RT-PCR-analyse. Nontransfected BIU-87 celler ble brukt som kontrollgruppene.
Immunofluorescensanalyse
For å bestemme protein cellulær lokalisering for SATB1 og E-cadherin, ble immunfluorescens utført ved hjelp av en A1Si laser-scanning confocal mikroskop. Kort sagt ble BIU-87 og T24-celler transfektert med pcDNA3.1-SATB1 og pGenesil2-SATB1-shRNA ekspresjonsvektorer sådd ut på dekkglass og plassert i 24-brønners plater. Celler ble fiksert med 4% paraformaldehyd i 30 minutter ved 37 ° C etter inkubering i 3 dager, og deretter vasket med PBS to ganger i 10 minutter hver. De fikserte celler ble permeabilisert med 0,3% Triton-X-100 i 15 minutter, blokkert i 10% geiteserum i 1 time, og deretter vasket med PBS to ganger i 10 minutter hver. Deretter ble cellene inkubert med primært antistoff som følger: kanin-polyklonalt antistoff SATB1, og E-cadherin (Abcam Inc., Cambridge, CA, USA) (01:50) ved 4 ° C over natten, etterfulgt av deteksjon med Cy5-konjugerte sekundære antistoffer og FITC-merket phalloidin (5 Hg /ml) (sigma) i 1 time ved romtemperatur i mørket. DAPI ble senere brukt til å farge kjerner. Bilder ble samlet inn ved hjelp av en Nikon A1Si laser-scanning confocal mikroskop (Nikon, Japan).
Cell invasjon og migrasjonsanalyser in vitro
BIU og T24cells transfektert med pcDNA3.1-SATB1 plasmider, pGenesil2 vektor inneholdende SATB1-spesifikk shRNA, så vel som den negative kontroll vektoren ble tilsatt til det øvre rom av transwell plater med 6,5 mm poly-karbonat filtre og 8.0μm porestørrelse (Corning Costar, MD, USA). Dette ble utført i 100 ul av serum-fritt medium og 500 ul av RPMI-1640 inneholdende 10% FBS. For celle invasjon analyser, ble transwellfilterinnsatser belagt med 50ul Matrigel (BD Biosciences, NJ, USA). Etter inkubasjon i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO
2 atmosfære, tumorcellene som penetrert bunnen av innsatsen membranen ble fiksert i 4% paraformaldehyd og farget med krystallfiolett (BOOSTER Ltd., Wuhan, Kina) ifølge til produsentens protokoll. Da invasive fargede celler ble talt under et lysmikroskop i 10 tilfeldig utvalgte felt på 200 × forstørrelse. For celle migrasjon analyser, ble transfekterte celler sådd i forkamrene uten belagt Matrigel. Etter inkubasjon i 12 timer ved 37 ° C, 5% CO
2 atmosfære, de migrerte cellene på undersiden av filtermembranen ble fiksert og farget med krystallfiolett og ble deretter talt og analysert som beskrevet ovenfor. Tre replikate brønner ble testet pr assay, og hvert eksperiment ble utført in triplo. Spektrofotometer ble benyttet for å måle den optiske tettheten ved 560 nm, og evnen til cellen invasjon ble beregnet ved hjelp av prosentandelen av celler som gjennomtrenges av Matrigel-belagte filtre.
cellesyklusanalyse og formering
for å bekrefte effektene av SATB1 på cellesyklus, strømningscytometri ble benyttet for å analyse prosentandelen av celler i hver cellesyklus fase etter celle farging med propidiumjodid (PI) (Keygentec, Kina) i henhold til fremstillingen protokoll. I korte trekk, ble BIU og T24 cellene resuspendert i iskald PBS og fiksert med 70% etanol på is. Da de faste brønnene ble farget med PI-løsning i 30 minutter og analysert ved flow-cytometri
CCK-8 celleproliferasjonsanalyse (CCK-8 kit; BOOSTER Ltd, Wuhan, Kina). Ble anvendt for å påvise celle vekstrater i henhold til produsentens instruksjoner. I korte trekk de etablerte SATB1-knockdown T24 celler og SATB1-overekspresjon Biu-87-celler ved 4 x 10
3 per brønn ble sådd ut i flatbunnede 96-brønners plater og inkubert i 48 timer ved 37 ° C, i en 5% CO
2 atmosfære. For kvantifisering av cellelevedyktigheten ble celler inkubert med en CCK-8-løsning (10 ul /brønn) i 1,5 timer ved 37 ° C. Deretter absorbansverdiene for tumorceller ble målt ved 450 nm ved angitte tidspunkter ved hjelp av en mikroplateleser (Bio-Rad, Tokyo, Japan). Tre gjentatte brønner ble testet per analyse, og hvert forsøk ble utført i tre eksemplarer.
apoptose analysen
For å oppdage effekten av SATB1 på celle apoptose, flowcytometri ble utført for å analysere apoptotics hastighet ved hjelp Annexin V-FITC Apoptose Detection Kit (Keygentec, Kina) i henhold til fremstillingen protokoll. I korte trekk, BIU og T24-celler transfektert med pcDNA3.1-SATB1 plasmider og pGenesil2 vektor inneholdende SATB1-spesifikk shRNA såvel som negativ kontroll vektor ble sådd ut i 6-brønns plater og dyrket i 24 timer. Da cellene (1×10
6) ble farget med Annexin-V og PI og apoptotiske celler ble bestemt av Annexin V-FITC apoptose deteksjon kit og vurdert ved hjelp av en FACSCalibur instrument.
Statistisk analyse
dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av gjennomsnittet (SEM). Tre replikate brønner ble testet pr assay, og hvert eksperiment ble utført in triplo. Statistiske sammenligninger mellom grupper ble bestemt av studentens
t
-test. Cross-tabellen analyse ble utført ved hjelp av Pearsons kji-kvadrat (χ
2) test eller Fishers eksakte test for å analysere betydningen av sammenhenger mellom SATB1 uttrykk og clinicopathological funksjoner i blærekreft. Kaplan-Meier plot ble brukt for å estimere den prognostiske relevansen av SATB1 i en univariat analyse. Multivariat analyse ble utført ved hjelp av en Cox test. Alle data ble analysert ved hjelp av SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle statistiske tester ble tosidige og statistisk signifikans ble antatt for p 0,05.
Resultater
SATB1 er oppregulert i menneskelige BTCC vev og blærekreft cellelinje med høy metastatisk potensial
For å undersøke om unormal uttrykk for SATB1 er relatert til blærekreft utvikling og progresjon, og også involvert i regulering av EMT i human blærekreft, immunhistokjemi, real-time RT-PCR og Western blotting analyser ble opprinnelig utført for å identifisere uttrykk for SATB1. Videre ble de brukt til å analysere E-cadherin og vimentin i 126 vevsprøver av human blærekreft, tilsvarende tilstøtende normale vev og blærekreft cellelinjer henholdsvis. Uttrykket nivåer av SATB1 og vimentin ble funnet å være signifikant oppregulert på mRNA og proteinnivåene i NMIBC og MIBC vev sammenlignet med de på tilsvarende hosliggende nonneoplastic prøver (figur 1A og C;. * P 0,05, ** P . * P 0,05). Uttrykket nivåer av SATB1 RNA og protein var signifikant høyere i metastatisk tumorcellelinje (T24) enn i ikke-metastatisk tumorcellelinje (BIU-87) (Fig 1 A og C;. ** P 0,001), noe som tyder SATB1 uttrykket var assosiert med aggressiv svulst fenotyper. Videre er ekspresjon av vimentin ble påfallende oppregulert ved RNA og proteinnivåer i T24-cellelinje sammenlignet med de i BIU-87 cellelinjer (Fig 1 A og C;. * P 0,05). Omvendt, E-cadherin uttrykk var markert lav eller tapt på mRNA og proteinnivåer i NMIBC vev, MIBC vev og høy metastatisk tumor cellelinje T24 men betydelig høy i tilsvarende tilstøtende ikke-neoplastiske prøver og BIU-87cell linjen (Fig. 1A og C * P 0,05, ** P 0,001). Lignende resultater ble oppnådd ved immunhistokjemisk farging analyse for detektering SATB1, E-cadherin og vimentin, som viste at SATB1 ble hovedsakelig er lokalisert i kjernen av blæren kreftvev, med lav immunreaktivitet i normale blære vev (Fig. 1B). Men vimentin ble funnet å være hovedsakelig farget plasmalemma av blærekreft vev, med et tap av eller lav av E-cadherin farging (Fig. 1B). Blant primærblærekreftpasienter med positiv SATB1 uttrykk vises mistet eller lav E-cadherin uttrykk, men høy vimentin uttrykk. I kontrast, SATB1-negative pasienter viste sterk E-cadherin flekker, men en lys farging av vimentin (Fig. 1 D), noe som antyder en sterk positiv korrelasjon mellom SATB1 og EMT markører i BTCC.
Expressions av mRNA nivåer av SATB1, E-cadherin og vimentin i human blærekarsinom vev og to blære karsinom-cellelinjer ble bestemt ved kvantitativ RT-PCR (A; * P 0,05, ** P 0,001). IHC-farging av humane blære karsinom vev og tilsvarende tilstøtende ikke-cancervev for SATB1, E-cadherin og vimentin ble utført. SATB1 farging ble observert i kjernen av blærecancerceller, vimentin ble funnet å være hovedsakelig beiset i plasmalemma blærecancerceller, men E-cadherin farging ble observert hovedsakelig i plasmalemma av ikke-cancerøse blære-celler (B); Blærekreft prøver med SATB1-positive var farget med vimentin men ikke E-cadherin. Imidlertid ble tumorprøver med SATB1-negativ farget med E-cadherin, men ikke vimentin (D). Den opprinnelige forstørrelse var x 400x (B og D). Proteinnivåer SATB1, E-cadherin og vimentin ble undersøkt ved western blot (C). Feilfelt angir standardavvik, n = 3 forsøk.
Overuttrykte SATB1 er assosiert med clinicopathological parametere og korrelerer med dårlig prognose
Forholdet mellom SATB1mRNA uttrykk og clinicopathological faktorer ble undersøkt. Som vist i tabell 1, ble høy ekspresjon av SATB1 signifikant assosiert med alder (≥55 vs 55, p = 0,034), primær tumor dybde av invasjon (T1 + T2 vs. T3 + T4, P 0,001), TNM stadium (stadium i + II vs. iscenesetter III + IV, P = 0,015), tilstedeværelse av lymfeknutemetastase (P = 0,013) og tilstedeværelse av fjernmetastaser (P = 0,012). Men ingen signifikante forskjeller ble funnet mellom høy SATB1 uttrykk og begge kjønn (menn kontra kvinner, P = 0,143) eller tumor differensiering (G1 vs. G2 + G3, P = 0,111). Kaplan-Meier-analysen ble utført for å bestemme prognostisk betydning SATB1. Som vist på fig. 2, analysen avdekket en sammenheng mellom høyere SATB1expression nivåer og kortere total overlevelse ganger (P 0,001). Videre bekreftet multivariabel Cox regresjonsanalyse som SATB1 uttrykk er en betydelig og uavhengig prognostisk faktor for human blære overgangsordning celle carcinoma etter justering for de andre faktorene som vist i tabell 2 (P = 0,005).
5 år total overlevelsesrate hos pasienter med høyt SATB1 uttrykk var betydelig dårligere enn de med lav SATB1 uttrykk (P 0,001; log-rank test)
Ektopisk uttrykk for SABT1 induserer EMT i et etablert. menneskelig kreft cellelinje, noe som øker deres invasiv evne
Tidligere studier har knyttet SATB1expression med epitelial-mesenchymale overgang (EMT) [21,24]. For å teste hvorvidt ektopisk ekspresjon av SATB1 kan indusere EMT i ikke-metastatiske tumorceller, ble den humane blærecancercellelinje (BIU-87) med meget lav SATB1 uttrykk transfektert med pcDNA3.1-SATB1 ekspresjonsplasmider for å etablere en stabil SATB1-overekspresjon cellelinje som beskrevet i Materiale og metode. Resultatene av sanntids RT-PCR og western-blotting viste at SATB1 mRNA og proteinnivåene av transfekterte gruppe betydelig økt sammenlignet med nontransfected gruppen og kontrollgruppen vektor-transfiserte gruppe (fig 3A,. ** P 0,001). Men det var ingen bemerkelsesverdige endringer i uttrykket av SATB1 i kontrollen vektor transfektert gruppe og nontransfected gruppen (P 0,05). Tilsvarende resultater kunne oppnås ved immunofluorescens-analyse for å detektere SATB1 (Fig. 3C). Interessant nok har vi funnet at transfeksjon av BIU-87-celler forårsaket en signifikant økning av sneglen og Slug (mRNA og protein) og en samtidig induksjon av vimentin (mRNA og protein). De mRNA nivåer av E-cadherin uttrykk ble redusert etter transfeksjon av pcDNA3.1-SATB1 ekspresjonsplasmider (fig 4A. P 0,05). Men det var ingen bemerkelsesverdige endringer i uttrykket av E-cadherin protein mellom styre vektor og pcDNA3.1SATB1 gruppen (fig 4B,. P 0,05). Det var bare en tendens til reduksjon av E-cadherin proteinekspresjon, og den hemmende effekten ble ikke så utpreget fordi inhiberingen kan være post-translasjonell.
SATB1 ekspresjon av BIU-87-celler og T24-celler transfektert med pcDNA3.1-SATB1 og pGenesil2-SATB1-shRNA ble undersøkt ved QRT-PCR og western blot (A og B; ** P 0,001). Ikke-transfekterte BIU-87 celler ble anvendt som kontrollgruppe. T24 celler behandlet med pGenesil2 kontroll vektor som ikke er rettet mot noen bestemt gen ble benyttet som kontrollgruppene. Immunofluorescens-analyse ble utført for å påvise SATB1staining i hver cellegrupper. Immunofluorescence bilder på 200 x forstørrelse (C og D). Feilfelt angir sem, n = 3 forsøk
uttrykk for sneglen og Slug, to hemmere av E-cadherin og mesenchymale markør vimentin ble oppregulert etter SATB1 uttrykk ble forsterket (A;. ** P 0,001). De mRNA nivåer av E-cadherin uttrykk ble redusert etter transfeksjon av pcDNA3.1-SATB1 ekspresjonsplasmider (A; P 0,05). Det var en trend for reduksjon av E-cadherin protein uttrykk i BIU-87 celler med forbedret SATB1 uttrykk (B; P 0,05). Etter SATB1 uttrykk ble stille med SATB1 shRNA i T24 celler, ble uttrykket av sneglen, Slug og mesenchymale markører vimentin nedregulert. Ekspresjonen av epitelial markør, E-cadherin, ble oppregulert i forhold til nontransfected celler og kontroll-vektor-transfekterte celler (C og D; * P 0,05, ** P 0,001). Det var ingen bemerkelsesverdige endringer i uttrykk for ZEB1, ZEB2 og Twist, andre kjente hemmere av E-cadherin, i BIU-87 med forbedrede SATB1 uttrykk og T24 celler med redusert SATB1 uttrykk, henholdsvis.
Men det var ingen bemerkelsesverdige endringer i uttrykket av ZEB1, ZEB2 og Twist, som er kjent som andre hemmere av E-cadherin, i de tre cellegrupper (P 0,05).
