Abstract
Cetuximab er et kimært mus-humant monoklonalt antistoff som er rettet mot den menneskelige epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR). Men EGFR uttrykk bestemmes av immunhistokjemi ikke forutsi kliniske utfall av tykk- og endetarmskreft (CRC) pasienter behandlet med cetuximab. Derfor vurderte vi sammenhengen mellom EGFR nivåer oppdaget av cetuximab og narkotika følsomhet av CRC cellelinjer (Caco-2, WiDr, SW480, og HCT116) og A431 epidermoid carcinoma cellelinje. Vi brukte flowcytometri (FCM) for å detektere EGFR-binding av biotinylert cetuximab på celleoverflaten. Subklonet cellelinjer som viser de høyeste og laveste EGFR uttrykk nivåer ble valgt for videre studier. Cytotoksiske analyser ble benyttet for å bestemme differensial svar på cetuximab. Xenograft modeller behandlet med cetuximab intraperitonealt å vurdere følsomhet for cetuximab. Sterke reaksjoner på cetuximab ble spesielt utstilt ved subklonet celler med høy EGFR uttrykk nivåer. Videre er cetuximab hemmet veksten av tumorer i xenograft-modeller med høy eller lav EGFR ekspresjonsnivåer med 35% og 10% -20%, respektivt. Vi konkluderer med at deteksjon av EGFR uttrykk av cetuximab lover å gi en roman, følsom og spesifikk metode for å forutsi følsomheten av CRC til cetuximab
Citation. Shigeta K, Hayashida T, Hoshino Y, Okabayashi K, Endo T, Ishii Y, et al. (2013) uttrykk for epidermal vekstfaktor reseptor oppdaget av cetuximab Indikerer sin effekt for å hemme
In Vitro Hotell og
In Vivo
spredning av tykktarmskreftceller. PLoS ONE 8 (6): e66302. doi: 10,1371 /journal.pone.0066302
Redaktør: Anthony W.I. Lo, det kinesiske universitetet i Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 23 februar 2013; Godkjent: 03.05.2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Shigeta et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne forskningen ble støttet av den japanske departementet for utdanning, kultur, sport, vitenskap og teknologi Grant-i-Aid for Scientific Research (B) (# 23791559 KS, # 23791499 TH og # 25293292 YK). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) er et medlem av den humane EGFR familien av reseptor-protein-tyrosin-kinaser. Det er en viktig terapeutisk mål i metastatisk kolorektalcancer (mCRC), og økt EGFR uttrykk er kjennetegnet av mange humane tumorer [1], [2]. Aktivering av EGFR-signalveien resulterer i øket tumorproliferasjon, angiogenese, metastase og tumor invasivitet ved binding av en rekke forskjellige ligander, inkludert EGF-lignende molekyler, transformerende vekstfaktor-α (TGFa), og neuregulins til reseptorens ectodomain [3]. EGFR aktivering fører til initiering av potensielt onkogene intracellulære signalkaskader, inkludert RAS-mitogen-aktivert proteinkinase (MAPK), fosfoinositid 3-kinase (PI3K) /Akt, fosfolipase C, signal transduser og aktivator av transkripsjon (STAT), og SRC /FAK-trasé [4] – [6].
utviklingen av monoklonale antistoffer har forbedret strategier for å inhibere aktiviteten av EGFR inhibering i kreftterapi. Cetuximab (erbitux, Merck-Serono, Darmstadt, Tyskland) er et kimært monoklonalt antistoff (IgG1) som binder seg til ectodomain av det humane EGFR og kompetitivt inhiberer ligand binding til undertrykke tumor proliferasjon. Effekten av cetuximab ble evaluert i kombinasjon med irinotecan å behandle mCRC pasienter med tumorer er positive for EGFR uttrykk (vurdert ved immunhistokjemi) og er motstandsdyktig mot FOLFOX eller FOLFIRI regimer [7] -. [10]
Mange studier har blitt gjennomført for å identifisere faktorer som kan forutsi respons på behandling, og CRC med mutert
KRAS
ble identifisert som regel ikke svare på anti-EGFR terapi. [11], [12]. I motsetning til dette faktorer som for eksempel EGFR over-ekspresjon, forsterkning av dets gen, og p53-mutasjoner korrelerer med responsen til cetuximab; men de er ikke helt effektiv i å forutsi respons på terapi cetuximab [13], [14]. Eksperimentelle studier har foreslått en korrelasjon mellom EGFR ekspresjonsnivået og effekten av cetuximab [15]. Imidlertid synes denne sammenhengen å være spekulativ i klinisk setting, og noen studier rapporterer at ingen forholdet har blitt funnet mellom intensiteten av immunhistokjemisk farging for EGFR og svarprosenten [Vurderingen ble utført ved hjelp Response evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST) ], progressiv overlevelse eller total overlevelse i kliniske studier [8], [16] -. [18]
en fersk rapport viser at en mutasjon i EGFR ectodomain gir resistens mot cetuximab ved å hindre dets binding [ ,,,0],19]. Derfor spekulert vi at påvisning av EGFR ved hjelp av immunhistokjemisk farging ved hjelp av ikke-spesifikk IgG1-antistoff skiller seg fra deteksjon av cetuximab. Vi har videre antatt at disse cellemembran-spesifikke EGFR ekspresjonsnivåer, som kan påvises ved cetuximab, kan innvirke på inhibering av celleproliferasjon. I denne studien utviklet en metode, hvor vi brukte biotinylert cetuximab som det primære antistoff for flowcytometri (FCM) for direkte å påvise EGFR-ekspresjon av CRC-cellelinjer. Ved hjelp av denne teknikken vi vurdert forholdet mellom EGFR nivåer oppdaget av cetuximab-følsomheten til CRC cellelinjer.
Materialer og metoder
Utarbeidelse av Biotinylated Cetuximab
Den mekanismen som biotinylated cetuximab binder til EGFR er vist i Figur 1a. Biotin ble konjugert til cetuximab ved hjelp av en tilpasning av den metode som er beskrevet av Medical 1 x 10
6 celler /ml, og mer enn 95% levedyktighet) CRC-cellekulturer. Tyve subkloner av hver CRC-cellelinjer ble isolert, og EGFR uttrykk nivåer ble bestemt ved å bruke biotinylert cetuximab, som beskrevet ovenfor. Celler med enten den høyest eller lavest EGFR ekspresjonsnivåene ble valgt og dyrket i proliferasjonsanalyser og anvendt i xenograft modell. Mutasjonen status for hver subklonet CRC cellelinjer ble undersøkt på nytt for å finne ut om det er noen forskjell mellom vill og kloning celler.
Vekst Suppression analysen
Celler (1000 og 3000 celler /brønn) var sådd umiddelbart etter evalueringen av FCM i brønnene av en 96-brønns plate i DMEM eller RPMI-medium som nevnt ovenfor supplert med 0,5% FBS og 5% penicillin-streptomycin. Celler ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av cetuximab etter 24 timer og inkubert i 6 dager. Cellelevedyktigheten ble bestemt ved anvendelse av 3- (4, 5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid assay, og dannelse av formazan ble målt ved hjelp av dets absorbans ved 550 nm. Den relative hastighet av cellevekst for hver cellelinje ble tatt med i analysen ved å subtrahere absorbansen ved tid 0 fra de av kontroll- og behandlingsgrupper.
xenograft modeller, og Cetuximab behandling
Alle dyr eksperimenter i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité Keio University. Subklonet cellelinjer avledet fra WiDr og SW480 (2,0 x 10
6 celler) ble injisert subkutant inn i høyre og venstre sider av baksiden av fem uker gamle hunn nakne mus. Ekspresjonsnivået av EGFR av disse subklonet celler, ble vurdert ved FCM i hver tids av eksperiment og cellene ble umiddelbart injisert. Tumorstørrelse ble målt ved hjelp av et skyvelære, og volumet ble beregnet ved anvendelse av følgende formel: Volum = lengde x bredde x høyde. Mus ble behandlet med 30 mg /kg cetuximab administrert intraperitonealt på dagene 0, 7, 14 og 21 eller med bilen kontroll PBS (samme mengde som cetuximab). Behandlingen ble initiert når svulsten størrelsen var omtrent 100 mm
3. Tumorstørrelsene ble målt to ganger hver uke inntil dag 28, og forholdet mellom tumorvolumer til de som ble bestemt på dag 0 ble beregnet.
Vi evaluerte EGFR-ekspresjon i etterbehandlings tumorer ved immunhistokjemisk farging ved anvendelse av anti-humant villtype EGFR antistoff og ikke cetuximab. Behandling av vevsprøver ble gjort ved hjelp av vev prosessor (Sakura RH-12DM-II, Japan). I korthet vevsprøvene ble fiksert i 10% formalin i 24 timer, og deretter bearbeidet i en stigende serie av etanol og deretter fjernet med xylen og innstøpt i parafin. Parafin innleiret Vevsprøvene ble seksjonert ved en tykkelse på 4 um ved anvendelse av en mikrotom (Yamato-ROM 380, Japan). Seksjonene ble montert på starfrost /silane belagt lysbilder (Muto rene kjemikalier NewSilane II, Japan) og lufttørket. På dagen for farging av objektglass ble neddykket i xylen i 10 min før rehydratisering i etanol serie. Seksjoner ble inkubert i hydrogenperoksyd i 10 minutter for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet. Forbehandling av deparaffiinized vevssnitt med varme-indusert epitop henting kreves. Optimale resultater oppnås ved forhåndsbehandling av vevet med med varme-induserte epitop hentes ved hjelp av TE-buffer, pH 9,0. Etter som ble seksjonene inkubert med Anti-Human Wild-Type EGFR (Dako, USA) primært antistoff (1:50) for 4 grader over natten. For å bekrefte spesifisiteten av bindingen, ble normalt museserum-IgG anvendt som negativ kontroll i stedet for primært antistoff. Etter omfattende vasking ble snittene inkubert i 1 time i det sekundære biotinylerte antistoff, etterfulgt av DAB kromogen (Dako REAL EnVision Detection System, USA) i 8 min. Seksjonene ble deretter mot farget med Mayers hematoksylin og dehydrert i stigende grader av etanol før rydding i xylen og montering under et dekkglass. EGFR cytoplasmamembranen positivitet ble ansett positiv EGFR farging. Fargeintensitet ble scoret som 0 (ingen flekker), 1+ (svak), 2+ (moderat) og 3+ (sterk).
Statistiske analyser
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Stata programvare versjon 11.0. Forskjeller mellom to gruppene ble analysert ved hjelp av en uparet Student
t
test og
p
0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Resultater
Påvisning av EGFR. ved biotinylert cetuximab
muligheten av biotinylert cetuximab å detektere EGFR ved hjelp av FCM ble evaluert ved anvendelse av A431-cellelinjen, som uttrykker høye nivåer av EGFR [20]. Biotinylert cetuximab ble anvendt som det primære antistoff og FCM ble utført for å påvise den FITC-signalet. Sterk FITC intensitet ble detektert sammenlignet med kontrollgruppen FITC-merkede IgG (Fig. 1B). Dette funnet tyder på at EGFR uttrykkes ved A431 cellelinje kan evalueres ved hjelp biotinylated cetuximab.
Mutation Status for
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
og EGFR S492 Ectodomain
mutasjonen status for hvert CRC cellelinje er vist i tabell 1.
KRAS
mutasjoner i kodon 12 og 13, som forutsi effekten av cetuximab behandling, ble ikke oppdaget i Caco-2 og WiDr. I motsetning til dette ble kodonet G13D-mutasjon detektert i SW480 og HCT116. Kodon 12-mutasjon ble ikke påvist i de fire CRC-cellelinjer. Den ekson 15 mutasjon i
BRAF
ble bare påvist i WiDr. Videre
PIK3CA
mutasjoner i eksoner 9 eller 20 ble påvist i SW480 og HCT116 hhv. Til slutt, EGFR S492 ectodomain mutasjonen ble ikke påvist i alle cellelinjer.
Fra disse resultatene, valgte vi Caco-2-cellelinjen som fordi den har ingen mutasjoner i noen av de tre gener, og er forventet å være sensitive til cetuximab. HCT116 ble anvendt som en negativ kontroll, fordi den har den PIK3CA mutasjon i exon 20, som allerede har vist seg å være resistente mot cetuximab [21], [22]. På den annen side ble SW480 med en KRAS mutasjon i p.G13D valgt, ettersom det er kjent at p.G13D-muterte svulster er mer følsomme for cetuximab, sammenlignet med andre KRAS-muterte tumorer [23]. Vi hadde en sterk interesse i denne mutasjonen og ønsket å vurdere om vår hypotese og eksperimentelle modellen kan brukes til p.G13D-mutert svulster. Videre var vi også interessert i effekten av cetuximab med BRAF mutasjon fordi følsomhet for cetuximab ble tidligere observert i xenograft modell av BRAF-muterte tumorer [24].
Evaluering av EGFR uttrykk nivåer i CRC cellelinjer
EGFR uttrykk nivåer i hver CRC cellelinje ble evaluert ved hjelp av FCM med biotinylert cetuximab. Intensiteten av FITC og PE er vist i cytogram, og fluorescensen av FITC ble lett detektert i alle fire CRC-cellelinjer (Fig. 2A). Dette resultatet tyder på at disse CRC-cellelinjer som uttrykker EGFR, hvortil cetuximab bindes på celleoverflaten). Som indikert ved de data som er vist i fig. 2B, WiDr og SW480 cellelinjer uttrykte de høyeste nivåene av EGFR.
(A) Hver cellelinje ble evaluert av FCM med biotinylert cetuximab. Alle fire CRC cellelinjer skilte seg i EGFR uttrykk nivåer. (B) Histogram av hvert CRC cellelinjer. Ekspresjonsnivået av EGFR ble målt ved intensiteten av FITC fluorescens.
Etableringen av cellelinjer som uttrykker EGFR Forskjellig
EGFR kan være en av de viktigste gener for å bestemme fenotypen cellene. Derfor er fremgangsmåten for å oppnå forskjellige cellelinjer som hadde den minste innvirkning på den genetiske bakgrunn og viste en rekke EGFR-ekspresjon var ønskelig. Begrensende fortynning subkloning metode er den store teknikk for å utlede forskjellige typer celler med den samme genetisk bakgrunn [25]. Vi var i stand til å isolere subkloner av CRC-cellelinjer under anvendelse av begrensende fortynning teknikk og bestemt EGFR ekspresjonsnivåene i hver. I figur 3A er resultatet av FACS med WiDr-celler subklonet samt ulike EGFR uttrykk er vist. Vi valgte cellene fra de subklonet cellelinjer som uttrykte de høyeste og laveste nivåer av EGFR (Fig. 3B). Mutasjonen status for
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
, og EGFR S492 ectodomain endret ikke i hver subklonet cellelinjer.
(A) histogram av WiDr subklonet cellelinjer som viser forskjeller i EGFR uttrykk. Ulike EGFR uttrykk ble sett i subklonet cellelinjer. (B) Høye og lave EGFR subkloner med høy eller lav EGFR-ekspresjon ble valgt på basis av FCM resultater. Subkloner avledet fra fire CRC-cellelinjer ble analysert, og subklonene som oppviser høyest (blå) og laveste (grønt) nivåer av EGFR-ekspresjon ble valgt for videre studier. Kontrollene er beskrevet i rød linje.
Følsomhet for CRC cellelinjer til Cetuximab
Vi har utført analyser for å fastslå om cetuximab hemmer spredning av CRC cellelinjer. Veksten av Caco-2 og SW480 ble sterkt hemmet, mens mellom hemming av WiDr og ingen hemming av HCT116 cellelinjer ved høyeste dose av cetuximab ble observert. For å vurdere om EGFR uttrykk nivå korrelert med hemming spredning effekten av cetuximab, vi brukte subklonet cellelinjer med høy eller lav EGFR uttrykk nivåer. For å hindre spredning, subkloner av Caco-2, SW480, og WiDr, som uttrykte de høyeste nivåene av EGFR, var mest utsatt for effektene av cetuximab (Fig. 4). Imidlertid respons på cetuximab ble ikke observert i subkloner av disse cellelinjer som hadde lav EGFR ekspresjonsnivåer. Subkloner av HCT116, som i massekulturen viste minimal respons på cetuximab, ikke svare på cetuximab om de hadde høye eller lave EGFR uttrykk nivåer.
Når cetuximab ble gitt til lave CRC subkloner med lav EGFR uttrykk, svak hemning av cellevekst ble observert. Imidlertid vekst av subkloner med høy EGFR ble sterkt hemmet i sammenligning.
Følsomhet for cetuximab i xenotransplantater av subklonet CRC Cellelinjer
Hver av de subklonet cellelinjer avledet fra WiDr og SW480 ble subkutant inokulert i nakne mus (cetuximab, 30 mg /kg ukentlig i 4 uker), og forskjellen på følsomhet for cetuximab ble vurdert
in vivo
. Cetuximab hemmet veksten av WiDr-celler som uttrykte høye nivåer av EGFR med 35% sammenlignet med ubehandlede mus. I motsetning til dette ble cetuximab behandling av en WiDr-subklon som uttrykte lave nivåer av EGFR hemmet med 20% sammenlignet med ubehandlede mus (Fig. 5A).
(A) xenografter avledet fra WiDr-subklon celler behandlet med cetuximab. Sterk vekst-inhibering ble observert i tumorer avledet fra subklonene med høy EGFR-ekspresjon sammenlignet med ubehandlede mus; imidlertid, ble det observert bare liten hemning av tumorvekst indusert av xenografter av subkloner med lav EGFR uttrykk. (B) Cetuximab behandling av svulster avledet fra xenografter av SW480 subkloner celler. Lignende resultater ble også observert i tumorer avledet fra SW480 xenotransplantater dvs., sterk vekst inhibering av tumorer avledet fra subklonene med høy EGFR-ekspresjon sammenlignet med subkloner med lav EGFR uttrykk. (C) sammenligning av tumorstørrelsen på dag 28. Tumor avledet fra subklonene med høy EGFR-ekspresjon var betydelig mindre i mus behandlet med cetuximab, sammenlignet med tumorer avledet fra subklonene med lav EGFR uttrykk. (D) Representative immunhistokjemisk farging av 3 + EGF-R-ekspresjon (i, A431), 2+ EGF-R-ekspresjon (ii; WiDr Internett og iii; SW480 Internett) og 1 + EGF-R-ekspresjon. (Iv, og WiDr lav v; SW480 lav). I subkutan transplantasjon svulst i tykktarm kreft cellelinjer
xenografter avledet fra SW480 subkloner som uttrykte høye nivåer av EGFR ble hemmet med 35% sammenlignet med ubehandlet mus. Men xenografter avledet fra SW480 sublcones som uttrykte lave nivåer av EGFR ble hemmet av bare 7% sammenlignet med ubehandlet mus (Fig. 5B).
For svulster forårsaket av subkloner avledet fra WiDr eller SW480 kulturer, svulsten volum av gruppene som ble behandlet med cetuximab ble sammenlignet med den for de ubehandlede grupper etter 28 dager (fig. 5C). Tumor volum var betydelig mindre i cetuximab-behandlede grupper som ble innpodet med celler som uttrykker høye nivåer av EGFR. I motsetning til dette ble cetuximab behandlingen ikke forårsaker noen signifikant forskjell i tumorvolumer indusert av subklonene som uttrykte lave nivåer av EGFR.
Basert på det immunhistokjemisk farging, subkutan transplantasjon av tumor A431, positiv kontroll, viste 3+ EGFR uttrykk , mens høy WiDr og SW480 hadde 2 + EGFR uttrykk. I motsetning til dette lave tumorer WiDr og SW480 viste mindre EGF-R-ekspresjon (fig. 5D). Resultatene viste at svulstene etter behandling fortsatt uttrykker EGFR.
Diskusjoner
Cetuximab, en kimære IgG1 antistoff som er rettet mot EGFR, ble introdusert for å behandle mCRC. For å identifisere pasienter som vil dra mest nytte av denne biologiske terapi, påvisning av
KRAS
mutasjoner ble foreslått som hoved biomarkør [11], [26], [27]. Onkogene mutasjoner av
KRAS
er observert hos ca. 40% (20% -50%) av sporadiske CRC [28] – [31]. Mutasjoner forårsake konstitutiv aktivering av Ras /Raf /MAPK-signalveien, som er uavhengig av EGFR aktivering ved ligandbinding [32]. Karapetis
et al
. rapporterte signifikant bedring hos pasienter med villtype
KRAS
i respons på behandling med cetuximab [12].
EGFR status evaluert ved hjelp av immunhistokjemisk farging er vurdert en annen biomarkør for effekten av anti-EGFR terapi . Således ble EGFR-ekspresjon nivå som forventes å korrelere med den følsomhet og effekt av cetuximab. Til tross for denne hypotesen, resultater fra en rekke studier tyder på at EGFR status og dets ekspresjon nivå bestemt av immunhistokjemisk farging ikke kan tilsvare effekten av anti-EGFR-terapi [8], [16] – [18]. Således ble en respons på cetuximab detektert i pasienter med ikke-detekterbar tumorspesifikt EGFR-ekspresjon, hvilket fører til den konklusjon at responsen på cetuximab er uavhengig av EGFR-ekspresjon i tumorvevet [18].
identifikasjon av ytterligere genetisk determinanter av primær resistens mot EGFR-målrettede terapier i CRC er helt klart en prioritet. Resultatene som presenteres i denne undersøkelse tyder på at EGFR-ekspresjon nivå, noe som er oppdaget av cetuximab korrelerer med effektiviteten av cetuximab behandling. Videre kan vurderingen av EGFR uttrykk ved hjelp biotinylated cetuximab metoden forutsi den kliniske nytten av cetuximab behandling. Her har vi vist at spredning av CRC-cellelinjer var sterkt hemmet i celler som uttrykte EGFR ved høye nivåer, noe som tyder på at EGFR-ekspresjonsnivåer som detekteres av cetuximab korrelerer med følsomheten av celler til cetuximab behandling. Effekten av cetuximab i en xenograft modell ble også undersøkt ved å sammenligne xenografter av CRC cellelinjer subkloner som uttrykte høye eller lave nivåer av EGFR. Større vekst inhibering av tumorer ble observert i tumor indusert av subkloner med høy EGFR-ekspresjon sammenlignet med de med lav EGFR-ekspresjon. Men vi er ikke kjent med rapporter som indikerer at deteksjon av EGFR av cetuximab er assosiert med sensitiviteten av CRC til cetuximab behandling. Selv om videre studier vil være nødvendig å definere sammenhengen mellom EGFR uttrykk og følsomhet av kreftceller til cetuximab, vår nåværende resultater tyder på at vår metode for påvisning av EGFR uttrykk med cetuximab kan gi en ny biomarkør.
Vi valgte fire CRC cellelinjer, Caco-2, WiDr, SW480, og HCT116 for vår nåværende studie. Disse cellelinjer er blitt brukt i mange andre tidligere studier for å vurdere effekten av cetuximab behandling. Vi undersøkte også tilstedeværelsen av mutasjoner i
KRAS
,
BRAF
,
PIK3CA
, og EGFR ectodomain (tabell 1). En sterk respons på cetuximab ble observert i Caco-2-celler, som manglet påvisbare mutasjoner i disse tre genene; imidlertid en respons ble også påvist i SW480 celler, som huser en
KRAS Hotell og PIK3CA mutasjon. Først om
KRAS
mutasjon, effekten av cetuximab er assosiert med lengre total og progresjonsfri overlevelse blant pasienter med kjemoterapi-ildfast tykktarmskreft med p.G13D-muterte svulster enn med andre KRAS-muterte tumorer [23 ]. For det andre, når det gjelder PIK3CA mutasjon, Ogino
et al.
Rapporterte at
PIK3CA
mutasjoner er assosiert med kortere cancer spesifikk overlevelsen hos pasienter med KRAS villtype tumorer i en serie av trinn I-III kolorektal -kreft [21]. Det ble imidlertid De Roock
et al.
Rapportert for første gang at PIK3CA exon 20 mutasjoner er forbundet med dårligere resultater sammenlignet med vill-type, mens ekson 9 mutasjonen funnet å ha noen effekt [22]. Fra disse tidligere rapporter, våre resultater var i samsvar med de av en annen studie som viser at cetuximab ble effektive i SW480, som har KRAS kodon 13 mutasjon og PIK3CA ekson 9 mutasjon, mens ingen positiv effekt ble sett i HCT116 med PIK3CA ekson 20 mutasjon.
Vi studerte også WiDr og SW480 CRC celler for å evaluere effekten av cetuximab effekt ved hjelp av en mus xenograft modell. En spredning analysen viste at en sterk eller mild respons på cetuximab i mus innpodet med enten WiDr eller SW480. Caco-2, som viste sterk respons på cetuximab, ble også brukt til å etablere xenograft modell; men det klarte ikke å innpode musene. Veksten av svulster avledet fra WiDr og SW480 xenografter var svært hemmet når subkloner utstilt høy EGFR uttrykk i forhold til de med lav EGFR uttrykk. Dette tyder på at forskjellen i mengden av EGFR korrelerer med cetuximab følsomhet. Imidlertid er en begrensning av denne studien er at det er en mulighet for endringer i EGFR-ekspresjon nivå i løpet av tumorprogresjon. Selv om vår nye metode for å kvantifisere EGFR uttrykk ved hjelp av cetuximab krever videre validering som en biomarkør for effekten av anti-EGFR terapi, våre resultater tyder på at EGFR uttrykk nivåer korrelerer med følsomhet på CRC til cetuximab.
De tilsynelatende avvik mellom resultatene av denne undersøkelsen og de som tidligere er rapportert kan forklares som følger: Først blir EGFR uttrykt i 40% -70% av kolorektal kreft, og bevis tyder på en sammenheng med overlevelse [33] – [35]. Metoder brukt for å evaluere mengden av EGFR i kolorektal kreft omfatter immunhistokjemi, ligand binding, immunoblotting, fluorescens in situ hybridisering analyse og en rekke forskjellige molekylære teknikker [36]. Imidlertid kan vurderingen av EGFR-ekspresjon bli påvirket av immunreaktiviteten av normale vev, differensial EGFR reaktiviteten av neoplasmer fra forskjellige deler av tarmen, og heterogenitet av reaktiviteten innenfor kolorektal karsinom i seg selv [17], [37]. For det andre, Scartozzi
et al.
Rapporterte at EGFR status i grunnskolen kolorektale svulster skiller seg fra metastaser [38]. Tredje, Montagut
et al.
Rapporterte at EGFR S492R ectodomain mutasjon forhindrer cetuximab bindende og gir resistens mot cetuximab [19]. Dette funnet tyder på at EGFR kvantifisering ved hjelp av immunhistokjemi flekker oppdager enten villtype eller mutert EGFR som ikke binder cetuximab. Derfor kan vår nye metoden å løse dette problemet, fordi det avhenger av evnen til cetuximab å oppdage EGFR uttrykk.
Mange kliniske studier har vist effekt av å legge cetuximab til behandling for mCRC [7], [8], [39]. Van Cutsem
et al
. utført en fase III-studie av førstelinjebehandling, hvor cetuximab ble lagt til FOLFIRI og 5-FU-baserte multidrug kjemoterapi med irinotecan [40]. Tillegg av cetuximab ble assosiert med en betydelig økning i median progresjonsfri overlevelse sammenlignet med ingen cetuximab. Jonker
et al
., I en annen fase III studie sammenlignet anti-EGFR antistoffer med beste støttebehandling hos pasienter [10]. I denne studien ble cetuximab lagt sammen med beste støttebehandling og var forbundet med betydelige forbedringer sammenlignet med beste støttebehandling alene. Men resultatene fra de fleste studier viser en trend mot bedre overlevelse dersom kjemoterapi ble kombinert med cetuximab, men ikke avsløre en betydelig innvirkning på CRC behandling.
Svarprosenten av cetuximab behandling for CRC er 30% -40 % [10]. Tyder på at
KRAS
mutasjoner er de mest effektive prediktorer for valg av pasienter som vil ha nytte av behandling; imidlertid har disse mutasjonene, av seg selv, ikke identifisere de beste respondere. Våre foreliggende resultater tyder på at denne nye metode for påvisning av EGFR ved å bruke biotinylert cetuximab kan tilveiebringe et middel for å detektere svært sensitive pasienter med villtype
KRAS
. Selv om videre undersøkelser er nødvendig for å vurdere vår hypotese, kan teknikken beskrevet her gi en mer spesifikk indikasjon for å gjennomføre behandling av CRC med cetuximab.
I konklusjonen, resultatene av denne studien viser at EGFR uttrykk nivåer, som ble oppdaget av cetuximab, kan korrelere med følsomhet for cetuximab-mediert hemming av tumorcellevekst. Derfor tror vi at disse resultatene kan gi en ny metode for å kvantifisere EGFR uttrykk, og dermed muliggjør mer effektiv utvalg av CRC pasienter som vil ha nytte av cetuximab terapi.
Takk
Forfatterne takker H.
