Abstract
Bakgrunn
kreft stamceller (cscs) kan spre seg og fornye seg selv i stor grad på grunn av deres evne til å uttrykke anti-apoptotiske og resistente proteiner, og dermed opprettholde tumorvekst. Derfor kan det hende at strategien for å utrydde cscs har betydelige kliniske implikasjoner. Målene med denne studien var å undersøke de molekylære mekanismer som resveratrol hemmer stamcelle karakteristikker av pankreas cscs avledet fra humane primære svulster og Kras
G12D transgene mus.
metodikk /hovedfunnene
Menneskelige bukspyttkjertelen cscs (CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+) er svært tumorigent og danne subkutane svulster i NOD /SCID-mus. Menneske bukspyttkjertelen cscs uttrykker høye nivåer av CD133, CD24, CD44, ESA, og aldehyd dehydrogenase uttrykker også betydelig mer Nanog, Oct-4, Notch1, MDR1 og ABCG2 enn normalt bukspyttkjertelen vev og primære kreft i bukspyttkjertelen celler. Tilsvarende cscs fra Kras
G12D mus uttrykke betydelig høyere nivåer av Nanog og oktober-4 enn bukspyttkjertelen vev fra PDX-Cre mus. Resveratrol hemmer veksten (størrelse og vekt) og utvikling (Panin lesjoner) av kreft i bukspyttkjertelen i Kras
G12D mus. Resveratrol hemmer selvfornyelse kapasitet på pancreatic cscs avledet fra humane primære svulster og Kras
G12D mus. Resveratrol induserer apoptose ved å aktivere Capase-3/7 og hemme uttrykket av Bcl-2 og XIAP i menneskelige cscs. Resveratrol hemmer pluripotency opprettholde faktorer (Nanog, Sox-2, c-myc og oktober-4) og resistens genet ABCG2 i cscs. Hemming av Nanog av shRNA forbedrer hemmende effektene av resveratrol på selvfornyelse kapasitet på cscs. Til slutt, hemmer resveratrol CSCs migrasjon og invasjon og markører for epitel-mesenchymale overgang (Zeb-en, Slug og Snail).
Konklusjon /Betydning
Disse dataene tyder på at resveratrol hemmer kreft i bukspyttkjertelen stamcelle egenskaper i mennesker og Kras
G12D transgene mus ved å hemme pluripotency opprettholde faktorer og epitel-mesenchymale overgang. Som konklusjon, kan resveratrol brukes for behandling av kreft i bukspyttkjertelen
Citation. Shankar S, Nall D, Tang S-N, Meeker D, Passarini J, Sharma J et al. (2011) Resveratrol hemmer kreft i bukspyttkjertelen Stem Cell Karakteristika hos mennesker og Kras
G12D gene mus ved å hemme pluripotency Vedlike Faktorer og epithelial-Mesenchymale Transition. PLoS ONE 6 (1): e16530. doi: 10,1371 /journal.pone.0016530
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania, USA
mottatt: 22 november 2010; Godkjent: 21 desember 2010; Publisert: 31 januar 2011
Copyright: © 2011 Shankar et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdød. i USA. Det er ventet at ca 32 000 amerikanere vil dø av kreft i bukspyttkjertelen i år. Med en samlet 5-års overlevelse på 3% [1], har kreft i bukspyttkjertelen et av de fattigste prognosene blant alle kreft [2]. Bortsett fra dens stille natur og tilbøyelighet for sent funn viser bukspyttkjertelkreft også uvanlig motstand mot cellegift og stråling. Bare 20% av kreft i bukspyttkjertelen pasienter er kvalifisert for kirurgisk fjerning [3]. Virksomheten er svært komplekse, og med mindre utføres av kirurger spesielt opplært og erfarne i denne prosedyren, kan de være forbundet med svært høy forekomst av operativ morbiditet og mortalitet. Dessverre er mange bukspyttkjertel kreft er ikke resectable ved diagnosetidspunktet. Videre er det begrenset behandlingstilbud tilgjengelig for pasienter med bukspyttkjertelkreft fordi kjemo- og radioterapi er stort sett ineffektiv, og metastatisk sykdom ofte redevelops selv etter operasjonen. Derfor er det et presserende behov for å oppdage nye og effektive metoder for forebygging og /eller behandling av bukspyttkjertelkreft.
Det blir nå innsett at svulster inneholder et lite antall svulstdannende og selvfornyende kreft stamceller (cscs) innen en befolkning på nontumor dannende kreftceller [4]. Vi og andre har identifisert cscs i flere typer humane cancere, inkludert kreft i bukspyttkjertel [5], [6], [7], [8], [9]. Cancer stamceller hypotese antyder at konvensjonelle kjemoterapier drepe differensierte eller differensierende celler, og disse cellene danner hoveddelen av tumoren, men kan ikke generere nye celler. Tumor tilbakefall kan forekomme fordi cscs forbli urørt, noe som tyder på fjerning av cscs er svært avgjørende for effektiv kreftbehandling. I motsetning til de fleste celler i tumoren, cscs, inkludert pankreatiske cscs, er resistente overfor kjemoterapi, og kan bidra til tumormetastase og tumor tilbakefall etter behandling. Derfor medikamenter som selektivt rettet mot cscs tilby en større løftet for kreftbehandling og /eller forebygging.
Epidemiologisk og kostintervensjonsstudier hos dyr og mennesker har antydet at diett-avledet fenolene, særlig flavonoider, kan spille en gunstig rolle i å hemme, å reversere eller retarderende tumorgenese i mange typer kreft, inkludert kreft i bukspyttkjertelen [10]. Polyfenolforbindelsen resveratrol er et naturlig forekommende phytochemical og finnes i mange plantearter, deriblant druer, peanøtter og ulike urter [10]. Resveratrol har vist seg å ha anti-inflammatorisk, antioksidant, antitumor, nevrobeskyttende og immunmodulerende aktiviteter [10], [11], [12], [13], [14]. Det har også aktivitet i reguleringen av flere cellulære hendelser assosiert med kreft [10], [11], [12], [13], [14]. Dets anticancer virkning i kreft i bukspyttkjertelen er dens evne til å inhibere celleproliferasjon og angiogenese, og induserer apoptose i pre-kliniske studier [15], [16], [17], [18], [19], [20]. Resveratrol kan forbedre antitumor aktivitet av gemcitabin
in vitro Hotell og i orthotopic musemodell for menneskelig kreft i bukspyttkjertelen [19]. Vi og andre har vist at resveratrol forbedrer det terapeutiske potensialet til anticancermedikamenter og sensitizes kreftceller til å kjemoterapi og radioterapi [10], [19], [21], [22], [23]. Selv om disse studiene har undersøkt effekten av resveratrol på kreft i bukspyttkjertelen, er det ingen studier som undersøker hvordan resveratrol regulerer bukspyttkjertelkreft stamcelleegenskaper.
Epitelceller gjennomgå fibroblastoid morfologiske endringer knyttet til økt motilitet eller invasivitet grunn av redusert celle- celle adhesjon (11-14). Fibroblastoid morfologiske endringer av epitelceller er kjent som epithelial-til-mesenchymale overgang (EMT). EMT induksjon i kreftceller resultater i oppkjøpet av invasive og metastatiske egenskaper [24], [25], [26], [27], [28]. Nye rapporter viser at fremveksten av cscs skjer delvis som et resultat av EMT, for eksempel gjennom signaler fra stromale tumor komponenter. Cscs og EMT-type celler, som deler molekylære egenskaper med cscs, har vært antatt å spille viktige roller i legemiddelresistens og tidlig kreft metastase som demonstrert i flere menneskerettighets maligniteter inkludert kreft i bukspyttkjertelen [27], [29], [30]. Dermed er oppdagelsen av molekylær kunnskap om legemiddelresistens og metastasering i forhold til cscs og EMT i bukspyttkjertelkreft bli et viktig forskningsområde, og slik kunnskap er sannsynlig å være nyttig i oppdagelsen av nyere legemidler samt designe nye terapeutiske strategier for behandling og /eller forebygging av kreft i bukspyttkjertelen med bedre resultat.
Formålet med studien var å undersøke de molekylære mekanismer som resveratrol hemmer bukspyttkjertelen CSC egenskaper i mennesker og Kras
G12D transgen musemodell, og undersøke om hemming av Nanog forbedrer evnen til resveratrol å hemme selvfornyelse kapasitet av menneskelige bukspyttkjertelen cscs.
Resultater
Isolering og karakterisering av menneskelige bukspyttkjertelen cscs isolert fra humane primære pankreastumorer
Svulster inneholde et lite antall tumor-dannende og selvfornyende cscs innen en populasjon av nontumor dannende cancerceller [4]. Terapisvikt /tilbakefall skyldes ineffektiv målretting av CSC befolkningen. Den CD44
+ CD24
+ ESA
+ kreft i bukspyttkjertelen celler er svært tumorigent og besitter stamcellelignende egenskaper til selvfornyelse og evnen til å produsere differensierte avkom [31]. Fra et terapeutisk synspunkt, har cscs i flere krefttyper vist motstand mot standardbehandling og kan spille en rolle i behandlingssvikt eller tilbakefall av sykdommen. Identifisering av bukspyttkjertelen cscs og ytterligere klarlegging av de signalveier som regulerer deres vekst og overlevelse kan gi nye terapeutiske og forebyggende tilnærminger for håndtering av kreft i bukspyttkjertelen. Vi først karakterisert cscs isolert fra humane pankreatiske tumorer (Fig. 1A-H). Bukspyttkjertelen cscs uttrykke stamcellemarkører CD44, ESA, CD133, og CD24, og pluripotency opprettholde faktor oktober-4. Bukspyttkjertelen CD44
+ ESA
+ CD133
+ CD24
+ cscs også uttrykt ALDH (aldehyd dehydrogenase), en annen markør for cscs.
(A-H), kreft i bukspyttkjertelen celler ble isolert fra primærsvulster og analysert ved flowcytometri hjelp antistoff mot CD44, CD24, ESA, CD133, Oct4, og ALDH. (I), uttrykk for stamcellemarkører. RNA ble isolert fra normale bukspyttkjertelen vev, primær kreft i bukspyttkjertelen og bukspyttkjertelen cscs og uttrykk for CD24, CD133, CD44, ESA, Nanog, Notch1, MDR1 og ABCG2 ble målt ved q-RT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. *, ** @ = Signifikant forskjellig fra kontroller, P . 0,05
Vi neste undersøkt uttrykk for stamcellemarkører (CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+), pluripotency opprettholde faktorer (Nanog), signalmolekyl (Notch-1) og medikamentresistente gener (MDR1 og ABCG2) i humane normale bukspyttkjertelen, primære kreft i bukspyttkjertelen celler, og cscs av q-RT-PCR (fig. 1I). Normale bukspyttkjertelen vev uttrykker meget lave nivåer av CD133, CD24, CD44, ESA, Nanog, Notch1, MDR1 og ABCG2 i forhold til kreft i bukspyttkjertelen og cscs. Menneske pankreastumorer uttrykt ca 3-6% cscs. Til sammenligning uttrykket av disse genene i kreft i bukspyttkjertelen celler var betydelig lavere enn cscs. Interessant, CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+ CSC uttrykke høyere nivåer av Nanog, Notch1, MDR1 og ABCG2 gener.
Svulst potensialet CD133
+ CD44
+ CD24
-ESA
+ bukspyttkjertel cscs i NOD /SCID mus
neste sammenlignet tumorigent potensialet CD133
-CD44
-CD24
– ESA
– bukspyttkjertelen cscs med at av CD133
+ CD44
+ CD24
-ESA
+ bukspyttkjertelen cscs isolert fra humane primære svulster i NOD /SCID mus (figur 2).. Nude mus ble injisert med 50 CD44
-CD44
-CD24
-ESA
– cscs og CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+ cscs i venstre og høyre flanker, henholdsvis. Dataene viste at CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+ cscs dannes svulster i 20 dager i NOD /SCID-mus, mens CD133
-CD44
-CD24
-ESA
– cscs ikke danner svulster (fig 2a.). H E farging av CD44
+ CD24
+ ESA
+ CSC svulster som dannes i nude mus viste lignende svulst fenotype med at av primære humane tumorer (figur 2B.). Uttrykk for S100P og Stratifin var også lik i primærsvulster og bukspyttkjertelen cscs. Disse dataene antyder at CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+ cscs er tumorigent, og besitter CSC egenskaper.
(A), NOD /SCID mus ble sc injisert med 50 CD133
-CD44
-CD24
-ESA
– celler på høyre flanke og CD133
+ CD44
+ CD24
+ ESA
+ cscs på venstre flankene og tumorvekst ble observert i 20 dager. (B), bukspyttkjertelen cscs ligner humane primære tumorer. Tumor seksjoner fra humane primære pankreastumorer og bukspyttkjertel cscs dyrket i NOD /SCID mus ble farget med H . E, Statifin og S100P
Resveratrol hemmer dannelsen av primære og sekundære kuler og celle levedyktighet menneskelige bukspyttkjertelen cscs
cscs ble dyrket i bukspyttkjertelkreft stamcelle definert medium i suspensjon, og behandlet med resveratrol i 7 dager. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble kulene i hver brønn fotografert. Resveratrol hemmet veksten av sfæroider i suspensjon i en doseavhengig måte (fig. 3A). Sfæroidene fra hver behandlingsgruppe ble samlet og resuspendert for telling av cellelevedyktighet. Resveratrol hemmet bukspyttkjertelen CSC levedyktighet på en doseavhengig måte (Fig. 3B).
(A), Human bukspyttkjertelen cscs ble dyrket i seks-brønns ultralav festeplater (Corning Inc., Corning, NY) på en tetthet på 1000 celler /ml i Celprogen pankreatisk CSC-medium ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 7 dager for å oppnå primær kuler. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble kulene oppsamlet, reseeded og behandlet med resveratrol for en uke for å oppnå sekundære kuler. (B) Cellenes levedyktighet i kulene ble målt ved trypan-blå-analyse ved slutten av 7 og 14 dager fra ovennevnte eksperiment. Data representerer middelverdi ± SD. *, , #,% og @ = signifikant forskjellig fra kontroller, P 0,05. (C), ble Pankreas cscs sådd i myk agar og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 21 dager. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble antall kolonier telles. Data representerer middelverdi ± SD. *,% Og = Signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Siden resveratrol hemmet veksten av svulsten spheroid og cellelevedyktigheten til cscs, vi neste søkt å undersøke effektene av resveratrol på kolonidannelse. Pankreas cscs ble dyrket på agar, og ble behandlet med forskjellige doser av resveratrol for 3 uker. Ved slutten av inkubasjonstiden ble kolonier tellet. Resveratrol hemmet veksten av kolonier på en doseavhengig måte (fig. 3C). Disse data tyder på at resveratrol kan være effektive i å hemme den selvfornyelse kapasitet av humane pankreatiske cscs.
resveratrol aktiverer caspase-3 /-7, induserer apoptose og hemmer ekspresjon av XIAP, Bcl-2 og cyclin D1 i bukspyttkjertelen cscs
Vi neste undersøkte effekten av resveratrol på caspase-3 /-7 aktivitet, apoptose, og uttrykk for apoptose- og cellesyklusrelaterte proteiner (fig. 4). Resveratrol induserer caspase-3 /-7 aktivitet og apoptose (Fig. 4A og B). Siden IAP, BCL-2 familiemedlemmer og cyclin D1 spille viktige roller i regulering av apoptose og cellesyklus, undersøkte vi effekten av resveratrol på uttrykk for XIAP, Bcl-2, caspase-3 og cyclin D1. Resveratrol hemmet ekspresjon av XIAP, Bcl-2 og cyclin D1, og også spaltet caspase-3 (fig. 4C og D). Disse dataene antyder at resveratrol forårsaker vekst arrest og induserer apoptose i bukspyttkjertelen cscs gjennom hemming av cyclin D1 og apoptose relaterte proteiner (XIAP og BCL-2), henholdsvis.
(A og B), Aktivering av caspase- 3 /-7 og induksjon av apoptose. Pankreas cscs ble behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 48 timer, og caspase-3 /-7-aktivitet og apoptose ble målt ved colorometric og TUNEL assay, respektivt. Data representerer middelverdi ± SD. *, og # = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (C og D), bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med resveratrol (0-20 uM) i 48 timer, og western blot-analyse ble utført for å måle ekspresjonen av XIAP, Bcl-2, caspase-3 og cyclin D1. GAPDH ble brukt som en lasting kontroll.
Resveratrol hemmer uttrykk for Nanog, Sox-2, cMyc, Oct-4 og ABCG2 i menneskelige bukspyttkjertelen cscs
Siden transkripsjon faktorer Nanog, Sox-2, er cMyc og oktober-4 svært uttrykt i cscs og er nødvendig for å opprettholde pluripotency, undersøkte vi effekten av resveratrol på uttrykk for Nanog, Sox-2, cMyc og oktober-4 i menneskelige bukspyttkjertelen cscs uttrykker CD44
+ /CD24
+ /ESA
+ (fig. 5). Resveratrol hemmet ekspresjon av Nanog, Sox-2 og cMyc som målt ved QRT-PCR (fig. 5A). Tilsvarende resveratrol hemmet ekspresjon av Nanog, Oct-4 og Sox-2 i bukspyttkjertelen cscs som målt ved Western blotting (fig. 5B). Resveratrol hemmet også Nanog reporter aktivitet (Fig. 5C). Disse dataene antyder at resveratrol hemmer de faktorene som kreves for å opprettholde pluripotency i bukspyttkjertelen cscs.
(A), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med resveratrol (0-20 mm) i 24 timer. Ekspresjonen av Nanog, Sox-2 og cMyc ble målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * Og @ = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (B), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med resveratrol (0-30 mm) i 48 timer. Ekspresjonen av Nanog, Oct-4 og Sox-2 ble målt ved hjelp av Western blot-analyse. GAPDH ble anvendt som en kontroll lasting. (C) Inhibering av Nanog transkripsjon av resveratrol. Bukspyttkjertelen cscs ble omformet med Nanog reporter konstruere. Transduserte celler ble behandlet med resveratrol for å undersøke Nanog transkripsjonen aktivitet. Data representerer middelverdi ± SD. *, #, @, og ** = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (D), ble bukspyttkjertelen cscs behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 36 timer. Ekspresjon av ABCG2 ble målt ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * Og # = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Cancer stamceller har vist seg å utvise resistensegenskaper ved å uttrykke multiresistens gener som ABCG2. Vi målte derfor uttrykk for ABCG2 i menneskelige cscs behandlet med resveratrol. Resveratrol hemmet uttrykk for ABCG2 i bukspyttkjertelen cscs målt ved QRT-PCR (Fig. 5D). Disse dataene antyder at hemming av ABCG2 av resveratrol kan være gunstig i å forbedre de biologiske effektene av resveratrol alene eller i kombinasjon med andre rusmidler.
Nanog shRNA forbedrer hemmende effektene av resveratrol på bukspyttkjertelen CSC levedyktighet i kuler
Siden Nanog er sterkt uttrykt i bukspyttkjertelen cscs, søkte vi å undersøke om hemming av Nanog forsterker de biologiske effektene av resveratrol på stamcelle levedyktighet i kulene. Transduksjon av Nanog shRNA i cscs inhibert Nanog uttrykk, som vist ved western blot-analyse (Fig. 6A). Resveratrol hemmet celleviabilitet i sfæroider (kryptert shRNA) på en doseavhengig måte (fig. 6B). Transduksjon av Nanog shRNA ytterligere forbedret hemmende effektene av resveratrol på celle levedyktighet i kulene. Disse dataene antyder at hemming av Nanog kan forsterke chemopreventive effektene av resveratrol.
(A), Expression of Nanog. Bukspyttkjertelen cscs ble omformet med eggerøre eller Nanog shRNA, og Western blot analyser ble utført for å undersøke uttrykket av Nanog og GAPDH. (B), ble transdusert celler behandlet med resveratrol (0-30 uM) og kuler i suspensjon, ble dyrket i en uke. Spheres ble høstet, resuspendert og celleviabilitet ble bestemt ved trypan blå analysen.
Resveratrol hemmer markører for epitel-mesenchymale overgang, invasjon og migrasjon i menneskelige bukspyttkjertelen cscs
Epitelial til mesenchymale overganger (EMT) er transdifferensiering programmer som er nødvendige for vev morfogenese under embryonal utvikling [32]. EMT prosessen kan være regulert av et variert utvalg av cytokiner og vekstfaktorer, som for eksempel TGFfi, hvis virksomhet er dysregulerte under ondartet svulst progresjon [33]. Dermed EMT induksjon i kreftceller resulterer i kjøp av invasive og metastatiske egenskaper. Nye rapporter viser at fremveksten av cscs skjer delvis som et resultat av EMT, for eksempel gjennom signaler fra stromale tumor komponenter. EMT spiller en avgjørende rolle i tumordannelse, kreft progresjon og narkotika motstand [28], [32], [34]. Nyere studier viser at det er en direkte sammenheng mellom EMT program og forsterkningen av epiteliale stamcelleegenskaper [28], [32], [34], [35]. EMT er tilstrekkelig til å indusere en befolkning med stamcelleegenskaper fra godt differensiert epitel celler og kreftceller. Vi neste undersøkte effekten av resveratrol på uttrykk for EMT markører i bukspyttkjertelen cscs (Fig. 7). Resveratrol hemmet uttrykk for Zeb-en, Snail og Slug. Resveratrol også hemmet invasjon og migrasjon av pankreas cscs (Fig. 7D og E). Disse dataene antyder at resveratrol kan regulere EMT, invasjon og migrasjon ved å hemme uttrykket av Zeb-en, Snail og Slug i cscs.
bukspyttkjertelen cscs ble behandlet med resveratrol (0-0 mm) i 24 timer. Ekspresjonen av Zeb-1 (A), snegle (B) og Slug (c) ble målt ved hjelp av QRT-PCR. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. * Eller # = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P 0,05. (D), Invasion assay. Pankreas cscs ble platet ut på Matrigel-belagte membran i det øvre kammer av transwell og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 48 timer. Celler invaderte til det nedre kammer ble fiksert med metanol, farget med krystallfiolett og tellet. Data representerer middelverdi ± SD. *, eller # = signifikant forskjellig fra kontrollen, P 0,05. (E) Migration assay. Pankreas cscs ble sådd ut i den øverste kammer i transwell og behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 24 timer. Celler migrert til den nedre kammer ble fiksert med metanol, farget med krystallfiolett og tellet. Data representerer middelverdi ± SD. *, eller # = signifikant forskjellig fra kontrollen, P . 0,05
Resveratrol hemmer vekst og utvikling av kreft i bukspyttkjertelen i Kras
G12D mus
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) er preget av mutasjoner i Kras og hyppig deregulering av avgjørende embryonale signalveier. Den Kras
G12D
mus utvikler spontane svulster i bukspyttkjertelen, og det virkelig ligner veksten av menneskelige bukspyttkjertel kreft [36]. I
Pdx1-Cre; LSL-Kras
G12D product: (
Kras
G12D
) mus, fysiologiske nivåer av
Kras
G12D
indusere ductal lesjoner at rekapitulere hele spekteret av menneskelige PanINs, mulige forløpere til invasiv kreft i bukspyttkjertelen. Vi undersøkte derfor effekten av resveratrol på bukspyttkjertelen kreftutvikling i Kras
G12D mus (Fig. 8). Resveratrol hemmet veksten av bukspyttkjertelen (vekt og størrelse) i Kras
G12D mus sammenlignet med den ubehandlede kontroll (Fig. 8A og B). Gjennomsnittsvekten av pancreas fra Kras
G12D mus var lik som Pdx1-Cre mus.
(A), Hemming av kreft i bukspyttkjertelen vekst av resveratrol. Kras
G12D gene mus ble behandlet med resveratrol (40 mg /kg) ved tvangsforing en gang hver dag (mandag – fredag) i ca 10 måneder (mus alder 12 måneder). Pancreas vekter fra kontroll og resveratrol behandlet mus ble tatt. Vekt av bukspyttkjertelen fra PDX-Cre mus ble også tatt. (B) Bilde fra bukspyttkjertelen hentet fra kontroll og resveratrol behandlet Kras
G12D mus. (C) Kvantifisering av Panin lesjoner i bukspyttkjertelen av kontroll og resveratrol behandlet Kras
G12D mus. Data representerer gjennomsnittet ± S.D. *, @,%, # = Signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
Kvantifiseringen av Panin lesjoner i bukspyttkjertelen fra Kras
G12D mus behandlet med eller uten resveratrol i ca 10 måneder ( alder ca 12 måneder) er vist i fig. 8C. Ubehandlede (kontroll) Kras
G12D mus viste ulike stadier av kreftutvikling alt fra Panin-1A til Panin-3 etapper. Til sammenligning behandling av Kras
G12D mus med resveratrol betydelig hemmet kreft i bukspyttkjertelen utvikling som tydelig av redusert antall Panin-1A, Panin-1B og Panin-2 lesjoner. Interessant, resveratrol behandlet Kras
G12D mus viste ingen Panin 3 lesjoner. Disse dataene antyder at resveratrol hemmer vekst og utvikling av kreft i bukspyttkjertelen i Kras
G12D transgene mus.
Resveratrol hemmer selvfornyelse kapasitet på bukspyttkjertelen cscs
Vi neste undersøkt om bukspyttkjertelen av Kras
G12D transgene mus havne kreft stamceller, og om resveratrol hemmer pankreas cscs i disse musene. Behandling av Kras
G12D mus med resveratrol helt utryddet pankreas cscs i Kras
G12D mus ved 12 måneders alder. Bukspyttkjertelen cscs isolert fra Kras
G12D mus uttrykker høye nivåer av stamcellemarkører (CD133, CD44, CD24 og ESA) og transkripsjonsfaktorer (Nanog og oktober-4) (Fig. 9A). Uttrykket av disse markørene i ubehandlet Kras
G12D var betydelig høyere enn PDX-Cre mus. Pankreastumorer uttrykt ca 1.3 til 2.5% cscs isolert fra 12 måneder gamle Kras
G12D (kontroll /ubehandlet) mus. Siden vi ikke har sett noen bukspyttkjertel cscs i resveratrol behandlet mus, forsøkte vi å undersøke om cscs fra kontroll /ubehandlede Kras
G12D mus er i stand til selv-fornyende og svare på resveratrol
in vitro plakater (fig. 9B). Resveratrol hemmet selvfornyelse kapasitet på pancreatic cscs målt ved dannelsen av primære og sekundære kuler i suspensjon, og celleviabilitet i disse kulene. Disse dataene antyder at resveratrol er effektivt i å hemme selvfornyelse kapasitet på pancreatic cscs avledet fra Kras
G12D mus.
(A), ble bukspyttkjertelen cscs isolert fra Kras
G12D mus (ca 12 måneder gammel) med CD133, CD44, CD24, og ESA antistoffer. Uttrykket av disse markørene og Nanog og oktober-4 ble bekreftet ved QRT-PCR. Data representerer middelverdi ± SD. * = Signifikant forskjellig fra det samme genet av PDX-Cre mus på P 0,05. (B), cscs ble dyrket i suspensjon, og ble behandlet med resveratrol (0-30 uM) i 7 dager for å oppnå primær kuler. Ved slutten av inkubasjonsperioden, ble kulene oppsamlet, resuspendert og behandlet med resveratrol for en uke for å oppnå sekundære kuler. Cellelevedyktighet i kulene ble målt ved trypan-blå-analyse ved slutten av 7 og 14 dager. Data representerer middelverdi ± SD. *,%, , ** og ## = signifikant forskjellig fra respektive kontroller, P . 0,05
Diskusjon
kreft stamceller (cscs) har blitt identifisert i en økende antall av maligniteter og er funksjonelt definert ved deres evne til å undergå selvfornyelse og produsere differensierte avkom [37], [38]. Disse egenskapene gjør at cscs å rekapitulere den opprinnelige svulsten når injiseres i immunsupprimerte mus. Cscs innenfor en epitelial malignitet ble først beskrevet i brystkreft og funnet å vise bestemt celleoverflateantigen uttrykk (CD44 + CD24low /-) [39]. Siden da har cscs blitt identifisert i et økende antall andre menneskelige malignitet bruker CD44 og CD24, samt en rekke andre overflateantigener. Fysiologiske egenskaper, blant annet aldehyddehydrogenase (ALDH) aktivitet, er også blitt anvendt for å isolere cscs fra ondartet vev [31], [39], [40], [41], [42], [43], [44]. Stamceller få hvile fenotype ved å regulere cellesyklusproteiner og pluripotente stemness faktorer. Kreft stilk /stamceller kan utvise egenskaper som ligner på normale stamceller. Dermed stamceller er attraktive kandidater for kreft initiere celler siden deres levetid og selvfornyelse kapasitet kan føre til opphopning av genetiske mutasjoner.
Vår undersøkelse viser for første gang, kan det kreft forebyggende middel resveratrol hemme selvfornyelse kapasitet for kreft i bukspyttkjertelen stamceller avledet fra humane primære svulster og Kras
G12D mus in vitro. Vi klarte ikke å observere eventuelle kreft i bukspyttkjertelen stamceller i Kras
G12D mus behandlet med resveratrol. Men resveratrol hemmet dannelsen av primære og sekundære kuler i bukspyttkjertelen kreft stamceller isolert fra Kras
G12D mus
in vitro
. Resveratrol induserer apoptose ved å aktivere Capase-3/7 og inhibering av ekspresjonen av Bcl-2, og XIAP i cscs. Interessant, resveratrol også hemmer ekspresjonen av ABCG2, en multilegemiddel resistens gen som er vist å overuttrykke i cscs. Videre hemmer resveratrol epitelial-mesenchymale overgang ved å hemme uttrykket av vimentin, slug og sneglen, og forsinker også CSCs migrasjon og invasjon. Disse data tyder på at resveratrol kan anvendes for å forebygge kreft i bukspyttkjertelen.
Vi har nylig vist at Sulforafane hemmet selvfornyelse kapasitet for kreft i bukspyttkjertelen stamceller som målt ved celleklump og kolonidannelse [7]. Sulforaphane hemmet uttrykket av pluripotente transkripsjonsfaktorer (Nanog, okt-4 og Sox-2). Hemming av Nanog av lentiviral-mediert shRNA uttrykk forbedret selvfornyelse kapasitet på sulforaphane. Sulforafane indusert apoptose ved å hemme ekspresjon av Bcl-2 og XIAP, fosforylering av FKFR, og aktivering av caspase-3 [7]. Videre Sulforafane hemmet ekspresjon av proteiner involvert i den epiteliale-mesenkymale overgang (β-catenin, vimentin, twist-1, og ZEB1), noe som tyder på blokaden av signalering er involvert i begynnelsen av metastasering. Videre kombinasjon av quercetin med sulforaphane, hadde synergieffekter på selvfornyelse kapasitet på bukspyttkjertelen cscs. Disse dataene tyder på at Sulforafane enten alene eller i kombinasjon med quercetin kan eliminere kreft stamcelle-karakteristikker. Tilsvarende i denne studien, resveratrol hemmet selvfornyelse kapasitet på pancreatic cscs.
cscs dele prinsipielle egenskaper med voksne stamceller nemlig selvfornyelse, høy proliferativ potensielle, clonogenicity, og multipotency [45], [46] [47]. I tillegg har de evnen til på reproduserbar måte å danne den samme tumor fenotype som i pasienten og å gjennomgå differensiering til ikke-tumorigene celler [48], [49], [50]. Cscs ble først isolert fra pasienter med hematologisk malignitet i hvilken noen få celler kunne sette i gang en ny tumor [51]. I løpet av de siste årene, ble cscs også identifisert og isolert fra faste tumorer så som bryst, hjerne, tykktarm, bukspyttkjertel, og prostata-tumorer [29], [39], [44], [52], [53], [54 ], [55], [56]. I kreft i bukspyttkjertelen, CD44 + /CD133 + bukspyttkjertelen cscs blitt identifisert [57], [58]. På grunn av den observerte heterogenitet i bukspyttkjertelkreft, vil bruken av encellede markører for utvalget, karakterisering /identifikasjon og funksjonell evaluering av stilk /progenitor-lignende bukspyttkjertelen kreftceller ikke være hensiktsmessig. Deregulering av ALDH enzymaktivitet er implisert i patofysiologien til en rekke hematologiske og epiteliale cancere [40], [59], [60], [61], [62], [63], [64]. Innføringen av FACS-baserte levedyktig celle sortering for ALDH aktivitet (ALDEFLUOR analyser) i tumorbiologi har ytterligere underbygget en rolle ALDH
hi subpopulasjoner av kreftceller i kreftutvikling [40], [54], [60], [65 ].
