Abstract
Til tross for fremskritt i tidlig diagnose og multimodalitet terapi for kreft, de fleste av lungekreftpasienter har blitt lokalt avansert eller metastatisk ved diagnosetidspunktet, noe som tyder på svært progressive karakteristikk av lungekreft celler. Den mekanismer streke invasivitet og metastasering av lungekreft er ennå ikke klarlagt. I denne studien ble immunhistokjemi utført for å påvise uttrykk for CXCL16-CXCR6 i humane lungekreft vev. Det ble demonstrert at lik CXCL12 og CXCR4, CXCL16 og CXCR6 ble også koekspresjon i humane primære lungekreft vev. Etter å ha bekreftet funksjonell eksistensen av CXCL16 og CXCR6 protein i A549, 95D og H292 celler ved ELSA og flowcytometri analyse, vi videre utforsket betydningen av CXCL16-CXCR6 aksen i de biologiske funksjonene til lungekreft cellelinjer
in vitro
. Det ble funnet at CXCL16 hadde ingen effekt på PCNA (prolifererende cell nuclear antigen) uttrykk for A549, 95D og H292-celler. Men både eksogene CXCL16 og CM (kondisjonert medium fra A549, 95D eller H292) betydelig forbedret
in vitro
levedyktighet og invasjonen av tre lunge kreft cellelinjer. Den nøytraliserende antistoff til CXCL16 eller nedregulering av CXCR6 var i stand til å inhibere økt levedyktighet og invasivitet av A549, 95D og H292-celler stimulert av CXCL16 eller CM. Våre resultater antyder at CXCL16-CXCR6 aksen er involvert i reguleringen av levedyktighet og invasjon i stedet PCNA uttrykk for lunge Caner celler, som åpner døren for bedre å forstå mekanismene for lungetumorprogresjon og metastase
Citation.: Hu W, Liu Y, Zhou W, Si L, Ren L (2014) CXCL16 og CXCR6 Er kouttrykte i human Lung Cancer
in Vivo Hotell og mediere invasjon av Lung Cancer Cell Lines
in vitro
. PLoS ONE 9 (6): e99056. doi: 10,1371 /journal.pone.0099056
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 19 september 2013; Godkjent: 11 mai 2014; Publisert: 04.06.2014
Copyright: © 2014 Hu et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet er støttet av National Natural Science Foundation of China 81270753 (til W.-HZ), Wuhan Science and Technology Prosjekt 2013060602010249 (til W.-DH), Science Foundation Natural Science and Technology Ministry of Hubei-provinsen 2010CDB05502 (til W.-DH ) og personalopplæringsplan av The Health Care System of Beijing 2013-3-021 (til W.-HZ). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
lungekreft er en vanlig ondartet svulst som er rangert som den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis, og forekomsten av lungekreft har vært økende de siste årene i noen store byer i Kina [1]. Til tross for fremskritt i tidlig diagnose og multimodalitet terapi for kreft, er det fem års total overlevelsesrate for mest avanserte lungekreftpasienter fortsatt mindre enn 20%. Mekanismene streke invasivitet og metastasering av lungekreft har fått mye oppmerksomhet fra thorax onkologer i flere tiår av år. Noen hypoteser og molekyler har blitt lagt frem, men en grundig forståelse av de intrikate invasive og metastatiske prosesser av carcinoma celler er fortsatt et åpent spørsmål.
Siden oppdagelsen av den første chemokine i 1987, mer enn 50 typer kjemokiner og 20 typer kjemokin reseptorer er blitt klonet og identifisert. Aktivering av chemokine /reseptor signalveien er blitt bekreftet å mediere en rekke fysiologiske og patologiske hendelser, spesielt rekruttering av lymfocytter så vel som tumorvekst og metastatisk spredning, som gir mulighet for klarlegging av metastatiske prosess av maligne celler fra immunologi perspektiver [2], [3], [4], [5], [6].
Blant forskjellige kjemokiner og kjemokinreseptorer, CXCL16-CXCR6 er en unik chemokine /chemokine receptor-par. CXCL16, også kjent som SR-PSOX, hører til CXC kjemokin familie og foreligger både i en transmembran og oppløselig form [7], [8], [9]. Interaksjon mellom CXCL16 og dens «eneste reseptor, CXCR6 (også kalt Bonzo, STRL33 og TYMSTR) er involvert i flere biologiske aktiviteter, inkludert selektive smugling av lymfocytter undergrupper, celle adhesjon, celleoverlevelse, muskel regenerasjon, hjernens utvikling, kronisk betennelse og anti- tumor-immunitet [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Særlig har nyere studier bekreftet den over-uttrykk for CXCL16 og /eller CXCR6 i flere typer kreft hos mennesker og CXCL16 kan stimulere vekst, migrasjon, invasjon og aktivering av AKT signalveien av kreftceller via sin «reseptor CXCR6
in vitro product: [15], [16], [17], [18]. Vår tidligere studie bekreftet også overdreven uttrykk for CXCR6 protein i menneske innfødte prostata kreft celler og aktivering av CXCL16-CXCR6 veien kan fremme migrasjon og invasjon av PC3 og LNCaP celler
in vitro product: [19]. Disse resultatene tyder på at CXCL16-CXCR6 kan være en roman chemokin ligand /reseptor parene innblandet i tumorigenesis og metastasering. Noen grupper har begynt å ta hensyn til rollen CXCL16-CXCR6 i svulsten, er imidlertid forholdet mellom CXCL16-CXCR6 og lungekreft fortsatt unnvikende og fortjener videre undersøkelser.
I denne studien uttrykk for CXCL16 og CXCR6 i menneskelig lungekreft vev og lungekreftcellelinjer, A549, H292 og 95D, ble bestemt ved immunhistokjemi og immunocytochemistry hhv. Da den enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA) og flow-cytometri ble utført for å undersøke den funksjonelle ekspresjon av CXCL16 og CXCR6 i tre kreftcellelinjer. For ytterligere å belyse rollen CXCL16-CXCR6 akse i lungekreft, vi også observert virkningen av CXCL16 på PCNA (prolifererende cell nuclear antigen) uttrykk og invasiv evne til A549, H292 og 95D celler. Virkningene av CXCR6 gen nedregulering av små interfererende RNA (siRNA) teknologi på levedyktighet og invasivitet av A549 celler ble også bestemt ved MTT og invasjon assay. Gjennom å utforske endring av biologiske oppførsel av lungekreft celler mediert av CXCL16-CXCR6 aksen, håper vi å gi innsikt i bedre å forstå utviklingen av denne aggressive ondartet svulst.
Materialer og metoder
Menneske tissue Collection
Alle prosedyrer som involverer deltakerne i studien ble godkjent av Zhongnan Hospital i Wuhan University Menneskelig forskningsetiske komité, og deltakerne hadde gitt sin skriftlige informert samtykke.
Menneske lungekreft (33 tilfeller) og normal (5 tilfeller) vev ble oppnådd fra pasienter som gjennomgikk lungelapp reseksjon eller pneumonectomy for kreft eller ikke-kreft lungesykdommer på Zhongnan Hospital of Wuhan University fra 2003 til 2006. Identifiseringen av tumortyper ble utført av to profesjonelle patologer . Av 33 lungekrefttilfellene, 13 tilfeller var adenokarsinomer (AC), 12 tilfeller var plateepitel karsinom (SC), 7 tilfeller var adenosquamous karsinom (ASC) og 1 tilfelle var bronchoalveolar karsinom (BC). Stadier av svulster ble estimert i henhold til den syvende utgaven av det nye TNM staging system foreslått av den internasjonale foreningen for studier av lungekreft (IASLC) i 2009. I de 33 prøvene, 3, 1, 9, 8, 10 og 2 tilfellene var IA, IB, IIA, IIB, IIIA og IIIB, henholdsvis.
Cell Culture
Lungekreft cellelinjer A549, H292 og 95D celler ble hentet fra celle~~POS=TRUNC Bank of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina). Cellene ble dyrket i 1640 inneholdende 10% varme-inaktivert FBS (Gibco, Grand Island, NY, USA), 10 mM HEPES, 1 mM pyrodruesyre-natrium, 4,5 g /l glukose, 100 UI /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin. Cellene ble gjenvunnet og passaged til tre ganger, deretter tillatt å vokse til konfluens for de følgende eksperimenter.
Immunhistokjemi
Fremgangsmåte for immunhistokjemi var basert på vår tidligere prosedyre [19]. I korthet vev ble rutinemessig fiksert med formalin og innstøpt i parafin. Antigen gjenfinning ble utført og 0,3% H
2o
2 i fosfatbufferoppløsning (PBS) ble anvendt for å blokkere endogen peroksidase-aktivitet i seksjonene. Etter behandling med proteinblokkerende serum for å blokkere ikke-spesifikk binding, ble seksjonene inkubert over natten ved 4 ° C med muse-anti-human CXCR4 (25 ug /ml), muse-anti-human CXCR6 (25 ug /ml), anti-mus humant CXCL12 (20 ug /ml) og geit anti-humant CXCL16 (20 ug /ml) antistoffer (fra R 75% (poengsum = 4). Kombinere farging intensitet og andelen positive celler, klassifisert vi scoring som følger: 2, negative uttrykk; 2-3, svak uttrykk; 4-5, moderat uttrykk og 6-7 som sterkt uttrykk [19].
Immunocytochemistry
Etter 70-80% samløpet av celler, A549, H292 eller 95D celler ble fordøyd med 0,25 % trypsin (Bio Basic Inco., BBI, Ontario, Canada) inneholdende 0,1% EDTA og sådd ut ved en tetthet på 2 x 10
5cells /brønn i 6-brønn plater forhånds er lagt inn med dekkglass. Etter å ha dyrket i 48 timer, ble lungecancercellelinjer fiksert i 4% formalin i 20 minutter ved romtemperatur, vasket i PBS og permeabilisert i 15 minutter i 0,03% Triton X-100-PBS, ble deretter behandlet med 0,3% H
2o
2 å inaktivere endogen peroksidase aktivitet. Den følgende prosedyre var som beskrevet ovenfor i fremgangsmåten ifølge immunhistokjemi og humane primære dyrkede trophoblast celler ble også brukt som positiv kontroll [13], [19]. Resultatene ble analysert av Image-ProPlus 6.0-programvare og middelverdien uttrykk tetthet av CXCL16 og CXCR6 i tre cellelinjer ble registrert. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
Utarbeidelse av Cell Cultured kondisjonert medium
Den isolerte A549, ble 95D og H292 seedet i kulturflasker (6 ml /flaske) i en tetthet på 1 x 10
6 /ml, henholdsvis, og dyrket kontinuerlig i 48 timer. Supernatantene, nemlig kondisjonert medium (CM), ble oppsamlet og sentrifugert ved 2000 g, og deretter lagret ved -80 ° C. Supernatantene fra kulturmedium uten celler ble også oppsamlet som kontroll.
Enzym-bundet immunosorbent assay (ELISA)
spaltet A549, H292 og 95D-celler ble sådd ut i 24-brønns plater (500 ul /brønn) ved en tetthet på 5 x 10
5 /ml, respektivt. Supernatanter av cellekulturene ble samlet ved 24, 36, 48, 60, 72, 96 og 100 timer av kulturen. Hver samlet supernatant ble lagret ved -80 ° C for ELISA-analyse. Mengden av CXCL16 i hver supernatant ble målt ved menneskelig CXCL16 ELISA kit (Shanghai Westang Bio-Tech Co Ltd, Shanghai, Kina), i henhold til produsentens instruksjoner. Den CXCL16 analysesett viste en følsomhet på 40 pg /ml og en intra-assay variasjonskoeffisient mindre enn 12%. Forsøkene ble gjentatt tre ganger.
flowcytometrisystemer Detection for CXCR6 Expression
Membranen uttrykk for CXCR6 protein på A549, ble H292 og 95D celler oppdaget av flowcytometri henhold til vår forrige metoden og CXCR4 ble også anvendt som kontroll samtidig [20]. I korthet, for å beskytte membranen lokalisering av kjemokinreseptoren i størst mulig grad cellene, ved 70-80% konfluens celle, ble spaltet med 0,25% trypsin bare til 30-50 s, og deretter blåst av og forsiktig vasket med PBS [ ,,,0],20]. Etter blokkering med 10% FBS, ble de utvunnede cellene inkubert med mus-anti-human PE (fykoerytrin) -CXCR6 monoklonalt antistoff (1:10; R eBioscience) eller mus PE-IgG
2a isotype (eBioscience) i 1 time ved romtemperatur i mørke [21]. Den følgende undersøke Fremgangsmåten var som beskrevet ovenfor i fremgangsmåten ifølge flowcytometri deteksjon for CXCR6 ekspresjon. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger.
CXCR6 Silence i A549-celler
De isolerte A549-celler ble sådd på 6-brønners plater i en tetthet på 2 x 10
5 /ml. Ved 70-80% konfluens, ble disse cellene transfektert med phU6 /GFP /Neo plasmid inneholdende kort hårnål RNA (shRNA) molekyler rettet mot CXCR6, med bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sekvensene for tre shRNA oligonukleotider var: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC AAT TCC AAG ACT T-3 «(sense) og 5′-AAG TCT TGG AAT TGT CCT CAG-3′ (anti-sense ); (CXCR6-2820-2) 5»-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA T-3 «(fornuft) og 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (Anti-sense); (CXCR6-2821-1) 5»-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 «(fornuft) og 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3» (Anti-sense) (GENECHEM, Shanghai, Kina). Gruppene ble delt inn phU6 /GFP /Neo-CXCR6 (CXCR6-shRNA), ikke-måls siRNA oligonukleotider negativ kontroll (phU6 /GFP /Neo, shRNA-kontroll) og blank-kontroll (ingen noen behandling). Stabile transfektanter ble selektert ved G418 kultur ved en konsentrasjon på 800 ug /ml. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og ved å stanse effektivitet ble bestemt ved western blot.
celleviabilitet Assay
MTT [3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2, 5-difenyltetrazoliumbromid, Sigma Chemicals] assay ble brukt for å evaluere effektene av CXCL16-CXCR6 på cellelevedyktighet
in vitro product: [21]. Forsøkene ble delt opp i to trinn: for det første, de isolerte A549 celler fra blank-kontroll, shRNA-kontroll og CXCR6-shRNA (2819-1) grupper ble sådd i 96-brønns flatbunnet mikroplater med en tetthet på 2 x 10
3 celler /brønn og dyrket i 24, 48, 72, 96 og 120 timer, henholdsvis. For det andre, etter sultet med 1640 uten FCS i 12 timer, cellene fra blank-kontroll, shRNA-kontroll eller CXCR6-shRNA (2819-1) grupper ble behandlet med kontrollmediet (1640) eller CXCL16 ved en konsentrasjon på 100 ng /mL i 48 timer.
MTT-reagens (20 ul) ble tilsatt til hver brønn av 96-brønners mikrotiterplater og inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Mediet ble dekantert, og 100 ul DMSO ble tilsatt for å oppløse de reaktive krystaller. Absorpsjonsevne ble målt ved en bølgelengde på 570 nm med en automatisk mikroplateleser. Prøvene ble kjørt i triplikat, og forsøkene ble gjentatt tre ganger, [21].
ECM Invasion Assay
invasive egenskaper av lungekreft-cellelinjer ble evaluert objektivt ved
in vitro
invasjonen analysen basert på vår forrige metoden [19], [20]. I korthet, den cellekultur innsatsene (8 um porestørrelse, diameter 6,5 mm, Corning, Corning, NY, USA) ble belagt med 10 ul ren ekstracellulære matriks (ECM) gel (Sigma, St. Louis, MO 63103, American) plassert i en 24-brønns plate. Eksperimentene ble delt inn i følgende to deler: For det første, den isolerte A549, H292 eller 95D celler (1 x 10
5/200 ul serumfritt 1640) ble sådd ut i det øvre kammer, og behandlet med CM, CXCL16 ( 100 ng /ml) og en blanding av CM eller CXCL16 med CXCL16 nøytralisering antistoff (100 ng /ml). For det andre, ble A549-celler, fra den tomme kontroll, phU6 /GFP /Neo og phU6 /GFP /Neo-CXCR6 gruppe, sådd på det øvre kammer i en tetthet på (1 x 10
5/200 ul serum- fri 1640), og deretter behandlet med CXCL16 (100 ng /ml) eller CM. De nedre kamre ble fylt med 800 pl 1640 medium tilføres med 10% FBS. Etter å ha inkubert ved 37 ° C i 24 timer, ble skivene fjernet og vasket i PBS. Da noninvading cellene sammen med ECM gel ble fjernet fra den øvre overflaten av filteret ved å tørke med en bomullspinne. Innsatsene ble fiksert i 4% formalin i 10 minutter ved romtemperatur og farget med hematoksylin. Resultatet ble observert under et lysmikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) og cellene som migrerte til den nedre overflate ble telt. For å eliminere individuelle variasjon, ble resultatene vurdert av to uavhengige forskere og invasive indeksen ble beregnet som andel av de migrerte cellene i eksperimentgruppen som for sin egen kontroll. Hvert forsøk ble utført i triplikat, og gjentatt tre ganger.
statistikker og
Forsøkene
in vitro
ble vist i gjennomsnitt ± SE. Dataene i PCNA uttrykk,
in vitro
levedyktighet og invasjonen assay ble vurdert med post hoc Dunnetts
t
test og Dunnett T3 test, når det passer. Forskjellene ble akseptert som signifikant på
P
. 0,05
Resultater
Protein Expression of CXCL16-CXCR6 i Human Lung Cancer
in vivo
Immunhistokjemi ble utført for å bestemme protein ekspresjon av CXCL16 og CXCR6 i human lunge caner (33 prøver) og normale vev (5 prøver). Resultatene i fig. 1 viste tydelig at koekspresjon av CXCR6 og CXCL16 protein i humane lungekreft vev. Spesifikk brunfarget farging for CXCR6 og CXCL16 i cytoplasma og membranen kan bli klart observert i de primære lungekreftceller, men den positive uttrykk frekvensen og fargeintensitet av CXCR6 var sterkere enn den for CXCL16. Selv moderat til sterk, brun-farget farging for CXCL16 og CXCR6 ble også observert hos normale lunge vev, men det positive uttrykket var i hovedsak begrenset til de alveolære epitelceller og betennelsesceller. Det var ingen bevis for spesifikk farging med kontroll antistoff.
Immunohistochemistry ble utført for å bestemme protein uttrykk for CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i humane primære lungekreft vev. Antistoffene anvendt i dette forsøk ble mus anti-human CXCR4 (25 ug /ml), muse-anti-human CXCR6 (25 ug /ml), muse-anti-humant CXCL12 (20 ug /ml) og geit anti-humant CXCL16 (20 ug /ml) antistoffer. Det ble demonstrert i fig. 1 at en bestemt brunfarget farging for CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i cytoplasma og membran av menneskelige ulike patologiske typer lungekreft celler. Moderat til sterk, ble brunfarget farging for CXCL16 og CXCR6 også observert hos normale lunge vev, men det positive uttrykket var i hovedsak begrenset til de alveolære epitelceller og betennelsesceller. Det var ingen bevis for spesifikk farging med kontrollantistoffet. Bildene var representant for forsøkene. AC: adenokarsinomer; SC: plateepitel karsinom; BC: bronchoalveolar karsinom; Con: normal lunge vev; Villi: menneske første trimester villous vev, som en positiv kontroll. Forstørrelse, × 200.
Videre har vi også analysert foreningen av CXCL16-CXCR6 uttrykk mønster med ulike patologiske typer lungekreft. Det ble demonstrert i fig. 2 som av de detekterte 33 lungekreft prøver, for CXCR6 protein ekspresjon, bare 3 SC tilfeller var svakt positive, og de andre var alle moderat til sterk positiv, mens for CXCL16, fargeintensitet var negativ (10), svak (8), moderat (8) og sterk (7). Av de 10 CXCL16-negative prøver, 7 tilfeller tilhører AC, 2 tilfeller tilhører SC og en tilfellet var ASC. Av de 7 CXCL16-sterk prøver, 5 tilfeller var SC og 2 tilfeller var ASC. Resten av 16 svake til moderate prøver var AC (6), SC (5) ASC (4) og BC (1), henholdsvis (fig. 2).
I henhold til farging intensitet og den prosentvise av positive celler, ble resultatene fra immunkjemi analyse klassifisert som følger: mindre enn 2, negative uttrykk; 2-3, svak uttrykk; 4-5, moderat uttrykk, og 6-7 som sterkt uttrykk. AC: adenokarsinomer; SC: plateepitel karsinom; ASC: adenosquamous karsinom; BC:. Bronchoalveolar carcinoma
I denne studien har vi også brukt CXCL12-CXCR4 som positiv kontroll og sammenlignet uttrykket mønster mellom CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4. Som vist på fig. 1,2 og tabell 1 de fleste av prøvene uttrykt CXCR4 (30/33) og CXCL12 (28/33) protein, til tross for en lett forskjell i uttrykket intensitet. Videre i 33 prøver oppdaget, var det 30 saker som samtidig er uttrykt CXCR6 og CXCR4 protein, og 19 saker som samtidig er uttrykt CXCL16 og CXCL12 protein.
Protein Expression of CXCL16-CXCR6 i Human Lung Cancer Cell Lines
etter å ha bekreftet koekspresjon av CXCL16-CXCR6 protein i menneske innfødte lungekreftceller, vi videre analysert uttrykket av CXCL16-CXCR6 i human lungekreft cellelinjer A549, H292 og 95D ved immunocytochemistry. Som vist på fig. 3, kan positive brunfarget farging for både CXCL16 og CXCR6 være klart observert i cytoplasma og cytomembrane av A549, H292 og 95D-celler, respektivt. Selv om det var forskjeller i ekspresjon intensitet i A549, 95D og H292-celler, fargingen for liganden var alle relativt svakere enn den er reseptoren i tre typer celler. Videre er uttrykket mønster av CXCL16-CXCR6 var lik den for CXCL12-CXCR4, den spesifikk farging for både CXCR4 og CXCL12 kan også observeres i tre lungecancercellelinjer på tross av forskjellen i uttrykket intensitet i forskjellige celler.
Immunocytochemistry ble utført for å påvise proteinet uttrykk for CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i humane lungekreftcellelinjer. Antistoffene anvendt i dette forsøk ble mus anti-human CXCR4 (25 ug /ml), muse-anti-human CXCR6 (25 ug /ml), muse-anti-humant CXCL12 (20 ug /ml) og geit anti-humant CXCL16 (20 ug /ml) antistoffer. Positive brunfarget farging for både CXCL16 og CXCR6 ble klart observert i cytoplasma og cytomembrane av A549, H292 og 95D celler, henholdsvis. Videre CXCL12 og CXCR4 var også co-uttrykk i tre lunge kreft cellelinjer. Ingen bakgrunnsfarging ble observert i isotypekontroll. A: Bildene var representative for forsøkene; B: Den relative uttrykk intensitet CXCL16-CXCR6 og CXCL12-CXCR4 i A549, H292 og 95D celler. Tro: humane primære dyrkede trophoblast celler som en positiv kontroll. Forstørrelse, × 200.
Deretter ble en ELISA-analyse utført for å undersøke utgivelsen av løselig CXCL16 i kultivert A549, H292 og 95D celler
in vitro
. Som vist på fig. 4, tre typer lungekreft cellelinjer alt utskilt CXCL16 spontant nesten med en konstant hastighet, men det var en liten forskjell i konsentrasjonen av CXCL16 i kulturmediet. Mengden av CXCL16 produsert av H292-celler var den høyeste av de tre celletyper. Konsentrasjonen av CXCL16 i 24 timer-kultivert medium for H292 allerede nådd til 1391,9 ± 13,43 ng /ml og den akkumulerte konsentrasjonen av CXCL16 var 2633,2 ± 9.84 og 2566,9 ± 3,1 ng /ml etter kultur i 96 og 120 h, henholdsvis. Selv om produksjonen av CXCL16 av A549-celler var relativt mindre enn for både H292 og 95D-celler, produksjon av CXCL16 ble fortsatt i en tidsavhengig måte, og mengden av CXCL16 var 977,45 ± 12,85 ng /ml etter dyrking i 120 timer. For 95D-celler, konsentrasjon av CXCL16 også positivt korrelert til kulturen tid og 120 h produksjon av CXCL16 var 1165,2 ± 12,00 ng /ml.
spaltet A549, H292 og 95D-celler ble sådd ut i 24-brønners plater (500 ul /brønn) ved en tetthet på 5 x 10
5 /ml, respektivt. Supernatanter av cellekulturene ble samlet ved 24, 36, 48, 60, 72, 96 og 100 timer av kulturen. En ELISA-analysen ble utført for å undersøke utgivelsen av løselig CXCL16 i kultivert A549, H292 og 95D celler
in vitro
. Som vist på fig. 4, tre typer lungekreft cellelinjer alt utskilt CXCL16 spontant på en tidsavhengig måte, Despites av en forskjell i konsentrasjonen av CXCL16 i kulturmediet. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger. Feilfelt skildre standard feil av gjennomsnittet.
Flowcytometri ble brukt til å påvise membran uttrykk for CXCR6 i A549, H292 og 95D celler. Selv om andelen av CXCR6 ekspresjon av H292-celler var mindre enn den for begge A549 (52,4 ± 5,79%) og 95D celler (56,03 ± 11,42%), den gjennomsnittlige andelen var fremdeles 34,87 ± 6,17 (fig. 5). Videre har vi også oppdaget membranen uttrykk for CXCR4 i A549, H292 og 95D celler med flowcytometri. Det ble funnet at prosentandelen av CXCR4-positive celler i A549, H292 og 95D var 25,56 ± 6,44 henholdsvis 46,00 ± 6,52 og 28,57 ± 1,43,. Dermed ble membran CXCR6 og CXCR4 koekspresjon i tre lunge kreft cellelinjer til tross for en liten forskjell i den positive uttrykk andel.
Flowcytometri (FCM) ble brukt til å påvise membran uttrykk for CXCR6 i lungekreftcellelinjer . Cellene i 1 x 10
5 ble tellet og fortynningsforholdet av (fykoerytrin) -CXCR6 monoklonalt antistoff og PE-Cy5-CXCR4 monoklonalt antistoff var 01:10 og 01:05, respektivt. Histogrammet viste gjennomsnittlig uttrykk andelen CXCR6 og CXCR4 i A549, H292 og 95D celler, henholdsvis. FCM bildene var representant for forsøkene. Prosentandelen av membran CXCR6-positive celler i A549, H292 og 95D var henholdsvis 56,03 ± 11,42 og 34,8 ± 6,17, 52,4 ± 5,80,. Videre er membranen ekspresjon av CXCR4 ble også observert i A549, H292 og 95D-celler på samme tid. Eksperimentene ble gjentatt tre ganger, og bildene var representative for eksperimentene. Feilfelt skildre standard feil av gjennomsnittet.
Effekter av CXCL16 på PCNA uttrykk for lungekreft cellelinjer
in vitro
Etter å identifisere den funksjonelle eksistens CXCL16 og CXCR6 i A549, 95D og H292, observerte vi videre effekten av CXCL16 stimulering på PCNA ekspresjon av disse cellene. Som vist på fig. 6, var det ingen vesentlige endringer i PCNA nivå i ulike eksperimentelle grupper (P 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen). Resultatene var svært konsekvent i tre lunge kreft cellelinjer og CXCL16-CXCR6 aksen viste ingen effekt på PCNA uttrykk for A549, 95D eller H292.
Etter sultet for 12 (100 ng /ml) eller en kombinasjon av CXCL16 med CXCL16 nøytraliserende antistoff (100 ng /ml) i anther 48 timer. Deretter ble virkningene av CXCL16 stimulering på PCNA (prolifererende cell nuclear antigen) uttrykk oppdaget av flowcytometri. Som vist på fig. 6, var det ingen vesentlige endringer i PCNA nivå i ulike eksperimentelle grupper (P 0,05, sammenlignet med kontrollgruppen). Bildene er representative for eksperimentene og resultatene var reproduserbare og konsekvent i tre lungecancercellelinjer. Feilfelt skildre standard feil av gjennomsnittet.
CXCR6 ble nedregulert av siRNA Techonology
Effektivitet av RNA interferens mot CXCR6 ble validert av western blot. Det ble vist i fig. 7 som CXCR6 protein ble uttrykt i det vesentlige A549 celler (bank-kontroll, uten noen behandling) og RNA-interferens teknologien effektivt hemmet CXCR6 ekspresjon i A549-celler. Taushet effektiviteten av CXCR6 shRNA- (2819-1) var den beste, og dermed i alle de påfølgende forsøkene brukte vi dette siRNA til taushet CXCR6 mRNA uttrykk.
For å dempe CXCR6 genuttrykk, vi transfektert A549 celler med phU6 /GFP /Neo plasmid inneholdende kort hårnål RNA (shRNA) molekyler rettet mot CXCR6, med bruk av Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Sekvensene for tre shRNA oligonukleotider var: (CXCR6-2819-1): 5′-ctGAG GAC AAT TCC AAG ACT T-3 «(sense) og 5′-AAG TCT TGG AAT TGT CCT CAG-3′ (anti-sense ); (CXCR6-2820-2) 5»-ctCAC CAT GAT TGT CTG CTA T-3 «(fornuft) og 5′-ATA GCA GAC AAT CAT GGT GAG-3′ (Anti-sense); (CXCR6-2821-1) 5»-gcTTG CTC ATC TGG GTG ATA T-3 «(sense) og 5′-ATA TCA CCC AGA TGA GCA AGC-3» (anti-sense). Effektivitet av RNA interferens mot CXCR6 ble validert av western blot. Det ble vist i fig. 7 som CXCR6 protein ble uttrykt i det vesentlige A549 celler (bank-kontroll, uten noen behandling) og RNA-interferens teknologien effektivt hemmet CXCR6 ekspresjon i A549-celler. Felt 1: Blank-kontroll; Felt 2: RNA-kontroll; Lane 3: CXCR6 shRNA- (2821-1); Felt 4: CXCR6 shRNA- (2820-2); Lane. 5: CXCR6 shRNA- (2819-1)
Effekter av CXCL16-CXCR6 på A549 Celleviabilitet
in vitro
MTT analyseresultatene i fig. 8 viste at det ikke var noen forskjell på
in vitro
levedyktighet mellom blank-kontroll og shRNA-kontroll. Men sammenlignet med den blanke-kontroll, levedyktigheten av A549 celler fra CXCR6-shRNA (2819-1) grupper betydelig redusert med den forlengelse av kulturen tid (sammenlignet med kontroll, P 0,01 ved 72, 96 og 120 timer) . Videre human rekombinant CXCL16 var i stand til å øke
in vitro
levedyktighet av A549 celler fra emnet kontroll og shRNA-kontroll (sammenlignet med kontroll, P 0,01), mens hadde ingen effekt på levedyktigheten A549 celler fra CXCR6 nedregulert gruppe (sammenlignet med kontroll, P 0,05).
MTT-analysen ble brukt til å evaluere effektene av CXCL16-CXCR6 på cellelevedyktighet
in vitro
.
