Abstract
Formålet med dette arbeidet var å avdekke de metabolske funksjoner i mitokondriene som kan være avgjørende for hemming av apoptotisk potensial i prostatakreftceller. Vi studerte mitokondrier isolert fra normale prostata epitelceller (PREC), metastatisk prostatakreft cellelinjer LNCaP, PC-3, DU145; og ikke-prostata kreft celler – menneskelige fibrosarkom HT1080 celler; og normale menneskelige lymfoblastoide celler. Prec celler inneholdt to til fire ganger mindre mitokondrier per gram av celler enn de tre PC-cellelinjer. Luftveis aktiviteter PREC celle mitokondrier var 5-20 ganger lavere enn PC-mitokondriene, avhengig av underlag og metabolske tilstand, på grunn av lavere innhold og lavere aktivitet i åndedrettsenzymkomplekser. Mitokondrier fra de tre metastatisk prostatakreft cellelinjer avdekket flere funksjoner som er karakteristiske bare til disse cellene: lav affinitet Complex jeg for NADH, 20-30 mV høyere elektrisk membranpotensialet (ΔΨ). Ubeskyttet med ciklosporin A (CsA) PC-3 mitochondria kreves 4 ganger mer Ca
2+ å åpne permeabilitet overgangen pore (MPTP) sammenlignet med PREC mitokondriene, og de ikke gjennomgår hevelse selv i nærvær av alamethicin en stor poredannende antibiotikum. I nærvær av CsA, gjorde PC-tre mitokondriene ikke åpne spontant MPTP. Vi konkluderer med at den lave apoptotiske potensialet i de metastatiske PC cellene kan oppstå fra hemming av Ca
2 + -avhengig permeabilitet overgang på grunn av en svært høy ΔΨ og høyere kapasitet til å beslaglegge Ca
2+. Vi foreslår at på grunn av den høye ΔΨ, er mitokondrielle metabolismen av metastatiske prostata kreft celler hovedsakelig basert på utnyttelse av glutamat og glutamin, som kan fremme utvikling av kakeksi
Citation. Panov A, Orynbayeva Z (2013) bioenergetisk og Antiapoptotic Egenskaper av Mitokondrier fra dyrkede humane Prostate Cancer Cell Lines PC-3, DU145 og LNCaP. PLoS ONE åtte (8): e72078. doi: 10,1371 /journal.pone.0072078
Redaktør: Daotai Nie, Southern Illinois University School of Medicine, USA
mottatt: 14 februar 2013; Godkjent: 05.07.2013; Publisert: 08.08.2013
Copyright: © 2013 Panov et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Grant National Institutes of Health CA69764 (til JA Petros), Emory University Trust for urologiske forskning. Cornelius F. J. Beukenkamp Endowment for Prostate Cancer Research. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er den viktigste årsaken til mannlig kreftdød i aldersspennet 55-74, og over 75 år er det den nest største dødsårsaken i nordamerikanske menn etter lunge og bronkier kreft [1,2 ]. Hovedsak alle menn med avansert sykdom, som gikk gjennom androgen deprivasjon terapi, til slutt dør på grunn av utviklingen av androgen-uavhengig metastatisk prostatakreft [1,3,4]. Den høye dødeligheten av prostatakreft er assosiert med aktiv spredning av prostata adenokarsinom som formidler til fjerne organer med preferanser til benvev [5]. Det er en stor mengde data som viser at utviklingen av både primære og metastatiske prostatatumorer bestemmes av tap av cellens apoptotiske potensial [6-8].
Deltakelse av mitokondrier i apoptose har blitt bekreftet av et stort antall rapporter som beskriver proapoptotiske mitokondrielle endringer, for eksempel produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), nedbrytning av ATP, og induksjon av mitokondriell permeabilitet overgangen pore (MPTP) [9-11]. Det er blitt vist at Bcl-2 og andre apoptose regulerende proteiner av denne familien er plassert på mitokondrie forbindelses områder av de indre og ytre membraner eller den intermembrane plass og regulere apoptose gjennom deres effekt på mitokondrie permeabilitet overgang [12-15]. Studier av forholdet mellom induksjon av apoptose i prostatakreftceller og ekspresjon av Bcl-2 og Bax-beslektede proteiner ga motstridende resultater [16-21], og dataene antyder at Bcl-2, Bcl-XL og noen andre apoptose-relaterte proteiner er ikke viktig for induksjon av apoptose i prostatakreftceller [18,19,22-24]. På den annen side åpningen av permeabiliteten overgangs pore er direkte avhengig av mitokondrielle egenskaper slik som elektriske membranpotensialet (ΔΨ), produksjon av ROS [25], og respiratoriske aktivitet [26-28]. Derfor er det viktig å forstå biokjemiske og fysiologiske aspekter av mitokondrie funksjonalitet som en sentral gate-keeper i manglende evne til prostata kreft celler til å forplikte seg til programmert celledød.
Mens det er mange rapporter om apoptoseinduksjon i prostata celler via modulerende mitokondrie metabolisme [29-31], samlet ikke mye er kjent om bioenergi og mitokondrie funksjoner av normale eller kreftprostataceller, med unntak av forskjeller i deres metabolisms sitronsyre [32] og mitokondrie L-laktat [33]. Det har vist seg at i motsetning til de fleste ondartede vev, er prostatatumorceller kjennetegnet ved en lav hastighet på glykolyse og glukoseopptak [34,35], og ved preferensiell opptaket av fettsyrer i løpet av glukose [36]. Den høye biokjemiske plastisitet av prostatakreftceller hjelper dem til å tilpasse sin metabolisme til vanlig svulst hypoksisk tilstand [37]. Men i mange av disse studiene på mitokondrie metabolisme i prostatakreftceller, forfatterne brukte antibiotika [29,31,36-38]. Det er kjent at aminoglykosidantibiotika (streptomycin, gentamycin) er mitotoxic [39-41]. Vi har fastslått at mitokondriene isolert fra prostatakreftceller, humane lymfoblastoid-celler og hepatocytter dyrket i nærvær av streptomycin ikke puste på alle substrater. Således celler i kulturer inneholdende antibiotika ikke opprettholde aerob metabolisme, og glykolyse er den eneste kilde til ATP. Derfor mange konklusjoner innhentet på cellekulturer med antibiotika har å betrakte med forsiktighet.
Tidlige studier på ultramicroscopic strukturen i normale og kreft prostata celler har indikert at prostatakreftceller viser en påfallende økning i antall og pleomorphism av mitokondrier [42]. Dette skiller prostatakreft fra andre krefttyper hvor malign transformasjon er vanligvis ledsaget av en betydelig reduksjon i cellens mitokondrier [43].
I normal prostata, epitelceller utskiller et høyt nivå av citrat sannsynligvis på grunn av deres relative manglende evne til å oksidere citrate via Krebs syklus [32,44]. Prostata citrate nivåene øker ytterligere i benign hyperplasi av prostata, men falle kraftig i løpet av utviklingen av prostatakreft, antagelig fordi kreft mitokondrier skaffe kapasitet til å oksidere citrate [32]. Dette metabolsk egenskap av prostatakreft mitokondrier er det motsatte av det som ble observert for mange hurtigvoksende kreftformer, der Krebs syklus bytter fra citrate utnyttelse til citrate produksjon, noe som resulterer i økt kolesterol produksjon [45].
Bidraget av energiomsetningen i kreftutvikling og progresjon har blitt rapportert i en rekke verker [44,46,47]. Det antas at for å lage anticancerterapi cancer-spesifikk, bioenergetisk metabolske funksjonene til hver tumortype må først bli belyst. De endringer i bioenergetisk funksjoner av humane prostatacancer LNCaP, DU145 og PC-3-celler har vist seg å være relatert til dysfunksjoner mitokondrielle [38], mens de detaljerte mekanismer av mitokondriell patologi forblir usikker. Hensikten med denne studien var å belyse disse metabolske funksjonene til mitokondrier som kan bidra til hemming av apoptose i prostatakreftceller. På grunn av kjente ekstraordinære heterogenitet av prostatakreft vi undersøkte mitokondrie bioenergetisk egenskapene til tre prostata kreft cellelinjer, nemlig PC-3, LNCaP og DU145, ulik i sin opprinnelse, tumorigenitet, respons på androgener, og spredning priser [38,43,48 , 49]. Til sammenligning studerte vi mitokondrier fra de dyrkede normale humane prostata epitelceller (prec). Alle disse cellelinjene er tilnærmet unstudied i form av mitokondrie funksjoner. For sammenligningens skyld, vi studerte også en ikke-prostata human fibrosarkom cellelinje HT1080. EBV-transform normale menneskelige lymfoblastoide celler (HLB) fungerte som en referanse til hvordan mitokondriene fra dyrkede normale celler svare på Ca
2 + last og ciklosporin A.
Dette er den første gransking av bioenergetisk egenskaper og Ca
2 + -avhengig permeabilitet overgang av isolerte mitokondrier fra de etablerte prostatakreftcellelinjer og normale menneskelige prec celler. Vi rapporterer her at mitokondrier fra de tre pasienter med metastatisk prostata kreft-cellelinjer har en rekke forskjellige metabolske funksjoner: en 20 til 30 mV høyere elektrisk membranpotensialet (ΔΨ), lav affinitet for komplekset I til NADH, høyere motstand til Ca
2 + belastninger, og en uvanlig reaksjon til cyklosporin A og den poredannende antibiotikum Alamethicin, sammenlignet med den normale Prec og HLB-mitochondria. De observerte trekk ved prostatakreft mitokondriene kan beskytte prostata kreft celler fra apoptose ved direkte og indirekte hemming av mitokondriell permeabilitet overgang.
Resultater
MITOKONDRIELLE avkastning
Figur 1 viser utbyttene av mitokondriene isolert fra cellene under studien. I sammenligning med PC-3, DU145 og LNCaP prostata kreft celler, normal prostata PREC celler ga Tilsvarende 2,1, 2,3 og 4,6 ganger mindre mitokondrier per gram av celler. De høyeste utbytter blant prostatakreftceller ble oppnådd med LNCaP-celler, og også med fibrosarkom celler (HT1080C) og normale humane lymfoblastoide celler (HLB). Utbyttene var helt konsistent for en gitt cellelinje, men varierte mellom cellelinjer [50].
Mitokondrier ble fremstilt som beskrevet i Metoder. Resultatene er presentert som gjennomsnitt ± SE, n = 5-7 (separat isoleringer fra celler). Verdier er uttrykt som mg protein pr mitokondrie 1 gram våte celler. Statistikk: **
p
0,05; ***
p
0,001. Verdier for prostata kreft celler PC-3, ble DU145 og LNCaP sammenlignet med normale prostataceller PREC.
Luftveis aktiviteter mitochondria isolert fra de dyrkede celler
Figur 2 viser respiratoriske aktiviteter mitokondriene i ulike metabolske tilstander. På grunn av den begrensede utbytte av mitokondrier fra dyrkede celler, særlig fra de normale PREC celler, begrenset vi valg av underlag til succinate, glutamat + malat, og citrate + Malate. Citrate ble valgt på grunn av den slående forskjeller i citrate metabolismen i normale og maligne prostatavevet (32,44). Suksinat oksidering er et alternativ til den NAD-avhengige substrater kilde for elektroner. Oksidasjon av glutamat + malat gir elektroner for Complex jeg, men også kan gjenspeile funksjon av Krebs syklus i delt modus. I tillegg, i de innledende eksperimenter har vi funnet ut at prostatakreft mitokondriene oksidert glutamat + malat til vesentlig høyere priser enn pyruvat + malat.
Inkuberingsbetingelsene er beskrevet i metoder. Underlag: succinate 10 mm; glutamat 10 mm + malat 2 mm; citrate 10 mm + malat 2 mm. Oksidativ fosforylering (tilstand 3) respirasjon ble stimulert ved tilsetning av 150 uM ADP; frikoblet respirasjon (State 3U) ble stimulert ved tilsetting av 0,5 mikrometer cyanide-
m
-chlorophenylhydrazone (CCCP). Luftveis kontroller ble beregnet som prosenter av staten tre respirasjonsfrekvensen til respirasjon i State 4
0 (før tillegg av ADP).
Med succinate og glutamat + malat, åndedretts aktiviteter av mitokondrier fra tre PC celletyper under studien var manifold høyere i alle metabolske tilstander, sammenlignet med mitokondrier fra normale PREC celler (figur 2).
i noen grad effektiviteten i mitokondrie oksidativ fosforylering kan vurderes av luftkontrollforhold (RCR), som er beregnet som forholdet mellom lufthastigheten i tilstand 3 (oksidativ fosforylering) for lufthastigheten i tilstand 4 (hvilende respirasjon). Men absolutte priser åndedrett ved Statens 4 og State 3, er også svært viktig for å forstå mitokondrie energetics. Vanligvis, i mitokondriene fra normale vev isolert i nærvær av bovint serumalbumin, RCRs verdiene er høyere med NAD-avhengige substrater enn med succinat [51].
Samlet dataene presentert i Figur 2 viser klart at vanlige Prec mitokondrier avvike betydelig fra prostata kreftceller mitokondriene, så vel som fra de normale og maligne ikke-prostataceller. Figur 1 og 2 viser at kreft transformasjon av normale prostata vev celler ble fulgt av flere gangers økning i innholdet av mitokondrier per celle og mange gangers økning i mitokondrie respiratorisk aktivitet.
Når normal eller prostatakreft celle mitokondrier oksidert succinate, tilsetning av ADP eller en uncoupler (CCCP) produsert luftveiene priser høyere enn de tilsvarende priser for NAD-avhengige underlag (figur 2). Således er de lave priser i staten 3 oksydasjon av glutamat og citrat i kreft mitokondriene var ikke forårsaket av lav aktivitet av ATP /ADP bærer, ATP-syntetase, eller aktivitetene av komplekser III og IV, men snarere ved lav aktivitet av komplekset I (NADH dehydrogenase).
Elektrisk membran potensialene av mitokondrier fra prostata og ikke-prostata celler
Høye mitokondrie membran potensialene i carcinoma celler, inkludert prostata kreft celler, sammenlignet med normale epitelceller, har blitt rapportert i flere studier [52]. Men de fleste av disse data innhentet med fluorescerende kationiske fargestoffer (Rhodamine 123, JC-1, etc.) som gir bare en kvalitativ vurdering av ΔΨ, og noen ganger feilaktige resultater. Fallgrubene fluorescerende metoder for evaluering av mitokondrie aktivisering i cellene er blitt diskutert i litteraturen [53,54]. Med isolerte mitokondrier, brukte vi en TPP
+ – sensitive elektrode som gjør det mulig kvantitativt vurdere ΔΨ verdier for membran potensialer høyere enn -100 mV [55]
Figur 3 rapporter de ΔΨ verdier for mitokondriene isolerte. fra de cellelinjer som ble studert. Disse verdier ble beregnet ved bruk av korrigeringer for binding av TPP
+ til den indre membran og matriks (IBC, indre bindingskonstant) beregnet i henhold til [56], og forutsatt at matrisen volum på 1 ul pr 1 mg av mitokondrie protein. Figur 3 viser at ΔΨ verdiene for prostatakreft mitokondriene var 20 til 30 mV høyere enn de som er beregnet for Prec celler, og for de ikke-prostata cancer HT1080C celler, hvor det fluorescerende fargestoff metoden viste høyere enn normalt membranpotensialet [52] . Viktigere, høy ΔΨ i prostatakreft (PC) celle mitokondrier ble ikke observert i cellene, som ble høstet fra kulturflasker som nådde omtrent 80-90% konfluens. Mitokondrier fra nesten konfluente kulturer av PC cellene hadde ΔΨ under -150 mV. Kvalitativt lignende resultater ble oppnådd med den dyrkede PC-3-celler ved 60% og 90% konfluens, når cellene ble farget med mitokondrienes-spesifikke fluorescerende fargestoffer med forskjellig affinitet for strømførende mitokondrier (data er ikke vist).
Inkuberingsbetingelsene og beregning av ΔΨ som -mV er beskrevet i metoder. Verdier er uttrykt som Mean (-mV) ± SE. Statistikk: **
p
0,05; ***
p
0,001. Verdier for prostata kreft celler PC-3, ble DU145 og LNCaP sammenlignet med normale prostataceller PREC.
Kinetic egenskaper Complex jeg i submitochondrial partikler (SMP)
For å finne ut hvorfor den isolerte mitokondrier PC cellen viste forholdsvis lav aktivitet med NAD substratet (glutamat + malat, citrat + malat) sammenlignet med suksinat, studerte vi de kinetiske egenskaper av komplekset I. analysen av kompleks i involverer NADH som elektrondonor og en hensiktsmessig kunstig elektronakseptor. Så langt, seks-decyl ubiquinone (DB) er den beste og mest brukte elektronakseptor [57]. NADH dehydrogenase-komplekset består av 46 subenheter som er organisert i L-formet struktur, med det hydrofobe domene innebygd i den indre membran, og det hydrofile «arm» stikker inn i matrisen plass, og som har bindingsseter for NADH [58]. Den hydrofobe domenet omfatter alle 7 mitokondrie-DNA (mtDNA) kodet subenheter som inneholder koenzym Q bindingsdomene av Complex jeg i kreft og ikke-kreft SMP. Først, beregnet vi den optimale konsentrasjonen av DB for hver type av mitokondrier. For dette titreres DB, i nærvær av overskudd av NADH (figur 4 A, B), og deretter titreres NADH i nærvær av en optimal konsentrasjon av DB for bestemmelse av Michaelis-konstantene (Km) for NADH (figur 5).
Inkuberingsbetingelsene er beskrevet i metoder. SMP (0,15 mg) ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av DB i 5 min ved
oC 30; Reaksjonen ble startet ved tilsetning av 1 mM NADH
Panel A:.. hastigheten DB reduksjon av SMP fra LNCaP (■), PC-3 (●) og DU145 (▲) celler
Panel B:. frekvensen av DB reduksjon av SMP fra PREC (■), HLB (▲), og HFS (●) celler
Inkuberingsbetingelsene som i figur 2.
for LNCaP og PC-3 og til en viss grad for DU145 prostatakreft cellelinjer, aktiviteter Complex jeg, målt som frekvensen av reduksjon av DB, var høye og viste en påfallende smalt DB konsentrasjonsområde for maksimal hastighet NADH oksidasjon (Figur 4A). I motsetning Complex Jeg aktivitet SMP fra PREC, HFS, og HLB celler, var lavere og viste en ganske bredt spekter av DB konsentrasjoner som gir maksimal aktiviteter, selv om aktivitetene selv avvek betydelig (figur 4A, B). SMP fra PREC og HFS celler viste svært lave Complex I konkrete aktiviteter i forhold til SMP fra HLB og PC-celler mitokondriene. De store forskjellene i svarene til endringer i DB konsentrasjon mellom PC celle mitokondriene (Figur 4A) og normale PREC celler og de ikke-prostata celler (figur 4B) kan gi en indikasjon på forskjeller i lipid-protein interaksjoner i mitokondrie membraner, som kan være ansvarlig for den uvanlige manglende respons på PC celle mitokondrier ved tillegg Alamethicin, en pore forming peptid (se figur 6).
Inkuberingsbetingelsene (Medium B) sukrose 210 mm, KCl 20 mM, glycyl-glycin 3 mM, pH 7,2, KH
2PO
4 1 mM, succinat 10 mM, mitokondrier 0,5 mg, sluttvolum 1,0 ml. Mitokondrie hevelse ble registrert som optisk tetthet (OD) ved 520 nm ved hjelp Shimadzu Multispec-1501 modell spektrofotometer. Tilsetninger: Ca
2 + 50 nmol /ml, alamethicin 4 ug /ml
Figur 5 viser et representativt eksperiment av målinger av den komplekse i kinetiske parametere for oksydasjon av NADH i nærvær av. den optimale DB konsentrasjon som er vist i figur 4. det var signifikante forskjeller mellom SMP fra PC-celler og andre cellelinjer. SMP fra de tre prostatakreft cellelinjer hadde lignende, relativt lav affinitet for NADH (K
M
NADH = 20 + 2,5 mm). Til sammenligning viser slektskap til NADH var tilsvarende 5, 4, og 11 ganger høyere enn med SMP fra PREC (K
M
NADH = 4 + 0,5 mm), HT1080C (K
M
NADH = 5 + 2 mm), og HLB (K
M
NADH = 1,8 + 0,1 mikrometer) celler. Den lave affinitet for NADH kunne forklare til en viss grad de forholdsvis lave priser i staten 3 oksidasjon av NAD-avhengige substrater av PC-celler mitochondria (se figur 2).
Verdiene for V
MAX for NADH oksidasjon av Complex jeg var også påfallende forskjellig mellom SMP fra prostata kreft celler og prec celler. V
MAX skyldes i stor grad den mengde av et enzym til stede i systemet som studeres [59]. V
MAX verdier for komplekset jeg var 0,3 til 0,45 mM DB redusert /min /mg protein for prostata kreft celler, og 0,028 mM DB redusert /min /mg protein for PREC SMP, en 10 til 16-fold forskjell. Dermed Prec celler ikke bare hadde færre mitokondrier, men mitokondriene hadde også mye lavere innhold av Complex jeg per mitokondrie enn mitokondriene fra metastatiske prostata kreft celler.
Ca
2 + indusert permeabilitet overgangs av PC- 3 og HLB mitokondrier
i lang tid, det meste av vår kunnskap om Ca
2 + -avhengig permeabilitet overgang av mitokondrier var basert nesten utelukkende på eksperimenter med rottelever mitokondriene (RLM) [60] . Stor amplitude osmotisk svelling av RLM ble betraktet som en klassisk manifestasjon av permeabiliteten overgang poreåpning indusert av kalsium i nærvær av uorganisk fosfat (Capi) (se figur 6). Men vi fant at i motsetning til RLM, kan mitokondrier fra andre vev ikke gjennomgå hevelse [28], og selv depolarisering av mitokondrier i løpet av kalsium deponering er ikke tegn på permeabilitet overgang [50]. Vi viser at mitokondrier fra HLB og PC-3-celler ikke undergå stor amplitude svellende i løpet av Ca
2+ belastning (figur 6). HLB mitokondrier fikk gjennomgå svelling ved tilsetning av alamethicin, en bakteriell ikke-spesifikk poredannende antibiotikum, mens alamethicin var ikke effektiv med PC-3 mitochondria (figur 6). Således stor amplitude svelling av mitokondriene kan ikke brukes med HLB og PC-3 mitokondrier som en indikasjon av åpning av permeabiliteten overgang pore. Derfor brukte vi andre metoder for å registrere permeabilitet overgang i disse mitokondriene.
Som nevnt i metoder, har vi begrenset analysen av permeabilitet overgang til mitokondriene fra HLB celler som kan dyrkes i de roterende flasker, og Prec og PC-3 celler som kan høstes uten behandling av celler med en protease. Grunnen til dette ligger i vår observasjon at behandling av et vev (skjelettmuskel, hjertemuskel, lever) før homogenisering, eller isolerte mitokondrier med Nagarase eller Tripsin betydelig økt mitokondrielle kalsium oppbevaring kapasitet (Panov A, upubliserte data).
Figurene 7 og 8 viser endringer i membranpotensial og mediets pH-verdi under gradvis Ca
2+ lasting av den ubeskyttede HLB og PC-3 mitokondrier oksiderende succinat (figur 7), og mitokondriene beskyttet av 0,5 uM cyclosporin A (Figur 8). Som mitokondrier forbruke lagt Ca
2+ via electrogenic kalsium uniporter, den ΔΨ falt, og ble deretter gjenopprettet til opprinnelig nivå. Ettersom flere og flere Ca
2+ tilsatt, electrogenic sykling av kalsium også økt, og dette var ansvarlig for gradvis nedgang i ΔΨ. Når mitokondrie permeabilitet overgangen pore (MPTP) åpnet, ΔΨ kollapset nesten umiddelbart med HLB mitokondrier og veldig sakte med PC-3 celle mitokondriene. PH metode for registrering av Ca
2+ forbruket av mitokondrier gjør nøyaktig registrering av øyeblikk av MPTP åpningen. PH-metoden er den mest pålitelige for kvantitativ evaluering av mengden av Ca
2+ forbrukes av mitokondriene før permeabiliteten overgang inntreffer – kalsium retensjonskapasiteten (CRC) [28,50]. Når MPTP ble åpnet, ble det alkalisering av inkubasjonsmediet forbundet med dissosiering av kalsium-trifosfat (Ca
3 (PO
4)
2) i matrisen, og binding av H
+ til den frigjorte PO
4
3 anion å danne HPO
4
2 og H
2PO
4
– anioner i samsvar med buffer pH [28,61]. Således alkalisering av mediet utvetydig angir tidspunktet for PTP åpningen. Vi har gjennomført samtidige målinger av ΔΨ og pH. Det bør imidlertid tas i betraktning at depolarisering av mitokondrier ikke er alltid forbundet med åpningen av MPTP, mens åpning av MPTP alltid resulterer i sammenbrudd av ΔΨ [50,60]. Dette er illustrert i figurene 7 og 8. I forsøket med HLB mitokondrier (figur 7), øyeblikkelig depolarisering av mitokondrier og alkalisering av mediet inntraff nesten samtidig på grunn av åpningen av den storporede.
(A) menneske~~POS=TRUNC lymphoblast mitokondrier. (B) Mitokondrier fra PC-3 prostatakreftceller. Tillegg: TPP
+ ble lagt i 0,5 mikrometer porsjoner, sluttkonsentrasjon 1,5 mikrometer; Ca
2 + 20 nmol /ml HCl 125 nmol /ml forårsaket ΔpH på 0,07.
(A) Menneskelige lymphoblast mitokondriene. (B) Mitokondrier fra PC-3 prostatakreftceller. Inkuberingsbetingelser som i figur 8, bortsett fra at 0,5 pM CsA var til stede. Tillegg: TPP
+ ble lagt i 0,5 mikrometer porsjoner, sluttkonsentrasjon 1,5 mikrometer; Ca
2 + 20 nmol /ml, CCCP 0,5 mikrometer, HCl 125 nmol /ml forårsaket ΔpH på 0,07.
Figur 8 viser svarene på Ca
2+ av HLB (Figur 8A) og PC-3 (figur 8B) mitokondrier behandlet med ciklosporin A (CsA). CsA er den kraftigste kjente inhibitor av permeabilitet overgang. Normalt CsA forsinker sterkt angrep av MPT, men forhindrer ikke det, som vist i tilfellet med mitokondrier fra HLB (sammenlign figur 7A og 8A) når CsA økte CRC1.5 fold. Det var imidlertid ikke mulig å indusere MPTP åpning av kalsium lasting av PC-3 mitokondrier beskyttet med CsA (figur 8B). Gradvis nedgang av signalet fra TPP
+ – følsomme elektrode mer sannsynlig reflekterte forskyvningen av TPP
+ fra matrisen ved å akkumulere kalsium-fosfat-salter, og ikke sann depolarisering [28]. PH spor, vist i figur 8B, viser at i motsetning til mitokondrier fra HLB, PC-3 mitokondrier i nærvær av CsA ekstruderte protoner ujevnt, med varierende H
+ /Ca
2+ forholdstall. I sammenligning med den ubeskyttede mitokondriene, i nærvær av CsA PC-3 mitokondrier var i stand til å forbruke meget stor mengde kalsium uten å åpne MPTP. Vi kunne aktivere Ca
2+ frigjøring og åpning av MPTP bare ved tilsetning av CCCP, en protonophore som stimulerer mitokondrie depolarisering. Før tilsetningen av CCCP, PC-3 mitokondrier var i stand til å forbruke nesten 5 ganger mer Ca
2+ i nærvær av CsA (figur 8B), enn i kontrollforsøk (figur 7B). Således eksperimenter vist i figurene 7 og 8 viser at PC-3 mitokondriene unormale egenskaper av Ca
2 + -indusert permeabilitet overgang. Med Prec mitokondriene, i nærvær av CsA økt CRC fra 20 til bare 40 nmol Ca
2 + /mg protein (figur 9).
Inkuberingsbetingelsene som i figurene 7-8. Grey barer – ubeskyttede mitokondriene oksiderende succinate, mørke barer -mitochondria beskyttet av Cyclosporin A 0,5 mikrometer + oligomycin 2 mikrogram /ml + ADP 50 mikrometer. Dataene er M ± standardfeil beregnes fra 3 separate isoleringer av mitokondrier. Data er uttrykt som nanomol Ca
2 + /mg mitokondrie protein. Statistikk: *
p
0,1; ***
p
0,001. Dataene for beskyttet av CsA mitokondriene ble sammenlignet med tilsvarende ubeskyttede mitokondriene. Dataene for PC-3 celle mitokondrier ble sammenlignet med de for PREC celle mitokondriene.
Figur 9 sammenligner kalsium oppbevaring kapasiteter på mitokondrier fra normal prostata PREC celler, normale HLB celler og prostata kreft PC-3-celler oksiderende succinat i fravær og i nærvær av cyklosporin A. Vi har vist tidligere at CRC av mitokondriene isolert fra de tilsvarende cellelinjer, men som stammer fra forskjellige individer, varieres betydelig [50]. Derfor kan svarene på Ca
2 + og CsA av mitokondrier fra forskjellige cellelinjer vurderes kun kvalitativt. Figur 9 viser at ubeskyttet Prec mitokondrier, hadde ubetydelig evne til å holde Ca
2 + (omtrent 20 nmol Ca
2 + /mg protein), mens PC-3 mitokondrier hadde en fire ganger høyere motstand mot kalsium belastninger. I mitokondrier beskyttet med CsA, CRC for PREC mitokondrier økte to ganger, for HLB mitokondrier CRC økt med 50%, mens for PC-tre mitokondrier CRC økt nesten fem ganger og var ni ganger høyere enn for prec mitokondrier. Viktigere, i motsetning mitokondrier fra PREC og HLB celler, CSA-beskyttet PC-3 mitokondriene åpnet ikke spontant permeabilitet overgang pore, men bare etter tilsetning av protonophore CCCP.
Diskusjoner
kreft og ikke-kreftceller brukt i denne studien stammer fra forskjellige vev og enkeltpersoner [38,43,48,49]. Ulikheter i kulturbetingelser kan også bidra til de observerte forskjellene i de metabolske parametre for cellene. Tidligere er det funnet at mitokondrier fra den samme celletype, nemlig humane lymfoblastoide celler (HLBM), oppnådd fra forskjellige individer hadde kvantitativt forskjellige utbytter per 1 gram celler, respiratoriske aktivitet og kapasitet til å beslaglegge kalsiumfosfat [50]. Kvalitativt normal HLBM var lik hverandre og adskilt fra HLBM fra pasienter med Huntingtons sykdom [50]. HLBM fra Huntingtons sykdom pasientene hadde også kvantitative ulikheter i respirasjonsmålinger og kalsium oppbevaring kapasiteter, men kvalitativt de var unikt ligner hverandre [50]. Det var ingen mulighet og sans for statistisk sammenligning av HLBM fra normale individer og pasienter med Huntingtons sykdom. Derfor tolkning av data når man sammenligner celler av ulike genetiske bakgrunn og kultur forhold bør gjøres med forsiktighet og i stor grad basert på kvalitative egenskaper. Kvantitative sammenligninger kan gjøres kun innenfor samme cellelinje.
Diskusjonen av resultatene som presenteres i denne artikkelen, med hensyn til artikler publisert på kreft energistoffskiftet tema, vil være relativt begrenset. For det første, dette arbeidet så langt er den eneste utført på mitokondriene isolert fra normale og prostata kreft cellelinjer; og for det andre, vi vurderte det vanskelig å diskutere en rekke publikasjoner om metabolske egenskaper og rollene til mitokondriene i prostata kreft celler dyrket i nærvær av antibiotika [21,23,36-38]. Aminoglykosidantibiotika (streptomycin, gentamicin) er giftig for mitochondria på flere måter [39-41,62]. Vi gjentatte ganger observert at mitokondriene isolert fra celler dyrket i nærvær av antibiotika (penicillin og streptomycin) ikke puste på en hvilken som helst substrat. Higgins et al. [38] dyrkede PC-3, LNCaP og DU145-celler i nærvær av 1% penicillin-streptomycin og konkluderte med at mitokondrier i disse cellene var dysfunksjonell.
