Abstract
Cervical kreft celler viser en økt krav til ubiquitin-avhengige protein degradering assosiert med en forhøyet stoffskifte omløpshastighet, og for spesifikke signalveier, spesielt HPV E6-målrettet degradering av p53 og PDZ proteiner. Naturlige forbindelser med antioksidant egenskaper, inkludert flavonoider og triterpenoids holde løftet som cytostatika ved å forstyrre ubiquitin-avhengige protein degradering. En økende mengde av bevis indikerer at deres α-β umettet karbonyl system er molekyl determinant for inhibering av ubiquitin-formidlet proteindegradering oppstrøms av de katalytiske områder av 20S proteasomet. Heri Vi rapporterer identifikasjon og karakterisering av en ny klasse av chalcone basert, potente og cellepermeable kjemiske inhibitorer av ubiquitin-avhengig protein nedbrytning, og en blyforbindelse RAMB1. RAMB1 hemmer ubiquitin-avhengig protein nedbrytning uten å svekke de katalytiske aktiviteter av 20S proteasomet, en mekanisme som er forskjellig fra bortezomib. Behandling av livmorhalskreftceller med RAMB1 utløser utfoldet protein reaksjoner, inkludert aggresome formasjon og HSP90 stabilisering, og øker p53 steady state nivåer. RAMB1 behandling resulterer i aktivering av lysosomale avhengig degraderingsreaksjonsveier som en mekanisme for å kompensere for økende nivåer av poly-ubikvitin-anriket toksiske aggregater. Viktigere, RAMB1 synergi utløser celledød av livmorhalskreftceller når det kombineres med lysosome inhibitor Chloroquine
Citation. Anchoori RK, Khan SR, Sueblinvong T, Felthauser A, Iizuka Y, Gavioli R, et al. (2011) understreker Ubiquitin-Proteasome System uten 20S proteolvtiske Hemming Selektivt Kills livmorhalskreftceller. PLoS ONE 6 (8): e23888. doi: 10,1371 /journal.pone.0023888
Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA
mottatt: 30 juni 2011; Godkjent: 29 juli 2011; Publisert: 31 august 2011
Copyright: © 2011 Anchoori et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health ATIP og SPORE i livmorhals~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP P50 CA098252 til SRK, RKA og RBSR og HERA foundation (Helse, Empowerment, Research, og bevissthet) og Department of Defense Ovarian Cancer Research Program (OCRP) OC093424 til MB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ubiquitin-avhengig protein degradering via ubiquitin-proteasome system (UPS) er avgjørende for reguleringen av mange cellulære prosesser, inkludert cellecyklusprogresjonen, differensiering og apoptose i både normale celler og kreftceller [1]. Avvikende ekspresjon av komponentene i UPS-systemet, inkludert ubiquitin-ligaser, de-ubiquitinating enzymer og proteasomer har blitt rapportert i flere kreftinnstillingene, inkludert kreft i livmorhalsen [1], [2], [3], noe som tyder på at for å kunne opprettholde sine høyere nivå av metabolske aktivitet kreftceller stole mer tungt på riktig funksjon av UPS i forhold til sin normale motstykke [4], [5], [6], [7]. Dermed molekyler som kan forstyrre ubiquitin-avhengige protein nedbrytning, inkludert bortezomib, viser anticancer aktivitet [5]. Humant papillomavirus (HPV) er den primære årsaken til livmorhalskreft og ansvarlig for 5% av alle krefttilfeller i verden [8]. Mens HPV-vaksiner kan være et effektivt forebyggende tiltak mot livmorhalskreft, er det i dag ingen virus-spesifikke behandlinger for det, og effekten av standard kirurgisk og chemo /radiotherapies er begrenset for avansert sykdom [9]. Ekspresjon av to virale onkogener, E6 og E7, som er nødvendig for induksjon og opprettholdelse av den transformerte fenotype [10]. E6 utøver oncoprotein dets onkogene aktivitet ved binding til E3 ubiquitin ligase E6-AP og viderekobler dens aktivitet mot p53 og andre tumor-suppressor-proteiner for deres hurtige ubiquitin-formidlet nedbrytning proteasomal [11], [12], [13]. Dette reduserer nivået av denne nøkkel cellulær cellesyklusregulator uten sin mutasjon. Derfor hypotese vi at stabilisering av p53 via hindret ubiquitin-mediert degradering vil ha terapeutisk potensial for livmorhalskreft og muligens for andre kreftformer villtype for p53.
Naturlige forbindelser av flavonoider og triterpenoids familier inkludert curcumin, Celastrol, grønn te polyfenoler og chalconer har vist seg lovende som anti-neoplastiske midler i en rekke kreft innstillinger inklusive cervical [14], tykktarm [15], [16], øsofageal [17], bukspyttkjertel [18] og prostata [19], [ ,,,0],20], [21] kreft, forbundet med pro-apoptotiske egenskaper som er forbundet med proteasomal hemming. Vi har nylig vist at chalcon-derivater inneholdende enkle aminosyre-substitusjoner i sin struktur fungerer som proteasomhemmere og at arten av den aminoacidic partiet bestemmer deres selektivitet mot de forskjellige katalytiske aktiviteter av 20S-proteasomet [14]. Men andre funn tyder på at chalkon molekyler kan inneholde innenfor deres α- umettet karbonyl system molekyl determinant for inhibering av ubiquitin-formidlet proteindegradering oppstrøms av 20S-proteosomet [22], [23], [24], [25].
Vi rapporterer for første gang at en rekke chalcone-derivater mangler aminoacidic komponenter, her kalt RAMBs, er ubiquitin-proteasome system (UPS) -stressors via hemming av ubiquitin-medierte protein degradering oppstrøms av 20S proteasomal katalytiske aktiviteter . Spesifikt våre RAMBs forbindelser som er i stand til selektiv dreping av cervikale kreftceller via akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler protein, etterfulgt av aktivering av protein utfoldete responser inkludert aggresome dannelse og HSP90 stabilisering. Videre er denne akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler ledsaget av en kompenserende aktivering av lysosom-avhengige proteindegradering, stabilisering av p53, destabilisering av cyclin D1 og utbruddet av apoptose. Våre funn tyder på at behandling Ramb forbindelse, eventuelt i kombinasjon med lysosome inhibitor Chloroquine, har løftet som ny vei for behandling av livmorhalskreft.
Materialer og metoder
Cell kultur
livmorhalskreft cellelinjer HeLa, Siha, CaSki og ME180, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i DMEM supplert med 10% føtalt bovint serum, 100 IU /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin i 5% CO
2. Keratinocytter ble oppnådd fra Invitrogen (Carlsbad, CA) og dyrket i definert keratinocyt-SFM.
Celleviabilitet assay
Cellelevedyktigheten ble bestemt ved 2,3-bis [2-metoksy-4- nitro-5-sulfofenyl] -2H- tetrazolium-5-carboxanilide indre salt (XTT) analyse (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Tyskland). -Celler sådd med en konsentrasjon på 1000 per brønn i 100 ul medium i 96-brønners plate ble behandlet med chalcon-baserte derivater ved spesifiserte konsentrasjoner. Etter de angitte perioder, ble cellene inkubert i henhold til produsentens protokoll ved XTT merking blandingen i 4 timer. Formazan fargestoff ble kvantifisert ved anvendelse av en spektrofotometrisk plateleser til å måle absorbansen ved 450 nm (ELISA-avleser 190, Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Alle forsøk ble utført in triplo.
Bestemmelse av apoptotiske celler ved flow cytometri
Induksjon av apoptose ble bestemt ved Annexin-V /7-AAD farging. Annexin-V /7-AAD farging ble gjort ved hjelp av Annexin V-PE apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen, San Diego, CA) i henhold til produsentens protokoll. I korthet, en x 10
5-celler ble resuspendert i bindingsbuffer og 5 ul av Annexin V-PE og 5 ul av 7-AAD ble deretter tilsatt til cellene, som deretter ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter, og analysert ved hjelp av strømningscytometri på et Becton Dickinson FACSCalibur. Dataanalyse ble gjort med Cellquest-programvare (Becton Dickinson Immunocytometry System, Mountain View, California).
Antistoffer og Western Blot analyse
Totalt cellulært protein (10-20 mikrogram) fra hver prøve ble separert ved hjelp av SDS-PAGE, overført til PVDF-membraner og utsatt for Western blot-analyse. Antistoffer for Western blot-analyse ble oppnådd ved hjelp av følgende kommersielle kilder: anti-ubikvitin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), anti-p53 klon DO-1 (Calbiochem, Gibbstown, NJ) anti-PARP (BD Pharmingen, San Diego , California), anti-GAPDH (Sigma, St. Louis, MO), peroksydase-bundet anti-mus-immunoglobulin G (Amersham, Piscataway, NJ) og anvendes ved den konsentrasjon som er anbefalt av produsenten. Anti-ubiquitin og anti-vimentin antistoffer for immunofluorescensanalyse ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Texas Rødt-merket geit anti-mus immunoglobulin G og Fluorescein-merket heste anti-kanin-immunoglobulin G ble oppnådd fra Molecular Probes (Carlsbad, CA) og Vector Laboratories (Burlingame, CA) henholdsvis, og ble brukt ved konsentrasjonen anbefalt av produsenten.
Cellular morfologi og immun-fluorescens analyser
En Nikon Eclipse TE 2000E invertert mikroskop ble brukt til avbildning av mobilnettet morfologi med fasekontrast og immunfluorescens. For analyse av ubiquitin og vimentin sub-cellulær lokalisering, ble kulturer av HeLa-celler dyrket som beskrevet i Lab-Tek II kamret dekkglass (Nalge Nunc International, Rochester, New York). På de angitte tidspunkter ble cellene fiksert og permeabilisert med metanol og inkubert med de angitte primære antistoffer. Fluorescerende sekundære antistoffer ble anvendt for å visualisere protein lokalisering og nukleært DNA visualisert ved 4,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) farging. Montert prøver ble sett under et Nikon Eclipse TE 2000E invertert mikroskop og bilder tatt med Spot 3.5.8 oppkjøpet programvare (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).
Måling av Proteasomal aktivitet i 20S Renset proteasomer
Celler (5 x 10
8) ble vasket i kald PBS og resuspendert i buffer inneholdende 50 mM TRIS-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl
2, 1 mM DTT (Sigma), 2 mM ATP og 250 mM sukrose. Glassperler tilsvarende volumet av cellesuspensjonen ble tilsatt, og blandingen ble vortex-omrørt i 1 minutt ved 4 ° C. Perler og cellerester ble fjernet ved 5 min sentrifugering ved 1000 g, etterfulgt av 20 min sentrifugering ved 10 000
g product: [27]. Lysates ble klarert av ultrasentrifugering for en time ved 100 000
g
, og supernatantene ble ytterligere ultrasentrifugert for 5 timer ved 100 000
g
. Proteasom-holdige pelleter ble resuspendert i 0,5 ml homogeniseringsbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM KCI, 15% glycerol]. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av BCA-protokollen (Pierce, Rockford, IL). Fluorogene substrater Suc-LLVY-AMC, Boc-LRR-AMC og Ac-YVAD-AMC ble brukt til å måle chymotryptisk-lignende, tryptiske-lignende og caspase-lignende aktiviteter, henholdsvis. Semipurified proteasomer (10 l), forhåndsbehandlet eller ikke med inhibitorer i 30 minutter ved 37 ° C, ble analysert ved 37 ° C i 45 minutter ved bruk av de forskjellige peptidsubstrater i en buffer inneholdende 50 mM TRIS-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl
2 og 1 mM DTT (sluttvolum 100 l). Reaksjonen ble stanset med 1 ml 1% SDS og fluorescens bestemt ved fluorimeter (Perkin-Elmer, Beaconsfield, UK) med eksitasjon ved 380 nm og emisjon ved 440 nm [18]. Data er uttrykt som prosent inhibering i forhold til ubehandlede proteasomal preparater.
Måling av Proteasomal aktivitet i 26S proteasomer i levende celler
Eksponensielt voksende celler (1 x 10
6) ble sådd ut i 60 mm skåler og enten uekte behandlet eller behandlet med forskjellige konsentrasjoner RAMB1 over en periode på 4 timer. Proteasomal aktivitet i cellelysater (NP-40 lyseringsbuffer: 0,1% NP-40, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 5% glycerol og 1 mM DTT) ble bestemt ved å måle rest-luminescens aktivitet etter tilsetning av Suc -LLVY-Glo ™ substrat (Promega, Madison, WI) spesifikt for chymotypsinlignende aktiviteten proteasome i henhold til produsentens anbefalinger.
analyse av 4XUbiquitin-Luciferase degron
4Xubiquitin- luciferase fusjonskonstruksjon utpekt Ub-FL og kontroll plasmid designet CMV-FL ble vennlig levert av Dr. David Piwnica-Worms (Washington University i St. Louis, Missouri) [26]. Sub-konfluente kulturer av HeLa-celler ble transfektert med plasmider DNA ved hjelp av Lipofectamine 2000 reagens (Life Technologies, Carlsbad, CA). FL og Ub-FL transfekterte HeLa-celler ble sådd på 50.000 celler /brønn i 24-brønners plater eller 200000 celler /brønn i 6-brønner platen 24 timer etter transfeksjon og inkubert med forbindelser eller bærer (DMSO) ved de doser og tider er angitt. Luciferaseaktiviteten i cellelysatet ble bestemt med en luciferase-assay kit (Promega, Madison, WI) i henhold til produsentens instruksjoner. Bilder ble kjøpt for 1 min med en Xenogen IVIS 200 (Sylinder, Hopkinton, MA). Like store områder ble analysert ved hjelp av levende bilde 2,20 software.
klonogene assay
Eksponensielt voksende Siha, CaSki og HeLa-livmorhalskreft-celler ble sådd ut på enten 1000 eller 100 celler /brønn i 6-brønners plater. Én dag etter såing, cellene ble behandlet med enten bærer alene (narr) eller RAMB1 ved de angitte doser, og inkubert ved 37 C i 5% CO
2 i 10 dager. Ved slutten av behandlingen ble mediet fjernet og cellene ble vasket med PBS før fiksering og farging av koloniene ved hjelp av en blanding av 6,0% glutaraldehyd og 0,5% krystallfiolett, som tidligere beskrevet [27]. Kolonier ble fotografert og telles ved hjelp av et Nikon Eclipse TE 2000E invertert mikroskop og bilder tatt med Spot 3.5.8 oppkjøpet programvare (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI). Alle forsøkene ble utført in triplo.
Statistisk analyse
Resultatene er rapportert som gjennomsnitt ± standardavvik (SD). Statistisk signifikans av forskjeller ble vurdert av tosidige Student
t
bruker Prism (V.5 Graphpad, San Diego, California) og Excel. Signifikansnivået ble satt til p≤0.05. Kombinasjonen indeksen (CI) for RAMB1 og klorokin ble beregnet ved hjelp av median-effekt-analyse ifølge metoden til Chou og Talaly [28]. CI 1 indikerer synergisme, CI = 1 indikerer additivity, og CI 1 indikerer antagonisme. Ytterligere regresjonsanalyser ble utført for å stabilisere estimater.
Resultater
Ramb forbindelser selektivt redusere levedyktigheten av livmorhalskreftceller uavhengig av HPV genotype
via
blokade av proteasomal degradering
flavonoider og triterpenoids familiemedlemmer, inkludert celastrol [19], resveratrol [29], [30], curcumin [17], epigallocatechin-3-gallate [20], [31], [32], [33], [ ,,,0],34] og chalconer [35], [36] utviser anti-kreft egenskaper i forbindelse med deres aktivitet som proteasomhemmere [14], [15], [16], [21]. Vi har nylig rapportert at i chalcon-baserte proteasomhemmere arten av aminosyre-delen av molekylet confers spesifisitet overfor katalytiske aktiviteter av 20S-proteasomet [14]. Basert på flere tidligere studier [22], [23], [37], hypotese vi at α-β keton system av chalconer kan representere den minste molekyl determinant for inhibering av ubiquitin-formidlet proteindegradering oppstrøms av proteasomer.
å teste denne hypotesen vi først screenet et bibliotek av chalcon-baserte derivater som bærer forskjellige substituenter på de aromatiske ringer ved siden av α-β keton system og mangler aminoacidic porsjoner, for deres cellevekst inhibitorisk kapasitet på eksponentielt voksende HPV18-positive HeLa cervical kreftcellelinje i et konsentrasjonsområde fra 100 til 0,01 uM (ikke vist). Fire Chalcone derivater, heretter betegnes RAMBs, i stand til å redusere cellenes levedyktighet av eksponentielt voksende HeLa livmorhalskreftceller på en doseavhengig måte med IC
50 verdiene 5 mikrometer, ble valgt for videre evaluering (figur 1). For å bestemme muligheten for å bruke RAMBs forbindelser for behandling av livmorhalskreft, testet vi om RAMB1-4 behandling ville spesifikt hindre celleviabilitet av livmorhalskreftceller enn normale keratinocytter og om reduksjonen i celle levedyktighet i livmorhalskreftceller er avhengig av HPV -genotype. Som vist i figur 2, produsert RAMB1 eller RAMB4 behandling en doseavhengig reduksjon i levedyktigheten til HPV16-positive Siha og Caski celler og HPV-39-positive ME180 cervikale kreftcellelinjer henholdsvis med minimale virkninger på levedyktigheten av primære humane keratinocytter og med IC
50 lik den som oppnås med HeLa. Lignende resultater med litt høyere IC
50 ble oppnådd ved bruk RAMB2 og RAMB3 (ikke vist). For å teste hvorvidt den reduksjon i cellelevedyktighet observeres i livmorhalskreft celler etter eksponering til de RAMB1-4 forbindelsene var på grunn av deres evne til å interferere med ubiquitin-formidlet proteindegradering, overvåket vi nivåene av opphopning av poly-ubiquitinmolekyler etter behandling. Nærmere bestemt HeLa-celler ble behandlet med 5 uM av RAMB1, RAMB2, RAMB3, eller RAMB4 eller 10 nM til bortezomib, og den sistnevnte blir brukt som UPS-stress positiv kontroll, over en periode på 6 timer. Som vist i figur 3 (
venstre panel
), immunoblotanalyse av ubiquitinmolekyler protein uttrykk nivåer i HeLa-celler viste et klart mønster av akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler i RAMBs-behandlede HeLa-kulturer. En semi-kvantitativ analyse av de polyubiquitinated protein nivåer viser at GAPDH-normalisert nivå av polyubiquitinated proteiner er gjennomgående høyere (opp til tre ganger) i Ramb behandlet versus mock-behandlede celler (figur 3,
panel rett
). Disse funnene antyder at reduksjonen i cellelevedyktighet observeres i livmorhalskreft cellepanel, men ikke i normale celler etter behandling RAMBs er forbundet med endringen av ubiquitin-formidlet proteindegradering og skjer uavhengig av den onkogene HPV-type.
IC
50 verdier ble bestemt ved XXT analysen. IC
50 verdi rapportert er gjennomsnitt av tre uavhengige bestemmelser.
Kulturer av HPV-transformlivmorhalskreftceller (Siha, CaSki og ME180) eller primære humane keratinocytter ble behandlet med de angitte konsentrasjoner av RAMB1 (
venstre panel
) eller RAMB4 (
høyre panel
) over en periode på 48 timer. Celleviabilitet ble bestemt av XTT analysen og plottet som en brøkdel av de ubehandlede kontrollkulturer
Venstre panel.
Immunoblot analyse av ubiquitinmolekyler i HeLa-celler etter 6 timers eksponering med eller uten 10 mikrometer RAMBs. Bortezomib ble anvendt som positiv kontroll. Lik protein lasting i hvert kjørefelt ble bekreftet ved hjelp av et antistoff mot GAPDH.
Høyre panel.
Kvantifisering av ubiquitin /GAPDH forholdstall
Ramb behandling utløser en Ubiquitin-Proteasome-System (UPS) påkjenningen respons uten å påvirke 20S Proteasome katalytiske aktiviteter
for å teste om den raske (seks timer eller mindre, upubliserte data) akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler følgende RAMBs eksponering skjer samtidig med direkte hemming av de katalytiske aktiviteter av proteasomer, vi testet for evne RAMB1 og RAMB4 (som indusert en større ansamling av polyubiquitinated protein enn de andre RAMBs, til figur 3) inhiberer spesifikke katalytiske underenhetene i 20S proteasomet. Spesielt de RAMBs ble testet for sin kapasitet til å inhibere chymotrypsin-lignende (CT-lignende), trypsin-lignende (t-lignende) og peptidylglutamyl peptid hydrolysere-lignende (PGPH-lignende) aktiviteter i 20S renset proteosomet pre-eksponert for økende doser opp til 10 uM av RAMBs i en periode på 30 minutter etter tilsetning av fluorogene substrater [38]. FDA lisensiert proteasominhibitor bortezomib ble brukt som positiv kontroll. Som vist i figur 4 profilen til proteasomhemming viser at i motsetning til bortezomib, RAMB1 og RAMB4 behandling ikke klarte å inhibere proteasomal funksjoner når de ble testet i konsentrasjoner opp til 10 uM (lignende resultater ble oppnådd med de andre forbindelser i serien, ikke vist).
Rensede 20S proteasomer ble behandlet i 30 minutter med eller uten Ramb forbindelser eller bortezomib, her brukt som positiv kontroll, ved de angitte konsentrasjoner og de spesifikke fluorogene substrat for chymotrypsin-lignende, trypsin-lignende og peptidylglutamyl peptid-hydrolignende hydrolytic proteasomer kapasiteter ble senere lagt til. Et representativt eksempel på to uavhengige eksperimenter er vist.
For å kunne vurdere om unnlatelse av å hemme proteasomal funksjon
in vitro
kan rekapitulert i intakt proteasome funnet i levende celler, vi benyttet to ulike tilnærminger. Først utnyttet vi ubiquitin-luciferase bioluminescent reporter 4XUb-FL, som motstår spalting av ubiquitin hydro [26], for å transfektere HeLa-celler. Ved hjelp av Ub-FL og FL transfekterte HeLa-celler som vi har overvåket luciferase-aktivitet etter eksponering for RAMBs over en periode på 6 timer. Som vist i figur 5
(venstre)
motsetning bortezomib eller vår nylig identifisert proteasominhibitor RA1 [14], her brukt som proteasomhemmere positive kontroller, RAMB1 eller RAMB4 behandling induserte en svakere stabilisering av Ub-FL reporter når testet ved konsentrasjoner opp til 20 uM enn sett for enten RA-1 eller bortezomib. Kvantifisering av Ub-FL /FL forholdet i mock versus RAMBs utsatt kultur er gitt i figur 5 (
midten
panel). Deretter ble den manglende hemming av 20S proteasomal aktivitet i Ramb-behandlede celler bekreftes ved å måle den resterende aktivitet i fluorogene 20S-proteosomet renset fra CaSki cervical kreft celler pre-eksponert for RAMB1 eller RAMB4 i 4 timer. Som vist i figur 5 (
høyre panel
), i motsetning til bortezomib, RAMB1 behandling ikke klarte å inhibere chymotryptisk aktiviteten av proteasomer når de ble testet i konsentrasjoner opp til 20 uM. Samlet tyder dette på at tapet av celle levedyktighet i livmorhalskreftceller følgende RAMBs eksponering skjer samtidig med opphopning av polyubiquitated proteiner uten direkte hemming av 20S proteasomal aktivitet
Venstre panel.
luciferaseaktiviteten i lysater av Ub-FL og FL-vektor-transfekterte celler enten med eller uten behandling med Ramb forbindelser eller bortezomib ble kvantifisert i Relative Lumi-nescence enheter (RLU) og uttrykt som% av kontroll. Feilfelt er standardavvik (SD) for tre uavhengige eksperimenter.
Middle panel:
Kvantifisering av Ub-FL /FL-forhold.
Høyre panel:
Luminescence aktivitet i cellelysatene stammer fra CaSki livmorhalskreftceller med eller uten Ramb eller Botezomib behandling kvantifisert i Relative Lumi-nescence enheter (RLU). *, P 0,05, **, P . 0,02
RAMB1 behandling induserer aggresome dannelse og utløser varmesjokk svar
Vi og andre har vist at hemming av ubiquitin-mediert proteindegradering via proteasomal inhibering utløser varmesjokk og utfoldete protein responser, inkludert dannelsen av cytoprotektive strukturer kalt aggresomes som en mekanisme for å kompensere for inhibering av proteasomal funksjoner og økende nivåer av UPS stress i kreftceller [4], [6], [39] . For å teste om den raske oppbyggingen av poly-ubiquitinmolekyler protein på RAMB1 behandling skjer samtidig med varmesjokk protein svar (UPR) vi overvåket protein uttrykk nivåer av HSP90 i HeLa livmorhalskreftceller eksponert for 10 mikrometer RAMB1-3 i 8 timer. Som vist i figur 6A (
venstre panel
) immunoblotanalyse av HSP90 protein ekspresjonsnivåer avslørte at en sterk mønster av akkumulering av HSP90 i RAMB1-behandlede versus mock-behandlede HeLa-cellekulturer (lignende resultater ble oppnådd med den annen derivat av serien, ikke vist). En semi kvantitativ analyse av HSP90 proteinnivåene viser at GAPDH-normaliserte nivåer av polyubiquitinated proteiner er nesten to ganger høyere hos behandlede versus ikke-behandlede celler er vist i figur 6A (
høyre panel
).
A.
Venstre panel:
immunoblot analyse av HSP90 uttrykk nivåer i HeLa livmorhalskreftceller etter 8 timer eksponering med eller uten 10 mm RAMBs behandling. Bortezomib ble anvendt som positiv kontroll. Lik protein lasting i hvert kjørefelt ble bekreftet ved hjelp av et antistoff mot GAPDH.
Høyre panel:
Kvantifisering av HSP90 /GAPDH forholdet. B. HeLa-celler ble inkubert med eller uten 5 uM RAMB1 eller 10 nM bortezomib i 18 timer før fiksering og immuno-fluorescerende farging av DNA (blå), ubiquitin (grønn) og vimentin (rød) før avbildning (60 x).
Deretter hypotese vi at akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler følgende Ramb sammensatte eksponering ville føre til aktivering av alternative kompenserende veier til ubiquitin-medierte protein degradering, spesielt for å lysosomal pathway aktivering. For å teste denne hypotesen kontrolleres vi sub-cellulære lokalisering av ubiquitin ved immunofluorescens-mikroskopi-analyse i HeLa livmorhalskreftceller eksponert for 10 uM av RAMB1. Som vist i figur 6B immunofluorescens-analyse av poly-ubiquitinmolekyler i HeLa-celler behandlet med RAMB1 avslører tilstedeværelse av vimentin-bur, ubikvitin-positive, aggresomes struktur i samsvar med den tidligere beskrevet ved behandling med bortezomib [6]. Samlet utgjør disse funnene tyder på at i RAMB1-behandlede celler akkumulering av poly-ubiquitinmolekyler resultater i lignende cellebeskyttende tiltak som hemming proteasominhiberingens katalytiske aktiviteter ved bortezomib, men skjer gjennom en mekanisme uavhengig av det.
RAMB1 behandling fører til p53 stabilisering, cyclin D1 destabilisering og utbruddet av apoptose
E6 oncoprotein av HPV utøver sin onkogene aktivitet ved å målrette p53 og andre tumor suppressor proteiner for rask ubiquitin-mediert proteasomal degradering. Dette reduserer nivået av denne nøkkel cellulær cellesyklusregulator uten mutasjon av p53. For å teste om nedskrivning av ubiquitin-medierte protein degradering følgende RAMBs behandling fører til stabilisering av p53 som et potensielt bidra mekanisme initiere celledød, undersøkte vi uttrykket nivåer av p53 følgende 6 timer eksponering for forbindelser 10 um av RAMBs. Som vist i figur 7A, er 8 timer RAMB1 eksponering i forbindelse med doseavhengig akkumulering av p53 i CaSki cervikale kreftceller sammenlignet med mock-kontroll. Viktigere, fører p53 stabilisering undertrykkelse av cyclin D1 promoter som resulterer i aktiv undertrykkelse av cyclin D1 transkripsjon [40]. For å teste om dette resulterer i reduksjon av cyclin D1 uttrykk nivåer, ble CaSki livmorhalskreftcellene utsettes for økende doser av RAMB1 over en periode på opptil 8 timer. Som vist i figur 7B
(venstre panel)
RAMB1 behandling fører tidsavhengig (
toppen
) og doseavhengig (
nederst
) reduksjon av cyclin D1 nivåer som tyder på svikt av livmorhalskreft å gå inn i S-fasen av cellesyklusen som en årsak til celletoksisitet [41]. En semi kvantitativ analyse av β-aktin-normalisert cyklin D1 nivåer er gitt i Figur 7B (
panel høyre topp og bunn
).
A. Immunoblot-analyse av p53-ekspresjon nivå på CaSki-celler behandlet med den angitte konsentrasjon av RAMB1 over en periode på 8 timer. Lik belastning blir hvert kjørefelt ble verifisert av amido svart farging. B.
Øverst til venstre panel:
immunoblotanalyse av cyclin D1 uttrykk nivå i CaSki celler med eller uten 10 mm RAMB1 for en periode inntil 8 timer. Protein lasting ble undersøkt ved bruk av et antistoff mot β-aktin.
panel Øverst til høyre:
Kvantifisering av cyclin D1 /β-actin ratio.
Nederst til venstre panel:
Immunoblot-analyse av cyclin D1 ekspresjonsnivået i CaSki-celler med eller uten RAMB1, ved den angitte konsentrasjon i en periode på 8 timer. Lik protein lasting i hver kolonne ble verifisert ved hjelp av et antistoff mot β-aktin.
panel Nederst til høyre:
Kvantifisering av cyclin D1 /β-actin ratio. C.
Venstre panel
. HeLa-celler ble behandlet med 10 pM av RAMB1 i 8 timer og analysert ved flow-cytometri etter farging for annexin V binding og 7-AAD inkorporering.
USA panel
: Immunoblot-analyse av full lengde og spaltet PARP i HeLa-celler behandlet 10 uM av RAMBs over en periode på 8 timer. Protein lasting ble vurdert ved bruk av et antistoff mot β-aktin.
Høyre panel
. Kvantifisering av spaltet PARP /β-actin ratio
For å teste om dette resulterer i reduksjon av cyclin D1 uttrykk nivåer, ble CaSki livmorhalskreftcellene utsettes for økende doser av RAMB1 over en periode på opptil 8 timer. En semi kvantitativ analyse av p-aktin-normalisert cyklin D1 nivåer er gitt i Figur 7B (
panel høyre topp og bunn
). Som vist i figur 7B
(venstre panel)
RAMB1 behandling fører til svært rask (
toppen
) og doseavhengig (
nederst
) reduksjon av cyclin D1 nivåer tyder svikt livmorhalskreft å gå inn i S-fasen av cellesyklusen kan bidra til tap av cellelevedyktighet [41].
Stabilisering av p53 likevektsnivåer og destabilisering av cyklin D1-nivåer antyder at reduksjonen i cellenes levedyktighet observert i panelet av livmorhalskreftceller følgende RAMBs eksponering kan utløse utbruddet av apoptose. For å teste denne hypotesen, ble HeLa livmorhalskreftceller eksponert for fem mikrometer av RAMB1 og analysert ved flowcytometri etter farging for annexin V binding og 7-AAD innlemmelse. Annexin V og 7-AAD farging gjør det mulig å diskriminere levedyktig (annexin V
neg /7-AAD
neg), apoptotisk (annexin V
pos /7-AAD
neg), og døde (annexin V
pos /7-AAD
POS) celler. Som vist i figur 7C (
venstre panel
), 24 timers eksponering for RAMB1 forårsaket en økning i både tidlig (annexin V positiv befolknings) og sen (annexin V og 7-AAD dobbel positiv befolknings) og apoptotiske befolkningen i behandlede kulturer versus kontroller. For å vurdere om dette skyldes caspaseaktivering, vi målte nivåene av PARP spalting i HeLa kreftceller etter eksponering for RAMB1. Som vist i fig 7C (
midtpanelet
), høyere nivåer av spaltede PARP er tydelige i behandlede versus ubehandlede kulturer som indikerer kaspase-3 aktivering. Kvantifisering av spaltet PARP /GAPDH er gitt i Figur 7C (
høyre panel
). Disse funnene støtter vår hypotese om at RAMBs behandling utløser apoptose i livmorhalskreftceller.
RAMB1 behandling forebygger forankringsavhengig svulst-koloni dannelsen av livmorhalskreftceller og synergizes med lysosome inhibitor Chloroquine
Et kjennetegn
