Abstract
RGS10 er en viktig regulator av celle overlevelse og chemoresistance i eggstokkreft. Vi har nylig viste at RGS10 avskrift uttrykk er undertrykt under ervervet chemoresistance i eggstokkreft. Undertrykkelse av RGS10 skyldes DNA hypermethylation og histon deacetylering, to viktige mekanismer som bidrar til å stanse all tumorsuppressorgener under kreft progresjon. Her har vi fullt undersøke de molekylære mekanismene for epigenetisk stanse av RGS10 uttrykk i kjemoresistent A2780-AD eggstokkreft celler. Vi identifiserer to viktige epigenetiske regulatorer, HDAC1 og DNMT1, som viser avvikende tilknytning RGS10 arrangører i kjemoresistent eggstokkreft celler. Knockdown av HDAC1 eller DNMT1 uttrykk, og farmakologisk hemning av DNMT eller HDAC enzymatisk aktivitet, signifikant øker RGS10 ekspresjon og cisplatin-mediert celledød. Endelig DNMT1 slå ned også reduserer HDAC1 binding til RGS10 promoter i kjemoresistent celler, noe som tyder HDAC1 rekrutteringen til RGS10 arrangører krever DNMT1 aktivitet. Våre resultater tyder på at HDAC1 og DNMT1 bidra til undertrykkelse av RGS10 under ervervet chemoresistance og støtte hemming av HDAC1 og DNMT1 som en adjuvant terapeutisk tilnærming for å overvinne eggstokkreft chemoresistance
relasjon:. Cacan E, Ali MW, Boyd NH , Hooks SB, Greer SF (2014) Hemming av HDAC1 og DNMT1 modulere RGS10 Expression og Reduser Ovarian Cancer Chemoresistance. PLoS ONE 9 (1): e87455. doi: 10,1371 /journal.pone.0087455
Redaktør: Malu G. Tansey, Emory University, USA
mottatt: 10. oktober 2013, Godkjent: 25 desember 2013; Publisert: 27 januar 2014
Copyright: © 2014 Cacan et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forsknings var støttet av tilskuddet # RSG-09-067-01-LB fra American Cancer Society. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft er en av de dødeligste gynekologisk kreft, med en 60% dødelighet hos pasienter og en 5-års overlevelse lavere enn 30% i avansert stadium sykdommen [1]. Den høye dødelighet skyldes i stor grad til utvikling av resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter [2], [3]. Dermed vil forstå de molekylære og genetiske mekanismer som driver utviklingen av ervervet chemoresistance gjør oss i stand til å forbedre dagens terapeutiske midler for eggstokkreft behandling. G-protein-koblede reseptorer (GPCR) initiere flere onkogene signaliseringsreaksjonsveier i kreftceller ved aktivering av de tilknyttede G-proteiner [4], [5]. Aktivering av GPCR av vekstfaktorer så som lysofosfatidisk syre (LPA) utløser overlevelsessignalveier som driver resistens overfor kjemoterapeutiske medikamenter som cisplatin og taxan [6]. GPCR aktivering av G- proteiner blir motarbeidet av aktiviteten av regulator av G-proteinsignalisering (RGS) proteiner. RGS proteiner hemme G-protein signalveier ved direkte binding til de aktiverte Gα subenheten av G-proteiner for å akselerere hydrolysen av GTP til GDP, som returnerer G-proteiner til en inaktiv tilstand [7] – [10]. Relevant for våre studier, siste rapportene tyder på at RGS proteiner hemme bryst, lunge, prostata, og eggstokkreft cellevekst gjennom hemming av GPCR signalveier [2], [11] -. [15]
RGS10 er blant den minste av RGS proteiner og som er sterkt uttrykt i et bredt spekter av celletyper [16] – [19]. RGS10 er en viktig regulator av celleoverlevelse og chemoresistance [2], og RGS10 transkripsjonen ekspresjon er betydelig undertrykt i flere ovarie cancer-cellelinjer [15]. Således kan undertrykkelse av RGS10 proteiner bidrar til chemoresistance ved å forsterke GPCR-mediert cellevekst og overlevelse signalveier. Vi har nylig vist at undertrykkelse av RGS10 skyldes delvis DNA hypermethylation og histon deacetylering, to viktige gen-tie mekanismer som bidrar til utviklingen av mange kreftformer. DNA metylering vedlikeholdes av DNA metyl transferaser (DNMTs) [20] og histon deacetylering blir vedlikeholdt av histon deacetylases (HDACs) [21]. Ofte er disse to enzymer koordinert å undertrykke transkripsjonen aktivitet av gener [22], [23]. Fuks
et al.
Har rapportert at DNMT1 er assosiert med histon deacetylase aktivitet og har evne til å binde HDAC1 [24]. Men de molekylære mekanismer som DNA hypermethylation og histon deacetylering undertrykke RGS10 og bidraget av disse enzymene til ervervet chemoresistance fortsatt ukjent.
Vi undersøker her de molekylære mekanismene for epigenetisk regulering av RGS10 uttrykk i eggstokkreft celler og fokus på kjemosensitiv foreldre A2780 celler og deres deriverte cellelinje, kjemoresistent A2780-AD. Vi identifiserer to viktige epigenetiske regulatorer, HDAC1 og DNMT1, som er sterkt knyttet til RGS10 promoter i kjemoresistent eggstokkreft celler. HDAC1 og DNMT1 slå ned øker betydelig RGS10 uttrykk og cisplatin stimulert celledød. Våre resultater tyder på at HDAC1 og DNMT1 bidrar til undertrykkelse av RGS10 under ervervet chemoresistance og støtte økende bevis for at hemming av HDAC1 /DNMT1 representerer nye terapeutiske tilnærminger for å overvinne eggstokkreft chemoresistance.
Materialer og metoder
celle~~POS=TRUNC linjer~~POS=HEADCOMP og reagenser
kjemosensitiv A2780 foreldrenes cellelinje og deres avledede kjemoresistent A2780-AD celler (avledet som beskrevet [25]) ble sjenerøst gitt av Dr. Bob Brown, Imperial College London. Disse cellene ble holdt i RPMI 1640 medium (Mediatech Inc.) supplementert med 10% FBS og 5 mM L-glutamin. Kjemoresistent celler ble ytterligere opprettholdt i tre mikrometer cisplatin. Alle celler ble dyrket i 5 mM penicillin-streptomycin ved 37 ° C med 5% CO
2. OV2008 og C13 celler (avledet som beskrevet [26], [27]) ble sjenerøst gitt av Dr. Patricia Kruk, University of South Florida.
5-Aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-dC ), ble Trichostatin A (TSA), og cisplatin innkjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Antistoffer som gjenkjenner RGS10, HDAC1, geit-anti-rotte-IgG-HRP (pepperrot peroksydase), og HRP-konjugert kanin-antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Antistoffer som gjenkjenner DNMT1 ble oppnådd fra Abcam (Cambridge, MA). HRP-konjugert mus antistoffer ble kjøpt fra Promega (Madison, WI). Antistoffer som gjenkjenner β-Actin ble innhentet fra Cell Signaling (Beverly, MA).
siRNA konstruerer og transient transfeksjon
Kort interfering RNA (siRNA) pre-designet for HDAC1 (Qiagen), RGS10 og DNMT1 (Santa Cruz) ble brukt til å slå ned uttrykk for HDAC1, RGS10 eller DNMT1. Egge All Star Control siRNA (Qiagen) ble brukt som kontroll. A2780-AD-celler ble transfektert med 10 nm HDAC1 eller DNMT1 bestemt siRNA eller All Star egge kontroll siRNA hjelp HiPerfect transfeksjon reagens (Qiagen) i henhold til produsentens anvisninger. Etter angitte inkubasjonstid ble cellene høstet og analysert i western blot, RNA uttrykk, eller kromatin immunoutfellingsstudier eksperimenter.
RNA uttrykk og kvantitativ real-time PCR
mRNA ble isolert ved hjelp Qiazol RNA Ekstraksjonsreagens (Qiagen) som beskrevet i produsentens protokoll. I korthet ble cellene lysert i Qiazol og agitert på en 3D-rotator i 5 minutter. 200 ul kloroform ble tilsatt og ble inkubert i tre minutter ved romtemperatur. Prøvene ble sentrifugert, og den vandige fase (400 ul) ble overført til et Eppendorf-rør. 500 mL isopropanol ble tilsatt og ble inkubert i 10 minutter ved romtemperatur. Etter sentrifugering, ble pellet vasket med 1 ml kald 75% etanol, sentrifugert og resuspendert i 50 ul RNase-fritt vann. RNA ble kvantifisert og cDNA ble generert fra en mikrogram total ekstrahert RNA ved hjelp av en Omniscript Reverse Transcription Kit (Qiagen). Etter cDNA syntese ble kvantitativ real-time PCR utføres ved hjelp av TaqMan Universal PCR Master Mix (Roche) og spesifikke primere og prober rettet mot RGS10 eller GAPDH kodende områder. Avskrift uttrykk ble vurdert ved hjelp av en ABI prisme 7900HT Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Reaksjoner ble normalisert mot GAPDH ekspresjon og beregninger ble utført ved bruk av standardkurver generert. Primere som ble brukt var: RGS10 Forward: 5′-GAC CCA AGA AGG CGT GAA AAG A-3 «, RGS10 Omvendt: 5′-GCT GGA CAG AAA GGT CAT GTA GA-3′, RGS10 probe: 5»-AGA TAA GAC GCA GAT GCA GGA AAA GGC-3 «, GAPDH Forward: 5′-GGA AGC TCA CTG GCA TGG C-3′, GAPDH Omvendt: 5»-TAG ACG GCA GGT CAG GTC CA-3 «og GAPDH-probe: 5»-CCC CAC TGC CAA CGT GTC AGT G-3 «.
for å bestemme effekten av 5-Aza-dC og TSA eksponering på RGS10 karakteruttrykk, 1 × 10
6 A2780-AD celler ble belagt per 10 cm
2 vevskulturskål og ble inkubert over natten. Celler ble behandlet med 20 uM 5-Aza-dC eller med 500 ng TSA oppløst i DMSO. TSA behandlede celler ble inkubert i 48 timer og 5-Aza-dC behandlede cellene ble inkubert i tre, fem eller syv dager, med media aspirert og erstattet daglig. RNA isolasjon og DNA-syntese ble utført som beskrevet ovenfor.
Chromatin immunoutfelling (chip) assay
brikke analyser ble utført som tidligere beskrevet [15]. I korthet ble cellene sådd ut i en tetthet på 2 x 10
6 i 10 cm
2 plater. Tre millioner celler ble tverrbundet med 1% formaldehyd i åtte minutter ved romtemperatur. Kryssbindingsreaksjonene ble stoppet ved tilsetning av 0,125 M glycin. Cellekjerner ble isolert og ble konsentrert ved lysis i SDS lysebuffer (1% SDS, 10 mM EDTA, 50 mM Tris pH 8,0) pluss proteaseinhibitorer i 30 minutter på is etterfulgt av flash-frysing i flytende nitrogen. Cellekjernene ble sonikert ved bruk av en Bioruptor vannbad sonikator (Diagenode) for å generere et gjennomsnitt av 500 bp av skåret DNA som ble bekreftet ved agarosegelelektroforese. Sonikerte lysater ble forbehandlet med laks-sperm /agarosekuler (Millipore), 5% av det totale Lysatet ble lagret som inngang for normalisering. Halvparten av den gjenværende lysatet ble immunopresipitert med 5 ug av den angitte antistoff over natten ved 4 ° C og den andre halvparten av lysatet ble immunopresipitert med et kontrollantistoff. Etter ytterligere to timers immunoutfelling med laks-sperm belagte agaroseperler, ble alle prøver vasket med hver av de følgende buffere: lav saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl), høy saltbuffer (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris pH 8,0, 500 mM NaCl), LiCl (0,25 M LiCl, 1% NP40, 1% DOC, 1 mM EDTA, 10 mM Tris pH 8,0), og 1 x TE (Tris-EDTA); DNA ble deretter eluert med SDS elueringsbuffer (1% SDS, 0,1 M NaHCO3). Etter eluering ble kryssbindinger snudd over natten med 5 M NaCl ved 65 ° C og immuno DNA ble isolert ved hjelp av fenol: kloroform: isopropanol mix (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner. Isolert DNA ble kvantifisert ved real time PCR på en ABI prisme 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) ved hjelp av spesifikke primere og prober rettet mot RGS10 og GAPDH arrangører regionen. Verdier generert fra Real Time PCR reaksjoner ble beregnet basert på standardkurver generert, ble kjørt i tre eksemplarer reaksjoner, og ble analysert ved hjelp av SDS 2.0 programmet (Applied Biosystems).
Chromatin immunoprecipitation analysen i siRNA behandlede celler
kjemoresistent A2780-AD-celler ble sådd ut ved en tetthet på 1,2 x 10
6 celler per 10 cm
2 vevskulturplater. Celler ble behandlet med siRNA-konstruksjoner som beskrevet ovenfor, og ble inkubert i 72 timer. Celler ble høstet og 1/10 av cellevolumet ble fjernet for analyse av knockdown effektivitet ved western blot-analyse. Chip-analyser ble utført som beskrevet ovenfor på de gjenværende høstede cellene.
RNA-ekspresjon i behandlede celler siRNA
Cellene ble sådd ut i en tetthet på 1 x 10
6 celler pr 10 cm
2 vevskulturskål og ble inkubert over natten. Cellene ble så transfektert med de indikerte siRNA konstruksjon som beskrevet ovenfor, og inkubert i 72 timer, og en RNA-ekstraksjon ble utført som beskrevet ovenfor.
Apoptose assay
Apoptose av A2780-celler var AD vurdert ved hjelp av Annexin V: PE apoptose Detection Kit i (BD Pharmingen). 1 x 10
6 A2780-AD-celler ble sådd ut på en 10 cm
2 vevskulturskål og inkubert i 24 timer ved 37 ° C. Cellene ble behandlet med HDAC1 siRNA eller med kontroll siRNA hjelp av HiPerfect transfeksjon reagens. Etter 48 timers inkubasjon ble 50 uM av cisplatin tilsatt både HDAC1 siRNA og tak siRNA behandlede celler, og cellene ble inkubert i ytterligere 48 timer. A2780-AD celler ble kort trypsinert og ble høstet. En fraksjon av cellevolumet ble fjernet for western blot-analyse, og den resterende del av cellene ble vasket med kald PBS og to ganger, ble resuspendert i Annexin V bindingsbuffer ved en konsentrasjon på 1 x 10
6 celler /ml. Cellene ble deretter overført til 5 ml dyrkningsrør inneholdende 5 ul av Annexin V-PE og /eller 5 ul av 7-Aminoactinomycin D (7-AAD). Prøvene ble forsiktig blandet og inkubert i 20 minutter ved romtemperatur. Etter tilsetning av 400 ul av Annexin V bindingsbuffer til hvert rør, ble prøver analysert og kvantifisert ved hjelp av strømningscytometri og resulterende data ble analysert ved bruk av FlowJo programvare.
Resultatene
Histone acetylering er undertrykt ved RGS10 arrangører i eggstokkreft celler
Vi har nylig vist at nivåene av acetylert histon H3 histone er betydelig redusert ved RGS10-1 formidler i A2780-AD cellemodell for eggstokkreft chemoresistance [15]. For å bekrefte disse funnene i flere cellelinjer, kromatin immunpresipitering (chip) analyser ble utført i kjemosensitiv eggstokkreft cellelinje OV2008 og i kjemoresistent C13 datterceller. Selv om de totale nivåer av histon H3 er lik på begge RGS10 og GAPDH-promotorer i kjemosensitiv og kjemoresistent celler (fig. 1A), nivåer av acetylert histon H3 er betydelig lavere ved RGS10 promotorer i den kjemoresistent C13 ovarian cancer celler sammenlignet med kjemosensitiv OV2008 celler ( fig. 1B).
brikke analyser ble utført i OV2008 parentale celler og medikamentresistente C13-celler. Lysatene ble immunopresipitert med kontroll, anti-histon H3, anti-acetyl histon H3, eller anti-acetyl H3K18 antistoffer. Associated DNA ble isolert og analysert via sanntid PCR primere som spenner over de RGS10 og GAPDH arrangører. Real-time PCR verdier ble normalisert til den totale mengden av promoter DNA tilsettes (input). Inngangsverdier utgjør 5% av det totale cellelysat. ** P 0,005. A) Global histon H3 nivåer forbundet med RGS10 og GAPDH arrangører. B) Global nivåer av histon H3 acetylering assosiert med RGS10 og GAPDH arrangører. C) Nivåer av histon H3 acetylerte på lysin 18 forbundet med RGS10 og GAPDH arrangører.
Reduksjoner i H3 lysin 18 acetylering (H3K18Ac) har vært assosiert med aggressiv kreft fenotyper og med dårlig pasient prognose [28] , [29]. Vi utførte neste brikke-analyser for å fastslå om tap av H3K18 bidrar til tap av global histon acetylering ved RGS10 promotorer i kjemoresistent C13-celler. En betydelig reduksjon i H3K18 acetylering ved RGS10 promotorer ble observert i kjemoresistent C13-celler, mens H3K18 acetylering ved GAPDH-promotorene i OV2008 og C13-celler forble uforandret (Fig. 1C). Sammen disse dataene antyder tap av acetylering ved RGS10 arrangører bidrar til tap av RGS10 uttrykk i to uavhengige cellemodeller av kjemoresistent eggstokkreft.
HDAC1 og DNMT1 undertrykke RGS10 uttrykk i kjemoresistent eggstokkreft celler
Vi har tidligere vist at HDAC1 proteiner binde med betydelig økt frekvens til RGS10 promoter i kjemoresistent A2780-AD celler i forhold til foreldre kjemosensitiv A2780 celler [15]. For å undersøke molekylære roller for HDAC1 i regulering RGS10 uttrykk, ble en siRNA duplex benyttes for å spesifikt slå ned endogen HDAC1 uttrykk i A2780-AD celler. siRNA-mediert knockdown av HDAC1 resulterte i en mer enn tre ganger økning i endogen RGS10 transkripsjon uttrykk i forhold til å kontrollere siRNA (Fig. 2A), noe som tyder på at HDAC1 spiller en avgjørende rolle i å regulere RGS10 transkripsjon. Western blot analyse bekreftet HDAC1 slå ned økt RGS10 protein uttrykk (Fig.2B). I et lignende eksperiment ble A2780-AD-celler transfektert med HDAC1 for å bestemme virkningene av ektopisk ekspresjon av HDAC1. Overekspresjon av HDAC1 dramatisk redusert RGS10 uttrykk i kjemoresistent A2780-AD-celler (fig. 2C-E). Sammen utgjør disse dataene indikerer at HDAC1 akkumulering ved RGS10 arrangører bidrar trolig til undertrykkelse av RGS10 i kjemoresistent eggstokkreft celler.
A) knockdown av HDAC1 øker RGS10 mRNA transkripsjon. A2780-AD-celler ble transfektert med HDAC1 siRNA eller kontrollere siRNA og inkubert i 72 timer. RNA ble ekstrahert og cDNA ble generert ved anvendelse av en revers primer for målretting RGS10 eller GAPDH-kodende region. Data ble kvantifisert ved hjelp av qPCR med primere og prober spesifikke for RGS10 og GAPDH kodende områder. Stilles grafisk data viser gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, med feilfelt som angir standard feil av gjennomsnittet (SEM). Betydning ble beregnet med en Student t-test ** p 0,005. B) Western blot analyse demonstrere effektiviteten av HDAC1 knockdown og RGS10 protein uttrykk følgende HDAC1 slå ned med Beta-Actin kontroller. C-D) HDAC1 overekspresjon avtar RGS10 ekspresjon i kjemoresistent celler. A2780 /AD-celler ble sådd ut i 24-brønners plate og tillatt å feste over natten. Celler ble transfektert med 500 ng HDAC1 eller tom vektor ved hjelp av Fugene 6-reagens (Promega) ifølge produsentens protokoll. Etter 48 timers inkubasjon ble cellene høstet i TRIzol (Invitrogen) og ekspresjon av RGS10 og HDAC1-genene ble vurdert ved hjelp av RT-PCR, som beskrevet, og normalisert til actin genekspresjon. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige forsøk *** p 0,0005. E) Western blot analyse viser RGS10 protein uttrykket etter HDAC1 overekspresjon med Beta-Actin kontroller.
RGS10-1 promoter inneholder en høy konsentrasjon av CpG dinukleotider gjør det til et potensielt mål for DNMT vedlikehold metylering under eggstokkreft kreft progresjon. Vi først bestemmes av western blot analyse som DNMT1 uttrykk nivåer er lik i begge A2780 og A2780-AD cellelinjer (Fig. 3B). For ytterligere å undersøke relevansen av DNMT1 i den spesifikke undertrykkelse av RGS10 uttrykk, ble Chip analyser utført i A2780 foreldrenes og deres avledede resistente A2780-AD celler. Lysates ble immunoutfelt med kontroll eller anti-DNMT1 antistoff og tilhørende DNA ble analysert via kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR) med spesifikke primere og prober som spenner over de RGS10 og GAPDH arrangører. I motsetning til totalt protein overflod, chip-analyser viser at binding av DNMT1 er betydelig økt ved RGS10 promoteren i kjemoresistent celler sammenlignet med kjemosensitiv eggstokkreft celler (fig. 3A). Sammen indikerer disse data at akkumulering av DNMT1 ved RGS10 promoteren bidrar sannsynligvis til undertrykkelse av RGS10 i løpet av eggstokkreft chemoresistance.
A) Nivåer av DNMT1 forbundet med RGS10 promotorer i A2780 og A2780-AD eggstokkkreftceller. Chip-analyser ble utført i A2780 foreldrenes og deres avledede resistente A2780-AD celler. Lysatene ble immunoutfelt med kontroll eller anti-DNMT1 antistoff. Associated DNA ble isolert og analysert via Real Time PCR bruker spesifikke primere og prober som spenner over de RGS10 og GAPDH arrangører. Real-time PCR verdier ble normalisert til den totale mengden av promoter DNA tilsettes (input). Verdier ble normalisert til GAPDH og representerer gjennomsnitt ± SEM av tre uavhengige eksperimenter ** p 0,005. B) Western blot analyse av globale DNMT1 nivåer i A2780 og A2780-AD celler. Celler ble høstet og lysater ble anvendt for immunopresipitering. Antistoff-konjugerte agarosekuler (IP) for DNMT1 ble inkubert med rotasjon natten over. Kulene ble vasket, eluert og underkastet Western blot med respektive antistoffer. C) A2780-AD-celler ble transfektert med DNMT1 siRNA eller med kontroll siRNA og ble inkubert i 72 timer. RNA ble ekstrahert og cDNA ble generert ved hjelp av revers primere rettet mot RGS10 og GAPDH kodende områder. Data generert ble kvantifisert ved hjelp QRT-PCR med primere og prober spesifikke for RGS10 kodende region. Verdier representerer gjennomsnitt ± SEM av fire uavhengige forsøk ** p 0,005. D) Western blot analyse for effektivisering av banket ned DNMT1 og for RGS10 protein uttrykk følgende DNMT1 slå ned.
Opphopning av DNMT1 på RGS10 arrangøren ledet oss til å finne ut om opphopning påvirker RGS10 avskrift uttrykk nivå i kjemoresistent celler. For dette formål ble A2780-AD-celler transfektert med DNMT1 siRNA eller kontroll siRNA. RNA ble ekstrahert og generert cDNA ble kvantifisert ved hjelp QRT-PCR med primere og prober spesifikke for RGS10 kodende region og normalisert til husholdningsgenet GAPDH uttrykk. Dataene viser at å slå ned DNMT1 signifikant øker endogen RGS10 transkripsjon uttrykk (Fig. 3C) og protein uttrykk (Fig. 3D) i A2780-AD celler. Denne økningen antyder at DNMT1 funksjoner med HDAC1 å regulere undertrykkelse av RGS10 transkripsjon i kjemoresistent A2780-AD celler.
Hemming av HDAC og DNMT aktivitet forbedrer RGS10 uttrykk og reduserer eggstokkreft celleviabilitet
neste søkt å fastslå om farmakologiske hemmere av histon deacetylering og DNA metylering kan endre uttrykk for RGS10 i kjemoresistent eggstokkreft celler. Den HDAC-inhibitor TSA og DNMT inhibitor 5-Aza-dC ble brukt til å hemme HDACs og DNMTs, respektivt. A2780-AD-celler ble behandlet med 500 nM TSA og ble inkubert i 2 dager, eller ble behandlet med 20 uM 5-Aza-dC og inkubert i 3, 5 og 7 dager. Total RNA ble isolert fra ubehandlede kontrollceller, TSA, og 5-Aza-dc behandlede celler. Den relative uttrykk for RGS10 avskrift uttrykk ble kvantifisert ved QRT-PCR og ble normalisert til GAPDH transkripsjon uttrykk. I samsvar med observasjoner fra HDAC1 og DNMT1 slå ned eksperimenter, TSA og 5-Aza-DC behandlinger både betydelig forbedret RGS10 transkripsjon uttrykk i kjemoresistent A2780-AD-celler (fig. 4A og 4B). Å utforske mulige synergi roller for HDAC1 og DNMT1 i å regulere RGS10 uttrykk, ble kombinasjonsstudier utført ved hjelp av TSA og 5-Aza-st i kjemoresistent eggstokkreft celler. Igjen, TSA eller 5-aza-dC alene forbedret RGS10 ekspresjon i A2780-AD-celler, og kombinasjonen av disse to medikamenter resulterer i en dobling av RGS10 uttrykk er større enn summen av den individuelle virkning, noe som tyder på en potensiell samarbeidende effekt (Fig . 4C). For å undersøke samarbeid roller for HDAC1 og DNMT1 i cellevekst og chemoresistance, ble A2780-AD-celler ble behandlet med TSA og /eller 5-aza-dC i nærvær av cisplatin og cellenes levedyktighet ble utført. 5-Aza-dC alene reduserte cellevekst med ca. 40%, mens TSA alene hadde en beskjeden, men signifikant effekt på cellelevedyktighet; Men kombinasjonen av TSA og 5-Aza-dC hemmet cellenes levedyktighet med 90%. Som forventet, A2780-AD-celler var resistente overfor cisplatin toksisitet, men enten TSA eller 5-aza-dC delvis re-sensibiliserte cellene til cisplatin-mediert cytotoksisitet (fig. 4D). For å avgjøre om RGS10 oppregulering av TSA /5-Aza-DC kombinert behandling fullt ut kunne gjøre rede for tap av celle levedyktighet, forsøkte vi å redde celle levedyktighet i nærvær av 5-Aza-DC og TSA med RGS10 siRNA. Ikke overraskende, knock-down av RGS10 alene ikke redde celle levedyktighet, i samsvar med det brede spekter av HDAC og DNMT målgener i kreftceller (fig. 4E). Dermed RGS10 coordinately regulerer celle levedyktighet og kjemosensitivitet med ekstra HDAC og DNMT målgener.
Total RNA ble isolert fra ubehandlede kontrollceller og TSA eller 5-Aza-dC behandlede celler. Den relative uttrykk for RGS10 mRNA ble kvantifisert ved QRT-PCR og normalisert til GAPDH transkripsjon uttrykk * p 0,05; ** P 0,005. A) HDAC hemming øker RGS10 uttrykk i kjemoresistent A2780-AD celler. Cellene ble sådd ut i en 10 cm
2 plate og inkubert i 24 timer. Den følgende dag ble cellene behandlet med 500 nM TSA og ble inkubert i ytterligere 48 timer. B) DNMT hemmer 5-Aza-dC forbedrer RGS10 uttrykk i kjemoresistent celler. To millioner A2780-AD-celler ble utsådd i 10 cm
2 plater og ble inkubert i 24 timer. Den følgende dag ble cellene behandlet med 20 uM 5-Aza-dC. Media og narkotika ble oppdatert hver 24. time. Etter den angitte inkubasjonstid (3, 5 og 7 dager), ble cellene høstet, mRNA ble isolert, og cDNA ble generert og kvantifiseres ved hjelp av QRT-PCR med spesifikke primere og probe. C) A2780-AD-celler ble platet i 96-brønners plater og behandlet med 5 uM 5-Aza-dC i 5 dager, 500 nM TSA i 36 timer, en blanding av 5 uM 5-Aza-dC i 5 dager, og 500 nM TSA for de siste 36 timer eller DMSO. Genekspresjon ble vurdert ved QRT-PCR som beskrevet, og normalisert til RPL13A genekspresjon. Pilen angir uttrykket nivå forutsagt av en additiv effekt av TSA og 5-Aza-dC. D) I et parallelt eksperiment ble A2780-AD-celler behandlet under de samme betingelser som 4C, med eller uten 30 mM cisplatin for de siste 12 timer. Celleoverlevelse ble vurdert ved hjelp CellTiter-Blue fluorimetriske levedyktighet analyser. ***: P 0,001 sammenligne epigenetisk medikament for DMSO-kontroll i fravær av cisplatin. ###: P 0,001 sammenligne kjøretøy versus cisplatin behandling innen epigenetiske behandlingsgruppene. Den stiplede boksen indikerer celleviabilitet spådd av en additiv effekt av TSA og 5-Aza-DC. E) A2780 /AD celler (5000 celler /brønn) ble sådd ut i 96-brønns plate og transfektert med negativ kontroll eller RGS10 siRNA tomannsboliger (Ambion Grand Island, New York) som per produsentens protokoll bruker Dharmafect1 transfeksjon reagens (Dharmacon). Celler ble dosert med en kombinasjon av 5 uM 5-Aza-dC i 3 dager og 500 nM TSA for de siste 36 timer eller DMSO. 30 uM cisplatin eller vehikkel ble tilsatt for de siste 12 timer. Celleoverlevelse ble vurdert ved hjelp CellTiter-Blue fluorimetriske levedyktighet analyser.
Knocking ned HDAC1 forbedrer cisplatin-stimulerte apoptose i kjemoresistent celler
Vårt tidligere arbeid antyder at undertrykkelse av RGS10 uttrykk bidrar til utvikling av chemoresistance under progresjon av kreft i eggstokkene ved amplifisering av endogene overlevelsessignalveier [2], [15], og resultatene presentert her antyder at HDAC1 bidrar til tap av RGS10 ekspresjon i kjemoresistent eggstokkreft celler. For å bestemme HDAC1-mediert endringer i celle overlevelse av kjemoresistent eggstokkreft celler, ble cisplatin resistente A2780-AD celler transfektert med HDAC1 siRNA. Etter transfeksjon ble celler inkubert med 50 pM cisplatin og apoptose ble analysert ved hjelp av en Annexin V: PE apoptose deteksjonssett (BD Pharmingen). Annexin V binder fosfatidylserin, som er eksponert bare i apoptotiske celler, mens membranen impermeant DNA etikett 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) selektivt binder seg til GC regioner av DNA bare i slutten av apoptotiske eller døde celler med nedsatt membraner [30] – [32]. Dermed er tidlig apoptotiske celler farget med bare annexin V-PE, mens sent apoptotiske og døde celler er farget med både annexin V-PE og 7-AAD. Strømningscytometrisk analyse ble brukt for å skille mellom populasjoner av umerkede og singly- eller dobbelt-merkede celler. HDAC1 slå ned betydelig økt populasjon av cisplatin-stimulerte celler fra 12,9% til 32,1%, som er positive for begge annexin V-PE og 7-AAD (sent apoptotiske eller døde celler) (Fig. 5A). Resultatene bekreftes ved hjelp av tre uavhengige eksperimenter (fig. 5B). Slå ned effektiviteten av HDAC1 og RGS10 protein uttrykk følge HDAC1 slå ned ble bekreftet i A2780-AD celler ved western blot analyse (Fig. 5C). Sammen disse data tyder på at HDAC1 mediert reduksjon av RGS10 uttrykk blunts evne cisplatin å indusere celledød i A2780 /AD eggstokkreft celler.
A2780-AD celler ble behandlet med HDAC1 siRNA eller kontrollere siRNA og ble inkubert i 48 timer. Etter inkubering ble cellene behandlet med 50 uM cisplatin og inkubert i tillegg 48 timer i RPMI 1640 medium. En Annexin V: PE Apoptose Detection Kit I (BD Pharmingen) ble anvendt for farging; Resultatene ble kvantifisert ved strømningscytometri-analyse og ble analysert ved hjelp av FlowJo programvare. Levedyktige celler var negative for både annexin V-PE og 7-AAD; tidlige apoptotiske celler var positive for annexin V-PE og negative for 7-AAD, mens sene apoptotiske døde celler var positive for både annexin V-PE og 7-AAD merking. A) Den relative økningen av apoptotiske celler i HDAC1- siRNA transfekterte A2780-AD celler som innlemmet den Annexin V-PE og 7-AAD flekker. B) Diagram representerer gjennomsnittet av tre uavhengige eksperimenter, med feilfelt betegner SEM * p 0,05. C) Western blot analyse representerer effektiviteten HDAC1 knockdown og RGS10 protein uttrykk følgende HDAC1 slå ned.
DNMT1 slå ned avtar HDAC1 binding til RGS10 arrangøren i kjemoresistent eggstokkreft celler
HDAC1 og DNMT1 bidra til genet stanse gjennom rekruttering transkripsjons repressors til arrangøren regioner [33] – [35] og arbeide sammen for å undertrykke genekspresjon [24], [36]. Våre data tyder på at HDAC og DNMT aktiviteter i fellesskap slå RGS10 (fig. 4C). For å undersøke krysstale mellom disse to epigenetiske regulatorer, ble A2780-AD-celler transfektert med DNMT1 siRNA eller kontroll siRNA og ble inkubert i 72 timer. HDAC1 binding til RGS10 arrangøren ble undersøkt av chip analyser i DNMT1 siRNA eller kontrollere siRNA behandlet A2780-AD celler. DNMT1 slå ned betydelig redusert binding av HDAC1 til RGS10 promoter (fig. 6A) og western blot analyse (Fig. 6B) viste vellykket og spesifikk knockdown av DNMT1. Det motsatte eksperiment ble også utført der A2780-AD celler ble transfektert med HDAC1 siRNA. Western blot analyse viste knockdown av HDAC1 resulterte i undertrykkelse av DNMT1 proteinekspresjon (data ikke vist); en observasjon sett av andre også [37]. Disse data tyder på at HDAC1 er rekruttert til RGS10 arrangøren via DNMT1 og metyl-CpG bindende protein 2 (MeCP2) avhengige mekanismer (Fig. 6C).
