Abstract
Kontekst
binyrebark karsinomer (ACC) er en sjelden svulst type med en dårlig fem års overlevelse og begrensede behandlingsalternativer.
Mål
Forståelse av den molekylære patogenesen av denne sykdommen har blitt hjulpet av genomiske analyser synlig endringer i TP53, wnt, og IGF signalveier. Ytterligere forklaring er nødvendig for å avsløre terapeutisk handlings mål i ACC.
Design
I denne studien ble global DNA-metylering nivåer vurderes av infinium HumanMethylation450 BeadChip Array på 18 ACC svulster og 6 normale adrenal vev . En ny, ikke-lineær sammenheng tilnærming,
diskretisering metoden
, vurderes forholdet mellom DNA metylering /genekspresjon over ACC svulster.
Resultater
Denne korrelasjonsanalyse viste epigenetisk regulering av gener som er kjent for å modulere TP53, WNT, og IGF signalering, samt stanse av svulsten suppressor MARCKS, tidligere har vært rapportert i ACC.
Konklusjoner
DNA metylering gener som er kjent kan regulere for å spille en rolle i ACC patogenesen samt kjente tumor suppressors
Citation. Legendre CR, Demeure MJ, Whitsett TG, Gooden GC, Bussey KJ, Jung S, et al. (2016) Pathway Konsekvenser av Aberrant Global Metylering i Adrenokortikal kreft. PLoS ONE 11 (3): e0150629. doi: 10,1371 /journal.pone.0150629
Redaktør: Jorg Tost, CEA – Institut de Genomique, FRANCE
mottatt: 28. mai 2015; Godkjent: 17 februar 2016; Publisert: 10 mars 2016
Copyright: © 2016 Legendre et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Uttrykket data som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776). De metylering data som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 )
Finansiering:. forfatterne ønsker å takke støtte fra ATAC forskningsfond og Kirstens Legacy Fund. Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av en sjenerøs filantropiske bidrag fra Mr. Ray Thurston. Finansiering støtte ble også gitt av Virginia G. Piper Charitable Trust (TGW og BS). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
binyrebark karsinomer (ACC) er sjeldne svulster som står for inntil 0,2% av kreftdødsfall. Den estimerte forekomst av sykdommen er 0,7 til 2,0 tilfeller per million personer per år [1, 2]. Denne sykdommen rammer vanligvis voksne i sine 40-50s, men kan også sees hos barn, typisk med en Tumor Protein p53 (
TP53
) germline mutasjon [3]. Den eneste kurative behandling er kirurgisk fjerning av en lokalisert tumor; mange pasienter har metastatisk sykdom ved tidspunktet for diagnose, noe som ytterligere begrenser deres terapeutiske alternativer [4, 5]. I en studie ser på nesten 4000 tilfeller av ACC mellom 1985 og 2005, Bilimoria
et al
. rapporterte 26,5% presenteres med nodal metastaser og 11,3% presenteres med fjernmetastaser, som fører til en fem-års overlevelse på 11,5% sammenlignet med 55,1% uten fjernmetastaser [4]. Svarprosenten til generelt aksepterte førstelinje kjemoterapi bestående av etoposid, doxibucin, cisplatin og mitotane er bare 23% [6], noe som gjør det klart at det er et presserende behov for nye behandlingsformer.
Genomisk analyser er å belyse den molekylære patogenesen av ACC og utsette potensielle terapeutiske mål. De mest studerte og konsekvent observert genomiske avvik involvere
TP53
tumor suppressor genet, insulin-like growth factor type 2 (
IGF2
) signal-, og Vingeløse-Type MMTV Integration nettstedet Familie (
WNT
) veien. Flere studier har klart etablert en rolle for avvikende TP53 funksjon, selv om det rapportert mutasjonsraten for
TP53
i sporadisk voksen ACC er bare ca 16-27% [7-9]. Overekspresjon av
IGF2
er sett i minst 95% av ACC tumorprøver studert, spørre kliniske studier ansette Insulin-like Growth Factor 1 reseptor (IGF1R) hemmere [10] [11]. WNT sti signalering er også avvikende, med aktiverende somatiske mutasjoner av β-catenin gen sett med en tilsvarende frekvens på ca. 30% i både godartede og ondartede tumorer binyrebarken [12]. Mens genomiske analyser har avdekket pathway forstyrrelser i ACC, har klinisk handlings mål vært unnvikende, som fører en til å konkludere med at det er behov for en dypere forståelse av ACC tumorigenesis.
Undersøkelse av epigenetiske forandringer i ACC er tiltrekke interesse. Global metylering analyser har vist at forskjellige metylering mønstre eksisterer for å skille ACC fra godartede svulster og /eller normal adrenal vev [13, 14]. Rechache
et al
. har vist at metastatiske ACC svulster viste en tydelig metylering mønster i forhold til normal adrenal og primær ACC svulster, og ondartede prøvene viste global hypometylering [14]. Barreau
et al
. identifisert et CpG island methylator fenotype (CIMP) i ACC assosiert med dårlig pasient overlevelse [15]. Disse globale metylering analyser antydet hypermethylation av tumordempere som cyclin-avhengig kinase inhibitor 2A (
CDKN2A
), Slettet i Lung og Esophageal Cancer 1 (
DLEC1
), eller
N- mYC
Nedstrøms-regulert Gene familiemedlem 2 (
NDRG2
) som en mekanisme for redusert mRNA uttrykk observert i ACC svulster i forhold til adenomer eller normal adrenal vev. Flere nylig, en integrert genomisk karakterisering identifisert to ulike molekylære undergrupper i ACC: C1A og C1b [7]. Den C1A undergruppe korrelert med en dårlig pasient prognose, økt frekvens av driver genetiske mutasjoner, distinkte mRNA og miRNA klynger, og hadde en klar sammenheng med CIMP. Dermed har metylering analyser identifisert undergrupper av ACC svulster med differensial prognose og foreslo molekylære endringer som kan bidra til ACC patogenesen; selv, forblir det fulle omfanget av genene og trasé modulert ved metylering i ACC ukjent.
I dette arbeidet, søkte vi å relatere DNA metylering endringer med uttrykk profiler i et sett med ACC (n = 18 [17 svulster , en levermetastase ACC_150]) og normal adrenal (n = 6) prøver for bedre å kunne forstå hvordan metylering kan resultere i avvikende genet og sti ekspresjon observert i ACC. Vår studie bruker en ikke-lineær sammenheng tilnærming referert til som
diskretisering metoden product: [16] for å vurdere DNA-metylering /genuttrykk relasjoner innen trasé, og avslører potensialet epigenetisk regulering av gener involvert i TP53, WNT, IGF2, og tumorsuppressorgenet signalering og /eller stabilitet. Mens andre studier har rapportert DNA metylering endringer i ACC i det siste, er vår studie tydelig i måten vi beskriver DNA-metylering /genuttrykk foreninger til å identifisere epigenetiske regulerte veier med kjent betydning for ACC.
Materialer og metoder
kliniske prøver
De kliniske prøver som brukes i denne analysen representerer en undergruppe av prøvene tidligere beskrevet [8]. Kort fortalt ble et sett av ACC flash frosset svulster og normal binyrene samlet ved Mayo Clinic (Rochester, Minnesota), Universitetssykehuset Essen (Essen, Tyskland), University of Calgary (Alberta, Canada), og Scottsdale Healthcare (Scottsdale , Arizona), samt donert direkte av pasienter gjennom sine kommunehelsetjenesten; alle prøvene ble oppnådd under egnede etiske rutiner og skriftlig informert pasienten samtykke ved de respektive institusjonene. Normale binyrene ble oppsamlet på tidspunktet for kirurgi for en annen indikasjon, typisk reseksjon av en tumor i nyrene. The adrenal ble tatt en bloc, og hjernebarken ble macrodissected fra medulla som best mulig. Forskningsmateriale for denne studien ble oppnådd under protokoller godkjent av Western Institutional Review Board (WIRB # 20051769). Diagnosen ACC ble bekreftet ved gjennomgang av patologi rapport, og i de fleste tilfeller, ved reexamination av histopatologiske lysbilder av en erfaren endokrine patolog.
Gene Expression Profilering
mRNA uttrykk og statistisk analyse av ACC, og normale vev ble tidligere beskrevet [8]. I korthet, RNA ble ekstrahert fra 100 mg prøver av ACC-tumorer og normalt vev adrenal, amplifisert og revers transkribert utnytte MessageAmp II Biotin Enhanced-sett (Ambion Life Technologies Corp, Carlsbad, CA). Biotin-merket cRNA ble syntetisert i henhold til deres standard protokoll, etterfulgt av rensing via tilgjengelig cRNA Filterpatroner. Merket cRNA var fragmentert og hybridisert til Affymetrix U133 Plus 2 menneskelige genom arrays følgende standard Affymetrix protokollen (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA). Skanning og vasking ble fullført på fluidic stasjoner FS450 og Genechip
® Scanner 3000 med Workstation.
Array kvalitet for ACC og de vanlige prøvene ble vurdert ved hjelp av Affy QCReport pakken i Bioconductor og R statistisk språk ; alle arrays passert kvalitetskontroll beregninger. Alle påfølgende data normalisering og statistiske analyser ble gjort ved hjelp GenePattern (Broad Institute, www.broadinstitute.org) [17]. Expression array-data ble normalisert ved gcRMA med quantile normalisering, og bakgrunnen subtraksjon etter bruk av Expression File Creator [18]. Data ble deretter floored på 5,5 ved hjelp preprocess datasett, og filtrert for å fjerne 1) prober med mer enn 35 floored verdier og /eller 2) sonder der alle verdier fra en batch fikk bakoversveis mens verdiene fra andre parti ikke var. Ytterligere batch effekter ble minimert ved hjelp bekjempe med parametrisk alternativ [19]. Uttrykket data som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE19776 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE19776 ).
DNA metylering Analyse
Globalt DNA metylering ble evaluert ved bruk av infinium
® HumanMethylation450
® BeadChip Array. (Illumina, San Diego, California). Kort fortalt, en mikrogram av hvert DNA-prøve gikk bisulfite konvertering ved hjelp av EZ DNA Metylering Kit (Zymo Research, Irvine, CA) i henhold til produsentens anbefaling for Illumina infinium analysen. Bisulfitt-behandlede DNA ble deretter hybridisert til matriser i henhold til produsentens protokoll. Vi brukte GenomeStudio V2011.1 (Illumina) for metylering data montering og oppkjøp. Metylering nivåene for hvert CpG rest er presentert som ß-verdier, beregning av forholdet mellom det metylerte signalintensitet over summen av denaturert og unmethylated intensiteter på hvert locus. Gjennomsnittsverdien ß rapporterer en metylering signal som strekker seg fra 0 til 1, som representerer fullstendig unmethylated til fullstendig metylerte verdier, henholdsvis. Metylering data ble preprocessed i R ved hjelp av Illumina metylering Analyzer (IMA) pakke [20]. Data preprosessering inkludert bakgrunnskorreksjon, sondere skalering å balansere infinium I og II sonder, quantile normalisering, og logit transformasjon. En logit transformasjon konverterer ellers heteroscedastic betaverdier (avgrenset av 0 og 1) til M-verdiene etter en gaussisk fordeling. I tillegg deteksjons p-verdier 0,05 i 25% av prøvene, sonder på X og Y-kromosomer, og sonder som ligger innenfor 10 bp av antatte SNPs ble fjernet. Differential metylering analyse på logaritmisk transformerte verdier ble utført for å sammenligne 18 ACC svulster 6 normale adrenal prøvene i IMA. Wilcox rank test ble gjennomført mellom ACC og normale prøver og p-verdier ble korrigert ved å beregne den falske funnraten ved Benjamini-Hochberg metoden. Prober med justert
p-verdier
0,05, og delta β verdier ≥0.2 eller ≤-0,2 ble vurdert som statistisk signifikant og ulikt denaturert. De metylering data som er omtalt i denne publikasjonen er deponert i NCBI Gene Expression Omnibus og er tilgjengelig gjennom GEO-serien sjonsnummer GSE77871 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE77871 ).
Korrelere DNA metylering til Gene Expression ved diskretisering Method
Vi brukte vår nylig rapporterte ikke-lineær
diskretisering metode
ved å kategorisere prøver i ulike grupper basert på sonde metylering nivåer for å identifisere DNA-metylering /uttrykk sammenhenger [16]. Genuttrykk data var tilgjengelig for 14 av de 18 analyserte prøvene for metylering endringer. For hver metylering sonde, ble de 14 ACC prøvene delt inn i
hypermethylated product: (M) eller
hypomethylated
(U) grupper basert på graden av metylering forskjellig fra den gjennomsnittlige metylering nivåer av seks normal binyre prøver. Prøver med metylering nivåer
μ plakater (bety metylering nivå av normale prøver) ble klassifisert i
M
gruppe og prøver med metylering nivåer
μ
ble klassifisert som U for den gitte CpG locus avhørt av sonden. Hver sonde i metylering array med en genekspresjon sonde på Affymetrix U133 Plus 2 menneskelige genom utvalg ble analysert. Differensial genekspresjonsanalyser, sammenligne prøvene som ble kategorisert som M og U, ble utført med en
t
-test uten å påta lik varians (Matlab programvare, www.mathworks.com). Hvis et gen ble uttrykt forskjellig (FDR-korrigert
p-verdi
0,05) mellom prøver i M og U-grupper, ble CpG metylering ansett korrelert til uttrykk for at genet. En negativ korrelasjon ble definert som retningen på endringen for uttrykk og metylering i motsatte retninger (f.eks hypermethylation og tap av uttrykk, eller vice versa). En positiv korrelasjon skjedde da retningen på endringen var den samme mellom metylering og uttrykk (f.eks hypermethylation og positive uttrykk, eller hypometylering og redusert uttrykk).
For å validere våre funn rapportert i S2 tabell vi brukte RNAseq og metylering data fra 78 ACC prøver generert av TCGA. Nivå 3 RNAseq data (TPM verdier) og metylering betaverdier ble lastet ned fra TCGA Portal (https://tcga-data.nci.nih.gov). RNAseq data ble log2 transformert: log2 (TPM + 1), før videre analyse. I nivå 3 TCGA metylering data, ble noen verdier målt som «NA» og disse verdiene ble fjernet i løpet av differensial analyse. Vi gjorde ikke også inkluderer de metylering prober med 2 prøver i enten hypo- eller hyper-gruppe i analysen. Validerings Analysen ble utført ved å teste om de samme metylering sondene rapportert i S2 Tabell hadde også sammenheng med genuttrykk i TCGA ACC datasettet, når du bruker diskretisering metoden. I dagens manuskript, endret vi diskretisering metoden først beskrevet i Jung
et al
. [16] for å reflektere den lite antall prøver. I denne modifiserte fremgangsmåten, diskretisert vi prøver basert på hvorvidt en prøve var hypo eller hypermethylated sammenlignet med ikke-neoplastisk vev adrenal. For dette ble en delta-beta-verdi for hver sonde beregnet for hver tumor er metylering data når sammenlignet mot middelverdien for metylering data fra det ikke-neoplastisk vev adrenal. I denne binære diskretiseringen, ble en tumorprøve anses hypomethylated eller hypermethylated når dens delta-beta-verdien var negativ eller positiv, henholdsvis, sammenlignet med normalt vev. Siden det var tilstrekkelig prøver i TCGA datasettet, vi også utført diskretisering i henhold til den opprinnelige metoden beskrevet (referert til her som trefoldig diskretisering) av Jung
et al
. [16]. Etter at prøvene ble gruppert i U- og M-grupper ved enten binære eller ternære diskretisering, ble ekspresjons verdiene av gener med tilsvarende metylering probene testet for differensiell ekspresjon ved hjelp av Welch t-test.
hovedbane Analyse
genet liste over interesse ble lastet inn i IPA (Oppfinnsomhet
® Systems, Redwood City, California) og Core Analysis arbeidsflyten ble kjørt med standard parametere. The Core Analysis gir en vurdering av vesentlig endret trasé, molekylære nettverk og biologiske prosesser som er representert i prøvene «genet listen.
Resultater
Global metylering Oppskrifter i ACC versus Normal Adrenal
for å vurdere globale DNA metylering mønstre i ACC svulster, brukte vi 450K-metylering plattform for å sammenligne 18 ACC svulster med 6 normale binyrene prøver. Totalt sett analysen avslørte 1291 differensielt denaturert CpG loci (DML) som omfatter 629 unike gener (S1 Table). Beta-verdier ble brukt for å generere boksplott for å representere generelle metylering nivåer over DML for ACC og normal. Median samlet metylering var noe lavere i ACC (β = 0,51) enn i normal adrenal (β = 0,67) (fig 1A), noe som indikerer hypometylering i ACC (p-verdi 0,0001). Individuelle prøve boksplott av DML viste en mer homogen fordeling av metylering verdier i normale adrenal prøver i forhold til ACC som vises varierende grad av metylering mellom prøvene (figur 1B). Av alle DML, 475 ble hypermethylated og 816 ble hypomethylated. Neste vi undersøkte fordelingen av DML tvers av kromosomer, plotting fordelingen av hypo- og hyper-DML etter normalisering til kromosom lengde (tabell 1). Ifølge analyse kromosomene 5, 7, 12, og 19 hadde mest hypomethylated loci og kromosomer 11, 17, og 19 hadde mest hypermethylated loci, med kromosomer 7, 12 og 19 som har den mest generelle DML.
A) Box plot viser generelt lavere median β verdi metylering nivåer for 1291 ulikt denaturert sonder. B) Boksplott som viser betaverdier for 1291 differensielt denaturert loci for hver enkelt prøve (6 normal og 18 ACC prøver).
Neste vi undersøkte regional og funksjonell CpG distribusjon av DML i ACC . Funksjonell utdelingen relaterer CpG stilling til: transkripsjonsstartsider (TSS -200 til -1500 bp), 5-utranslaterte område (UTR), exon 1 for koding gener og gen organer. Samlet, de fleste av sonder ( 50%) ble plassert i genet organer, etterfulgt av ~ 15% av sonder som ligger innenfor 1500 bp oppstrøms TSS, med en svært lik fordeling mellom hyper og hypo DML (Fig 2A)
A) sektor~~POS=TRUNC diagrammer~~POS=HEADCOMP viser frekvensen av som hyper eller hypomethylated loci er fordelt i henhold til deres funksjonelle stilling, herunder avstand fra transkripsjonen start hotellet (TSS). B) Frekvens av DML å bli plassert i en CpG øyer, strender, hyller, eller åpent hav. Nabolaget sammenheng er en indikasjon på nærhet til et CpG island.
Regional fordeling av DML ble vurdert basert på deres nærhet til nærmeste CpG island. I tillegg til øyene, bredden er 0-2 kb fra CpG øyer, hyller er 2-4 kb unna, og åpne havområder er isolert loci uten en betegnelse. Ved sammenligning av ACC-prøvene til normale prøver, identifiserte vi de fleste DML (55,7%) var i åpen sjø, etterfulgt av øyene (21%), bredden (15,8%) og hyllene (7,5%). I tillegg ser vi at de fleste av hypermethylated loci (50,3%) ble plassert i CpG øyer i forhold til de fleste hypomethylated loci som ligger i åpent hav (77%) (figur 2B). I motsetning til alle hypomethylated loci, ble den minste prosentandel (3,92%) funnet i øyene, og den minste andelen av hypermethylated sonder (4,42%) ble funnet i hyllene.
neste utføres uten tilsyn clustering analyse (euklidsk avstand , Komplett hierarkiske clustering metoder) av DML og viste en tydelig separasjon av normale og ACC prøver med bevis for gensamlingene som er fortrinnsvis hyper eller hypomethylated i ACC (fig 3). Blant de genene mest hypermethylated i ACC var
EPHX3 Hotell og
Meis
gener, med 20% og 9,2% av mulige gener påvirkes (fig 4). Representative gener i hypomethylated klyngene er
ADCY2 Hotell og
TMEM132D
gener, som rammet 16,2% og 18,5% av sonder (fig 4).
Clustering analyse viste separasjon av ACC og normale prøver. Prøvene er på den horisontale aksen: normale prøver blir markert med en gul bar og ACC prøvene er vist med en blå bar
EPHX3 Kjøpe og
Meis
gener. er betydelig hypermethylated i ACC sammenlignet med
TMEM132D Hotell og
ADCY2
som er betydelig hypomethylated.
Identifikasjon av Metylering utfoldelse Korrelasjoner Bruke diskretisering Method
i en egen analyse, undersøkte vi metylering-uttrykk sammenhenger ved hjelp av en ikke-lineær tilnærming: referert til som
diskretisering metode
. Denne metoden bygger på det faktum at kreft prøver kan deles i to grupper i henhold til deres relative metylering nivåer for hver sonde på metylering matrisen, slik at et høyere antall korrelasjoner som skal detekteres enn ved sammenligning ved hjelp av lineære metoder. Prøvene ble enten ansett
hypermethylated product: (M) eller
hypomethylated product: (U) i forhold til en referanse (gjennomsnitt metylering nivåer fra normale prøver i denne studien) og statistisk signifikante genuttrykk forskjeller mellom prøvene i
M Hotell og
U
grupper vil foreslå en metylering-uttrykk korrelasjon på et gitt locus. Ved å bruke denne binær diskretisering metoden, identifiserte vi 763 unike CpG loci (550 unike gener) med metylering-uttrykk sammenhenger. I gjennomsnitt var det 9 prøver i
M
gruppe og 5 prøver i
U
gruppe. Det var 319 loci med positive korrelasjoner og 444 loci med negative sammenhenger. Alle CpG metylering /uttrykk korrelasjonene fra denne oppdagelsen kohorten er vist i S2 tabell.
For å validere funnene i denne studien i en uavhengig kohort av prøvene, lastet vi RNA-seq uttrykk data og matchende DNA metylering data fra TCGA portal for 78 ACC prøver. Denne prøven størrelse ikke bare mulig for oss å teste sammenhenger ved hjelp av vår modifiserte binære diskretisering metoden, men også gitt mulighet til å utnytte trefoldig metoden også. På grunn av manglende /manglende data i TCGA settet, 468 prober var tilgjengelige for binære testing av koordinert uttrykk. I tillegg har noen sonder manglet tilstrekkelig klassestørrelse (M og U), og dermed forlater 433 prober for trefoldig gruppering ut av 763 unike sonder rapportert i S2 tabell. I binær gruppering, 164/468 (35%) prober (S3 tabell) viste signifikant korrelasjon (p-verdi 0,05) med tilhørende genekspresjon verdier, og i ternære gruppering 154/433 (35,6%) sonder (S4 Table) viste signifikant korrelasjon (p-verdi 0,05)
Endringer i TP53 og WNT signalveier
for å identifisere biologiske konsepter anriket på S2 tabell, vi både visuelt inspisert listen for å identifisere åpenbare. mønstre og vi leverte genet listen til Core Analysis arbeidsflyt i IPA (oppfinnsomhet
® Systems). Betydelige funn ble sortert basert på p-verdier for å identifisere de mest karakteristiske kategorier som representerer epigenetiske regulerte gener i ACC. I kort oppsummering, de viktigste sykdommer og lidelser knyttet til gener i S2 tabell var kreft med 471 gener er representert fra vår liste (S5 tabell). De 5 øverste molekylære og cellulære funksjoner ble cellevekst og spredning, Cell morfologi, Cellular Montering og organisasjon, cellular funksjon og vedlikehold, og celledød og Survival (S6 tabell).
Bruke diskretisering metoden identifiserte vi en antall gener med metylering-ekspresjonssystemer korrelasjoner som er kjent for å være involvert i kreft, eller spesifikt ACC patogenese. Alle de genene vi påpeke nedenfor ble beriket i oppfinnsomhet Pathway Analysis under en av kategoriene nevnt ovenfor. Deres sti forening og hvorvidt de ble validert er notert på hver av tabellene nedenfor. Blant denne listen av korrelerte gener er regulatorer av TP53 veien, for eksempel:
SETD7
,
DYRK2
,
CCDC8
,
UBE2D1
,
RBM5
,
NDRG1 Hotell og
DUSP7 plakater (tabell 2, figur 5 og 6, S2-S4 Tables). I hvert eksempel ble prøver med lav metylering hadde statistisk signifikant høyere nivåer av genekspresjon og prøver med høy metylering hadde lavere nivåer av genekspresjon.
DUSP7
,
NDRG1
,
SETD7
, og
UBE2D1
ble observert å være under-uttrykt i et uavhengig datasett sammenligne ACC mRNA uttrykk til det normale binyrer, med under-uttrykket enige med den observerte hypermethylation /under-uttrykk korrelasjon [21].
for hvert gen, representerer øvre heatmap de log2 metylering verdier for 14 ACC prøver hvert normaliserte til gjennomsnittet av 6 normale adrenal prøver. Log2 metylering forholdstall 0 representerer hypermethylation og 0 representerer hypometylering. Den nedre varmekart viser ekspresjon av z-transformerte ekspresjonsnivå, hvor en verdi 0 indikerer ingen uttrykk forandring sammenlignet med gjennomsnittet ekspresjonsnivå av 14 ACC prøver. Tre gener med negative korrelasjoner ble valgt for visualisering:
CCDC8 plakater (TP53 pathway),
TBX3 plakater (WNT sti), og
PAX8 plakater (annet kjent kreft genet, som er involvert i invasjon og migrasjon). Prøver med høyere metylering (fersken-rødbrun) hadde lavere uttrykk (grønn). Prøver med lavere metylering (blå) hadde høyere ekspresjon (rød). Bare de korrelerte metylering loci og uttrykk prober vises, og prøvene er organisert etter sitt diskretisering klassifisering av M eller U for hvert gen.
For hvert gen, varmen kartet øvre representerer log2 metylering verdier ( beta) for 78 TCGA ACC prøver hver normalisert til gjennomsnittlig 6 TGEN normale adrenal prøver. Log2 metylering forholdstall 0 (rød) representerer hypermethylation og 0 (blå) representerer hypometylering. Den nedre heatmap viser genuttrykk av tilsvarende TCGA ACC prøver, log2 (TPM + 1). De samme tre gener som brukes for TGEN ACC studie (funn) ble brukt for visualisering:
CCDC8 plakater (TP53 pathway),
TBX3 plakater (WNT sti), og
PAX8 product: ( annen kjent kreft genet, er involvert i invasjonen og migrasjon). Prøver med høyere metylering (rød) hadde lavere uttrykk (grønn). Prøver med lavere metylering (blå) hadde høyere ekspresjon (rød). Bare de korrelerte metylering loci og uttrykk prober vises, og prøvene blir organisert av likheten av metylering mønstre mellom prøver for hvert gen. Som vist, alle tre gener viser samme negative korrelasjonen mellom metylering status og genuttrykk som TGEN ACC prøver
Vi har også identifisert metylering /uttrykk sammenhenger i fire Wnt signalrelaterte gener.; Dette er en annen vei kjent for å være assosiert med ACC tumorigenesis (tabell 3, S2-S4 Tables). Prøvene viser høyere metylering av
PRDM5 Hotell og
DKK3
, som begge er antagonister av WNT signalering, ble ledsaget av tap av mRNA uttrykk og vice versa. Omvendt,
TBX3 plakater (en WNT target gen) ble hypomethylated og overexpressed; disse korrelasjonene ble observert i både originale og TCGA datasett (figur 5 og 6).
WNT3 plakater (WNT ligand) var denaturert og underexpressed i 11 prøver og unmethylated og overexpressed i 3 prøver. Tap av
DKK3
mRNA uttrykk ble validert i en uavhengig, offentlig tilgjengelige datasett sammenligne ACC til normal adrenal vev [21].
Andre kreft-relaterte Gene Endringer
transkripsjonsfaktor
PAX8
, vist å være hypermethylated i andre tumortyper, i stor grad viste en negativ korrelasjon til genekspresjon, hvor hypermethylation korrelert med redusert ekspresjon (tabell 4, figurene 5 og 6, S2-S4 Tables ). Negativ metylering /uttrykk korrelasjoner ble også funnet for
HDAC4 plakater (en kromatin modifier),
ErbB3 plakater (en kjent onkogen), samt
MARCKS Hotell og
CXCR4
; gener kjent for å indusere tumorcelle invasjon og terapeutisk motstand i andre tumortyper (tabell 4, S2-S4 Tables). Rollen IGF2 og IGF signalering som er kreftframkall driver i ACC er også godt beskrevet. Våre data indikerer en betydelig metylering /uttrykk korrelasjon for
IGF2
genet. En sonde (cg04057455) ligger i genet kroppen positivt korrelert med to genuttrykk sonder (S2 Table). Den andre proben (cg08986368) som befinner seg i et CpG øy korrelerte negativt med en genekspresjon probe. Sluttresultatet ble økt uttrykk for prøver med CpG island hypometylering eller genet kroppen hypermethylation, som er konsistent med de forventede effektene av metylering på genuttrykk.
Diskusjoner
Formålet med studien var å analysere globale DNA metylering mønstre i ACC svulster i forhold til normal adrenal vev og å relatere DNA metylering endringer med mRNA uttrykk. Vår studie viste global hypometylering i ACC i forhold til normal adrenal vev. Globalt genomisk hypometylering har blitt observert over mange kreftcelletyper [22, 23], inkludert maligne adrenal svulster sammenlignet med godartet eller normal adrenal vev [14]. I samsvar med tidligere global metylering analyser, inkludert ACC, hypometylering var hyppigste i «åpent hav», bort fra CpG øyer, og hypermethylation hendelser forekommer oftest hos CpG øyer [15].
For å identifisere signifikante sammenhenger mellom metylering og genuttrykk i ACC ble en diskretisering metode som anvendes. Denne ikke-lineære metode for å identifisere sammenhenger er mer følsom enn lineære metoder, fordi det er avhengig av undergrupper av prøver med motsatte metylering trender [16]. Med denne metoden vi identifisert 550 gener med betydelig negativ eller positiv korrelasjon av metylering og genuttrykk. Genene er identifisert ved hjelp av denne metoden implisere veier kjent for å bli forstyrret i ACC som TP53, WNT, og IGF2 signalering. I tillegg klassisk tumor suppressor, andre kreftrelatert, og nye gener som ikke tidligere er innblandet i ACC ble også identifisert.
TP53
tumor suppressor er mutert i mer enn 50% av alle svulster. Genetiske endringer i
TP53
, inkludert mutasjoner (16%) [7] og epigenetisk lyddemping (sjelden sett) [24], forekommer i en lavere andel av ACC svulster. Våre siste arbeid i ACC demonstrert betydelig differensial uttrykket av gener som er involvert i TP53 kanonisk signale [8].
