Abstract
Flere epidemiologiske studier har korrelert bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) med redusert risiko for eggstokkreft, den mest dødelige gynekologisk kreft, diagnostisert vanligvis i slutten stadier av sykdommen. Vi har tidligere fastslått at pro-apoptotiske cytokin melanom differensiering forbundet gen-7 /Interleukin-24 (
MDA
-7 /IL-24) er en viktig formidler av NSAID-indusert apoptose i prostata, bryst, nyre og magekreftceller. I denne rapporten evalueres vi ulike strukturelt forskjellige NSAIDs for sine efficacies å indusere apoptose og
MDA
-7 /IL-24 uttrykk i eggstokkreft celler. Mens flere NSAID-indusert apoptose, sulindac Sulfide og diclofenac mest potent indusert apoptose og redusert tumorvekst. En kombinasjon av disse midler resulterer i en synergistisk effekt. Videre
MDA
-7 /IL-24 induksjon av NSAIDs er avgjørende for programmert celledød, siden hemming av
MDA
-7 /IL-24 ved små interfererende RNA opphever apoptose.
MDA
-7 /IL-24 aktivering fører til oppregulering av veksthemming og DNA-skader induserbar (GADD) 45 α og γ og JNK aktivering. NF-kB familie av transkripsjonsfaktorer har vært innblandet i eggstokkreft utvikling. Vi har tidligere etablert NF-kB /IKB signale som et viktig skritt for celle overlevelse i kreftceller og en hypotese om at målretting NF-kB kan forsterke NSAID-mediert apoptose induksjon i eggstokkreft celler. Faktisk, ved å kombinere NSAID behandling med NF-kB hemmere førte til økt apoptose induksjon. Våre resultater tyder på at inhibisjon av NF-kB i kombinasjon med aktivering av
MDA
-7 /IL-24 ekspresjon kan føre til en ny kombinasjonsterapi for kreft i eggstokkene
relasjon:. Zerbini LF, Tamura RE, Correa RG, Czibere A, Cordeiro J, Bhasin M, et al. (2011) Kombi effekten av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler og NF-kB hemmere i Ovarian Cancer Therapy. PLoS ONE 6 (9): e24285. doi: 10,1371 /journal.pone.0024285
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 12 april 2011; Godkjent: 05.08.2011; Publisert: 12. september 2011
Copyright: © 2011 Zerbini et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. RET er en mottaker av ICGEB post-doc. Denne forskningen ble støttet av National Institutes of Health gir 1R01 CA85467, P50 CA090381, P50 CA105009 og Hershey Foundation (TAL), NIH tilskudd 1R01 CA097318, 1R01 CA127641, P01 CA104177, Samuel Waxman Cancer Research Foundation (PBF) og Department of Defense tilskudd PC051217 og OC0060439 (LFZ). DS er en Harrison Scholar i kreftforskning og en Blick Scholar i VCU Massey Cancer Center og VCU School of Medicine. PBF holder Thelma Newmeyer Corman Chair in Cancer Research i VCU Massey Cancer Center og er en SWCRF etterforsker. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft representerer den mest dødelige gynekologisk kreft og 5
th ledende årsak til kvinner død relatert til kreft i USA [1]. Sen diagnose er en av de viktigste hindringer for å behandle kreft i eggstokkene, som nesten 70% av kvinner tilstede med et avansert stadium av sykdommen ved diagnose [2]. En rekke epidemiologiske studier har antydet at bruk av NSAID ved klinisk relevante konsentrasjoner reduserer kolorektal [3], bryst [4] og eggstokk-kreft risiko [5], [6], [7], selv om kontrovers fortsatt [8], [9 ]. En stor Målet NSAID handling er hemming av cyklooksygenase (COX), som er ansvarlig for omdanningen av arakidonsyre til prostaglandiner syrer og benytter en rekke forskjellige mekanismer. De to COX gener, COX-1 og COX-2, er nesten identiske; imidlertid, er en relevant forskjell at COX-1-ekspresjonen er konstitutiv, mens COX-2 ekspresjon er indusert av vekstfaktorer og pro-inflammatoriske stimuli [10]. NSAIDs er vanligvis klassifisert som spesifikke COX-2-hemmere eller ikke-spesifikke COX-hemmere. I eggstokkreft COX-1, men ikke COX-2 er blitt funnet å være overuttrykt [11], [12], likevel andre studier har rapportert at COX-2 er også oppregulert [13], [14]. Høy COX-1-ekspresjon i eggstokkreft sterkt korrelert med høye nivåer av vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [15], [16], [17] og steroide antiinflammatoriske midler hemmer VEGF produksjon i ovarie cancer-cellelinjer [12], [18] som angir at COX-1 kan regulere VEGF uttrykk. Angiogenese og VEGF uttrykk er innblandet i ascites formasjon [19] og metastasering av eggstokkreft [20], mens hemming hindrer ascites formasjon og hemmer spres kreft vekst [21].
Vår tidligere studie viser at NSAIDs også indusere apoptose av kreftceller via induksjon av
MDA
-7 /IL-24 uttrykk [22], noe som fører til økt uttrykk av to medlemmer av Vekst Arrest og DNA-skade 45 (GADD45) familie [23]. Den GADD45 genfamilien koder for tre strukturelt sterkt beslektede vekst arrest- og DNA-skade-induserbare proteiner, GADD45 α, β og γ spille en rolle i G2 /M sjekkpunkt som respons på DNA-skade [24]. Under normale fysiologiske forhold,
MDA
-7 /IL-24 uttrykt i celler i immunsystemet og normale melanocytter [25]. Høye nivåer av
MDA
-7 /IL-24 har vist seg å spesifikt induserer apoptose av kreftceller og derfor
MDA
-7 /IL-24 har blitt omtalt som en «magic bullet» [26], [27]. Dessuten flere studier indikerte at overekspresjon av
MDA
-7 /IL-24 ved en rekombinant adenovirus resultater i kreftcelle apoptose og terapeutiske fordeler i eggstokkreft [28], [29].
NF-kB /IkB-signalering er en annen bane som har vært implisert i legemiddelresistens og overlevelse i eggstokk-kreft [30], [31]. NF-kB /IKB vei fremstår som sentral aktør i tumorigenesis, invasjon og metastasering for ulike kreftformer [30], [31] og er et viktig skritt for kreftceller til å unnslippe programmert celledød [32]. Videre er motstanden av kreftceller overfor kjemoterapeutiske midler har vært assosiert med deregulert NF-kB-aktivering [33]. Videre har vi vist at hemming av konstitutivt aktiv NF-kB av adenovirus uttrykk for IKB induserer apoptose i prostatakreftceller og hemmer tumordannelse i SCID-mus [34].
I denne rapporten sammenlignet vi et bredt sett av NSAIDs for sine efficacies å indusere apoptose av eggstokkreft celler. Siden vår forrige studien viste en rolle for
MDA
-7 /IL-24 i NSAID-mediert celledød, evaluert vi også om apoptoseinduksjon av NSAIDs skyldes induksjon av
MDA
-7 /IL-24 uttrykk. Viral levering av
MDA
-7 /IL-24 er i dag brukt i kliniske studier for ulike kreftformer [27]. Identifisering av legemidler som er mest effektive i
MDA
-7 /IL-24 induksjon kan gi et alternativ til viral levering for å utnytte antineoplastiske effekter av
MDA
-7 /IL-24 . Vi antok også at å kombinere NSAID med hemmere av NF-kB sti kan forsterke effekten av NSAIDs mot eggstokkreft. Vi har derfor testet farmakologiske inhibitorer av NF-kB vei for deres evne til å indusere apoptose i eggstokkreft celler. Her viser vi at sulindak Herding og Diclofenac er de mest potente NSAIDs som induserer eggstokkreft apoptose via
MDA
-7 /IL-24 uttrykk og også redusere tumorvekst
in vivo
.
MDA
-7 /IL-24 uttrykk fører til GADD45α og γ oppregulering og JNK kinase aktivering. Flere farmakologiske NF-kB hemmere også indusere apoptose av eggstokkreft celler og i kombinasjon med NSAIDs potensere apoptotisk effekt av NSAIDs.
Resultater
NSAIDs er potente indusere av
MDA
-7 /IL-24 og apoptose i eggstokkreft celler
Et bredt panel av NSAIDs ble testet for sine evner til å indusere apoptose og
mda-
7 /IL-24 genuttrykk i fire eggstokkreft kreftcellelinjer, Skov-3, CAOV-3, SW626 og 36m2. Konsentrasjonene for alle NSAIDs legemidler som brukes i denne studien ble valgt til å være sammenlignbare med oppnåelige fysiologiske plasmakonsentrasjon [35] – [49]. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling av Skov-3, CAOV-3, SW626 og 36m2 eggstokkreft kreftceller med dette settet med NSAIDs, avsløre at en rekke, men ikke alle NSAIDs indusert apoptose (Figur 1a og S1 A). Konsekvent sterke indusere av apoptose i alle fire cellelinjer inkludert sulindak sulfid, Diclofenac, Ebselen og Naproxen i forhold til de løsemiddel kontrollene. Noen NSAIDs resulterte i signifikant induksjon av apoptose i en undergruppe av ovarian cancer-cellelinjer inkludert sulindak sulfon, acetaminofen, acetylsalisylsyre og Flurbiprofen, mens behandling med NS-398, Ibuprofen, Finasteride, flufenaminsyre og Meloxicam resulterte bare i marginal eller ikke apoptose-induksjon ( Figur 1a og S1 A).
Skov-tre cellelinje etter behandling med 5 mM Aspirin, 200 pM Ibuprofen, 1 mM Paracetamol, 200 pM Naproxen, 200 um NS-398, 200 mikrometer Diclofenac, 50 mikrometer Finasteride, 200 mikrometer flufenaminsyre, 40 mikrometer Meloxicam, 50 M ebselen, 20 nM Flurbiprofen, 50 mikrometer sulindak Sulfide og 50 mikrometer sulindak sulfone eller DMSO som kontroll. (A) apoptose analyse av eggstokkreft celler etter NSAID behandling. Data betyr ± S.D. av triplikate uavhengige eksperimenter for hver behandling. (B) Doseavhengig induksjon av apoptose av NSAIDs i eggstokkreft celler. Apoptose analyse av SW626 eggstokkkreftceller. Celler ble behandlet med 50, 25, 10 og 5 uM av sulindac Sulfide; 200, 100, 40 og 20 uM av diclofenac; 200, 100, 40 og 20 uM av Naproxen og 50, 25, 10 og 5 uM for Ebselen eller DMSO. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling. Data betyr ± S.D. av triplikate uavhengige eksperimenter for hver behandling. (C) Real time PCR-analyse av
MDA
-7 /IL-24 uttrykk i Skov-3 celler etter 24 timers behandling med ulike NSAIDs. Hver prøve ble normalisert til hGAPDH. (D) apoptose analyse av CAOV-3 eggstokkreft celler etter NSAID behandling eller DMSO og infeksjon med lentivirus koding
MDA
-7 /IL-24 siRNA tomannsboliger. Data betyr ± S.D. av tre eksemplarer uavhengig infeksjon for hver vektor på hver behandling.
For hver av de fire mest konsekvente indusere apoptose vi bestemt den laveste dosen som fortsatt induserer programmert celledød av eggstokkreft celler. Konsentrasjonene av de utvalgte steroide antiinflammatoriske midler ble testet på 2, 5 og 10 ganger lavere konsentrasjoner enn de fysiologisk oppnåelige doser brukt i forsøkene for figur 1a og S1A. Apoptose ble målt i eggstokkreft celler 24 timer etter behandling med forskjellige doser av de fire NSAIDs. Våre resultater viser at sulindak Sulfide, diclofenac og Naproxen konsentrasjoner selv ved 5 ganger lavere dose fortsatt effektivt indusere apoptose, mens ebselen kan reduseres bare to ganger (figur 1b).
Basert på våre tidligere observasjoner i andre typer av kreft bestemt vi om apoptose induksjon av NSAIDs korrelerer med
MDA
-7 /IL-24 induksjon. Vi målte mRNA uttrykk nivåer av
mda-
7 /IL-24 mRNA som respons på ulike NSAIDs i Skov-3 celler ved real time PCR-analyse demonstrere at
mda-
7 /IL-24 (maksimalt 12 ganger induksjon) uttrykk er ofte indusert av NSAIDs som fremmer apoptose i eggstokkreft celler (Figur 1c). Disse resultater ble også bekreftet i ytterligere to ovarie cancer-cellelinjer. I CAOV-3 og SW626 eggstokkkreft cellelinjer
mda-
7 /IL-24 er også sterkt indusert (maksimalt 77 ganger induksjon i CAOV-3 celler) (figur S1b). NSAIDs som sterkt forbedret apoptose som sulindak sulfid, naproxen, Ebselen, og diklofenak (Figur 1a) betydelig indusert
MDA
7 /IL-24 uttrykk (figur 1c), mens NSAIDs som bare marginalt indusert apoptose (Figur 1a ) ikke signifikant forbedre
MDA
-7 /IL-24 uttrykk bortsett ibuprofen som induseres
MDA
-7 /IL-24, men ikke indusere apoptose (Figur 1c).
Vi og andre har vist at overekspresjon av
MDA
-7 /IL-24 etter infeksjon med et adenovirus som bærer
MDA
-7 /IL-24 genet induserer apoptose og hemmer celledeling i kreftceller [50], [51]. For å vurdere om induksjon av apoptose i kreftceller av NSAIDs er avhengig av
MDA
-7 /IL-24 oppregulering, gjennomførte vi eksperimenter med et lentivirus som koder for en siRNA mot
MDA
-7 /IL-24 som tidligere ble generert av vår gruppe [23]. Infeksjon av SKOV-3-celler med den
MDA
-7 /IL-24 siRNA lentivirus redusert apoptose indusert av NSAID med 40-70% i forhold til kontroll lentivirus (figur 1d), noe som ytterligere støtter ideen om at NSAID- mediert apoptose er i det minste delvis avhengig av
MDA
-7 /IL-24-induksjon. De samme resultatene ble observert i CAOV-3 celler (data ikke vist).
synergieffekter av NSAID kombinasjoner
Ved hjelp av den laveste dosen av hver NSAID som rammet apoptose av eggstokkreft celler (Figur 1b ), vi systematisk analysert apoptoseinduksjon ved å kombinere lave doser av NSAIDs. Et panel av NSAIDs inkludert diclofenac, sulindac sulfid, Naproxen og ebselen ble testet for deres evne til å indusere apoptose alene og i kombinasjon. Skov-3 eggstokk-kreft-celler ble behandlet med 10 uM sulindak Sulfide, 40 pM diclofenac, 25 uM Ebselen eller 40 uM Naproxen og kombinasjoner derav. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling avsløre at flertallet av kombinasjonene av NSAIDs testet apoptose betydelig mer enn én av NSAID alene i eggstokkreft celler (Figur 2a). Visse kombinasjoner som sulindac Sulfide og diclofenac, sulindac Sulfide og Naproxen og diclofenac og Naproxen var mer effektive i apoptoseinduksjon enn andre (figur 2a). Vi har bekreftet disse resultatene i CAOV-3 og SW626 cellelinjer (figur S2). Isobologram analyse ved hjelp av kombinasjoner av Diclofenac og sulindak Herding indikerer at kombinasjoner av legemidler resulterer i en synergistisk effekt (figur 2b).
(A) apoptose analyse av Skov-3-celler etter behandling med 10 mm sulindak sulfid, 40 pM diclofenac, 25 uM ebselen eller 40 uM Naproxen og en kombinasjon derav eller DMSO. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling. Data betyr ± S.D. av triplikate uavhengige eksperimenter for hver behandling. (B) Normalisert isobologram innhentet av programvare Compusyn. CAOV-3 celler behandlet med en kombinasjon av fem mikrometer sulindak Herding og 20 mikrometer Diclofenac viser synergistisk effekt.
NSAID behandling reduserer eggstokkreft xenograft vekst i SCID-mus
For å avgjøre om NSAIDs redusere tumorvekst
in vivo
, ble Skov-3 eggstokkreft celler injisert subkutant i SCID-mus. Musene ble tilfeldig inndelt i 3 grupper og tilføres en av de tre diettene gjennom hele eksperimentet: AIN-93g som kontroll og den AIN-93g diett supplert med enten 200 ppm Sulfid sulindac eller 100 ppm diclofenac. To måneder senere ble dyrene undersøkt for tumordannelse og tumorvekten. Alle musene utviklet tumorer som tyder på at denne spesielle dosen av NSAIDs ikke forhindre tumordannelse. Imidlertid, som vist i figur 3, sulindac Sulfide og diclofenac behandling reduserte det gjennomsnittlige tumorvolumet med 30% og 20%, respektivt, når sammenlignet med kontrolldietten med en p-verdi. 0,05, noe som bekrefter dens anti-tumor effekt
For hver vaksinasjon, 2 × 10
6 Skov-3 celler ble injisert subkutant i SCID-mus. Musene ble tilfeldig inndelt i tre grupper (n = 7 /gruppe) og tilføres en av de tre diettene gjennom hele eksperimentet: AIN-93g som kontroll, AIN-93g diett supplert med 200 ppm sulindac sulfid eller AIN-93g diett supplert med 100 ppm Diclofenac. Størrelsen av tumorer og tumorvekten ble målt etter 2 måneder. Verdier ikke deler de samme bokstavene er statistisk signifikante med p-verdier på minst 0,05
Induksjon av GADD45 α og γ genekspresjon og aktivering av JNK i eggstokkreft av NSAIDs
. Vi har tidligere rapportert at induksjon av apoptose av NSAIDs er tett knyttet til induksjonen av
MDA
-7 /IL-24 ekspresjon og følgelig GADD45 α og γ oppregulering i flere kreftcellelinjer [23]. Som NSAIDs indusere
MDA
-7 /IL-24 uttrykk i eggstokkreft celler (Figur 1c og S1c), evaluert vi endringer i GADD45 α og γ genuttrykk.
For å vurdere om regulering av GADD45 gener som er involvert i NSAID-mediert apoptose, ekspresjon av GADD45 α og y mRNA ble målt ved hjelp av sanntids-PCR i SKOV-3, CAOV-3 og SW626-celler ble behandlet med NSAID. De NSAIDs med sterkest pro-apoptotiske aktivitet, inkludert sulindak sulfid, Diclofenac, Naproxen og Ebselen sterkt forbedrede GADD45 α og γ uttrykk, noe som indikerer at økt GADD45 α og γ uttrykk tett korrelerer med pro-apoptotiske aktivitet av NSAIDs (figur S3A og S3b). Lentiviral uttrykk for siRNA mot
MDA
-7 /IL-24 i eggstokkreft celler viste at knockdown av
MDA
-7 /IL-24 reduserer diklofenak-indusert GADD45 α og γ genekspresjon som indikerer at GADD45α og γ induksjon er minst delvis avhengig av
MDA
-7 /IL-24 uttrykk (figur S3c).
Siden andre, og vi hadde vist at JNK-aktivering spiller en rolle i apoptose induksjon i kreftceller og GADD45 α og γ kommuniserer med oppstrøms kinase av JNK, MTK1 [52], evaluerte vi aktivering av JNK i løpet av NSAID-mediert apoptose. JNK-kinase-aktivitet ble testet i proteinekstrakter oppnådd fra CAOV-3 og SKOV-3-celler behandlet med sulindak sulfide (50 jiM), Diclofenac (200 uM) eller DMSO i 24 timer ved en
in vitro kinaseanalyse
. Western blot-analyse avslørte meget lite JNK-aktivitet i ubehandlede kontrollceller og en sterk økning i JNK-aktivitet i begge cellelinjer ved behandling med sulindak Sulfide og diclofenac (figur 4a og 4b). Bekreftende dette bevis en svak inducer av
MDA
-7 /IL-24, GADD45 α og γ og apoptose, Flurbiprofen, viste bare en marginal induksjon av JNK aktivitet (data ikke vist). For å belyse den funksjonelle relevansen av GADD45 α og γ og
MDA
-7 /IL-24 for NSAID-mediert JNK induksjon og apoptose i eggstokkreft, JNK kinase aktivitet ble testet i proteinekstrakter hentet fra
CAOV -3
celler behandlet med sulindak Herding og Diclofenac og infisert med lentivirus koding siRNA mot GADD45 α og
MDA
-7 /IL-24 gener. Western blot analyse viste JNK kinase aktivering av sulindak Herding og Diclofenac var markert avhengig GADD45 α og
MDA
-7 /IL-24 induksjon, siden JNK kinase aktivitet i sulindak Herding og Diclofenac behandlet
MDA
-7 /IL-24 – /- celler ble avskaffet i forhold til
MDA
-7 /IL-24 + /+ celler (figur 4b). For ytterligere å karakterisere virkningen av NSAIDS å indusere apoptose, ble nivåene av PARP-aktivering målt ved Western-blot og indikerer at sulindac Sulfide og diclofenac er sterke indusere av PARP-spaltning (figur S4a).
(A ) Total lysat før Immunpresipitasjon. (B) Kinase analyse som viser induksjon av JNK kinaseaktivitet av NSAIDs. Induksjon av JNK-aktivering av sulindac Sulfide og diclofenac ble analysert i cellelysatene fra SKOV-3 og CAOV-3-celler behandlet med 50 uM sulindak Sulfide, 100 uM diclofenac eller DMSO ved hjelp av SAPK /JNK assay kit (Cell Signaling). (C) Western Blot analyse ved å bruke anti-fosfo JNK-antistoff fra cellelysater fra CAOV-3-celler behandlet med 50 uM sulindak Sulfide, 100 uM diclofenac eller DMSO og infeksjon med lentivirus koding
MDA
-7 /IL-24 siRNA, GADD45α og GFP tomannsboliger.
kombi~~POS=TRUNC behandling av farmakologiske hemmere av NF-kB vei med NSAIDs indusere apoptose i eggstokkreft celler
Vi undersøkte den biologiske relevansen av NF- kB sti i eggstokkreft celler og bestemt de funksjonelle konsekvensene av sin hemming. Istedenfor å bruke adenovirus levering av IkB-inhibitoren beveget vi mot en mer klinisk relevant modell og brukt farmakologiske inhibitorer av NF-kB pathway. Inhibitorer av NF-kB veien ble testet for deres evne til å indusere apoptose i eggstokkreft celler. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling av SKOV-3, CAOV-3 og SW626 eggstokkreft celler med fire forskjellige inhibitorer av NF-kB, 5 nM 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin [53], 50 uM Isohelenin [54], 50 uM IKK-2 inhibitor SC-514 [55], og 200 uM IKK-inhibitor II Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroksy-coumestan) [56] eller DMSO (kontroll). 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin var et effektivt induserer apoptose i alle tre cellelinjer, og IKK-inhibitor II Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroksy-coumestan) indusert apoptose i to av de tre cellelinjene. Behandling med Isohelenin eller IKK-2 inhibitor SC-514 resulterte i bare marginal eller ingen induksjon av apoptose (figur 5a). I tillegg indikerer Sanntids-PCR analyse som Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroksy-coumestan) induserer sterk aktivering av GADD45 α og γ genekspresjon (figur S4B), og fremmer JNK-fosforylering (figur S4C) og spalting av PARP (Figur S4a).
(A) Farmakologisk NF-kB hemmere indusere apoptose i eggstokkreft celler. SW626, CAOV-3, og SKOV-3-celler etter behandling med 5 nM 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin (6-amino), 50 uM Isohelenin, 50 uM IKK-2 inhibitor SC-514, og 200 uM IKK-inhibitor II Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroksy-coumestan) eller DMSO som kontroll. Data betyr ± S.D. av triplikate uavhengige eksperimenter for hver behandling. (B) Dose-avhengig induksjon av apoptose av NF-kB-inhibitorer i eggstokkreft celler. Apoptose analyse av Skov-3 eggstokkreft celler. Celler ble behandlet med 5, 2,5, 1 og 0,5 nM av 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin (6-amino) -50, 25, 10 og 5 uM av Isohelenin, 50, 25, 10 og 5 uM IKK-inhibitor II Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroksy-coumestan) (Wedelolactone), 50, 25, 10 og 5 uM av IKK-2 inhibitor SC-514 eller DMSO. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling. Data betyr ± S.D. av triplikate uavhengige eksperimenter for hver behandling. (C) apoptose i eggstokkreft celler etter NSAID behandling i kombinasjon med NF-kB hemmere. SW626, CAOV-3, og SKOV-3-celler etter behandling med 10 uM sulindak Sulfide, 40 pM diclofenac, 25 uM Ebselen, 40 uM Naproxen, 1 nM 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinazolin (6-amino), og 200 uM IKK-inhibitor II Wedelolactone og en kombinasjon derav. Apoptose ble målt 24 timer etter behandling. Data betyr ± S.D. av triplikate uavhengige eksperimenter for hver behandling. (D) Normalisert isobologram erholdt ved programvare Compusyn. CAOV-3-celler behandlet med en kombinasjon av 10 uM sulindac Sulfide og 2,5 nM 6-amino viser synergistisk virkning.
Som for NSAID vi utført en doseresponsanalyse for 6-amino-4- ( 4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin og Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroxy-coumestan) for å bestemme den laveste dosen som fortsatt induserer programmert celledød av eggstokkreft celler. Å redusere konsentrasjonen av 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin fra 5 nM til 1 nm fortsatt indusert apoptose, mens lavere doser Wedelolactone resulterte i tap av apoptose induksjon (figur 5b).
For å finne ut vidt NF-kB-inhibitorer 6-amino-4- (4-phenoxyphenylethylamino) kinazolin og Wedelolactone (7-metoksy-5,11,12-trihydroksy-coumestan) forbedre de pro-apoptotiske aktivitet av steroide antiinflammatoriske midler vi kombin de laveste dosene av hvert av de fire NSAID, sulindac Sulfide, Diclofenac, ebselen, og Naproxen med de laveste doser av de to NF-kB-inhibitorer som fortsatt induserer apoptose (figur 1b og 5b, henholdsvis). De NSAID og NF-kB-inhibitorer ble testet for deres evne til å indusere apoptose alene og i kombinasjon. Skov-3, CAOV-3, og SW626 eggstokkreft celler ble behandlet med 10 uM sulindak Sulfide, 40 pM diclofenac, 25 uM Ebselen, 40 uM Naproxen, 1 nM 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinazolin og 200 uM Wedelolactone . Apoptose ble målt 24 timer etter behandling avslørende at kombinasjoner av NSAID med NF-kB-inhibitor 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinazolin betydelig forbedret apoptose i eggstokkreft celler sammenlignet med hvert av medikamentene alene (figur 5c). I motsetning til dette, Wedelolactone forbedret pro-apoptotiske virkninger av bare noen av NSAIDs og mindre effektivt i SKOV-3-celler (figur 5c). Isobologram analyse indikerer at kombinasjonen av 6-amino-4- (4 phenoxyphenylethylamino) kinazolin med sulindak Sulfide resulterer i en synergistisk effekt (figur 5d).
Diskusjoner
NSAIDs har dukket opp som potensielle medikamenter for chemoprevention i kreft, men deres fordeler er fortsatt aktuelle. Noen tradisjonelle NSAIDs som sulindak er under utprøving i kliniske studier for ulike kreftformer. Faktisk prekliniske studier gir bevis for at i overensstemmelse NSAIDs effektivt kan hemme tumorigenesis særlig ved inhibering av cyklooksygenase-2 (COX-2). Viktigere, har aspirin bruk vært assosiert med en redusert risiko for fjernt brystkreft og brystkreft død [57].
Epidemiologiske studier indikerer invers sammenheng mellom bruk av ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAID) og forekomsten av eggstokk-kreft [5], [6], [7]. Flere rapporter tyder på at visse NSAIDs indusere apoptose og cellesyklus arrest i menneskelig eggstokkreft celler, men det nøyaktige molekylære mekanismen som NSAIDs indusere antitumorigenic aktivitet er ikke klart. Tidligere våre grupper beskrevet en roman sti der NSAIDs indusere apoptose og vekst arrest i kreftceller. Vi har vist at induksjon av de pro-apoptotiske cytokin MDA-7 /IL-24 ved hjelp av NSAIDs er avgjørende for programmert celledød indusert av NSAIDs [23]. Men denne studien ikke inkluderer eggstokkreft celler.
Flere rapporter ved hjelp av en adenovirus som koder for den
MDA
-7 /IL-24 genet (Ad
MDA
-7 ) viser sin dype og selektiv anticancer-aktivitet i dyremodeller [26], [27], [50], [58], [59], [60], inkludert en rapport for selektiv celledød av eggstokkreft celler som resulterer i undertrykkelse av tumorvekst
in vivo product: [58]. Imidlertid forbigående ekspresjon, potensielt uønskede immunreaksjoner (mediert av adenovirus) og problemer med systemisk levering begrense den generaliserte bruken av adenoviral levering av
MDA
-7 /IL-24, spesielt når administrert systemisk som et ikke-replikerende adenovirus.
i denne sammenheng våre funn at NSAID med anti-canceraktivitet indusere høye nivåer av
MDA
-7 /IL-24 i eggstokkreft celler tilveiebringe en ny terapeutisk strategi for å forbedre
MDA
-7 /IL-24 nivåer på et systemisk nivå. Faktisk har vi fått en omfattende oversikt over konsekvensene av en hel panel av NSAIDs på eggstokkreft celle overlevelse ved å sammenligne sine efficacies å indusere apoptose og
MDA
-7 /IL-24 uttrykk. De mest potente indusere av
MDA
-7 /IL-24 genekspresjon inkluderer sulindak Herding og Diclofenac. Våre funn samsvarer med tidligere rapporter som viste at behandling av humane lunge tumorxenotransplantater i hårløse mus med Ad
MDA
-7 i tillegg til sulindak redusert tumorvekst mer effektivt enn Admin
MDA Anmeldelser – 7 [50]. Videre disse resultatene underbygge våre tidligere funn om at apoptose induksjon av den pro-apoptotiske cytokin
MDA
-7 /IL-24 formidler induksjon av GADD45 α og γ uttrykk og JNK aktivitet i andre typer kreft [23]. Mens sulindak Herding og Diclofenac selv kan ikke være den ideelle medikamenter for å indusere
MDA
-7 /IL-24 og apoptose i eggstokkreft celler, og spesielt Diclofenac utløser mange bivirkninger hos pasienter som begrenser bruken av kreftpasienter , bør det være mulig å generere modifiserte versjoner av disse stoffer som er mer potente i deres anti-kreft aktivitet og med reduserte uønskede og off-target-effekter. Faktisk er en modifisert versjon av sulindak er nylig blitt rapportert å være mer aktive mot kreftceller uten å inhibere COX 1 og 2 [61].
Diclofenac har tidligere blitt vist å indusere apoptose i tykktarm og platecelle-karsinom og for å hemme bukspyttkjerteltumorvekst [62], [63]. Imidlertid finnes det ingen rapporter om sin bruk i eggstokkreft. Her viser vi at Diclofenac samt sulindak Herding indusere apoptose og hemme tumorvekst av eggstokkreft. Disse oppsiktsvekkende data forsterke forestillingen om de potensielle fordelene ved NSAID behandling for eggstokkreft.
Vi identifiserte også Naproxen og Ebselen som moderate induserer apoptose og
MDA
-7 /IL-24 uttrykk i eggstokkreft celler. Mens Naproxen bidrar til å forebygge urinblæren og colon carcinogenesis [64], og ebselen vist seg å redusere cisplatinbehandling toksisitet hos rotte eggstokkreft modeller, noe som forbedrer anti-tumor-aktivitet og forbedrer dødelighet, sykelighet og utfall [65]. Som nevnt før, har vi rapportert at induksjon av
MDA
-7 /IL-24 ved strukturelt ulike NSAIDs er avgjørende for apoptose induksjon av bryst, prostata, nyre og magekreftceller [23]. Men i denne tidligere studie, Naproxen og Ebselen hadde kun marginale effekter på apoptose induksjon. I denne rapporten, observerte vi ulike legemiddel aktiviteter for Naproxen og Ebselen. Ebselen og Naproxen indusert apoptose og
MDA
-7 /IL-24 uttrykk i eggstokkreft celler og også synergized med de mer potente NSAIDs, Diclofenac og sulindak sulfid, tyder potensiell klinisk nytte i eggstokkreft terapi.
Vi har tidligere vist at inhibering av NF-kB i kreftceller øker apoptose uten å fremme
MDA
-7 /IL-24 produksjon [23]. En av de store transkripsjonskretsene involvert i inflammasjon er NF-kB /IkB sti [66]. Videre har NF-kB vært implisert i kreft celleoverlevelse og flukt fra programmert celledød og aktiveres av kjemoterapeutiske midler i kreftceller [30], [31], [33]. Mutasjoner i andre gener av NF-kB veien og konstitutivt aktiv NF-kB er ofte observeres i forskjellige typer av kreft [33]. Faktisk eggstokkreft kreftceller ofte inneholder aktivt NF-kB før behandling, og er derfor forventet å være resistent mot kjemoterapi
a priori
. 5′CTGTCTAGACAAAAACTTTGTTCTCATCGTGTCATCTCTTGAATGACACGATGAGAACAAAGGGGGATCTGTGGTCTCATACA-3′.
Animal
