Abstract
Identifisere nye kreft biomarkører er viktig for påvisning tidlig kreft som det kan redusere dødelighet. Kreft secretome, innsamling av alle makromolekyler utskilt av en tumorcelle, forandrer sin sammensetning i forhold til normalt vev, og denne endringen spiller en viktig rolle i den observasjon av kreft progresjon. Samlingen og nøyaktig analyse av kreft secretomes kan føre til oppdagelse av nye biomarkører, og dermed forbedre resultatene av kreftbehandling. Vi uventet oppdaget at enzym instruert selvbygging (EISA) av D-peptid hydrogelator resultater i nanonets /hydrogel rundt kreftceller som overuttrykker ectophosphatases. Her viser vi at disse nanonets er i stand til raskt å samle proteiner i pericellulær plass (dvs. nær overflaten) av kreftceller. Fordi de sekretoriske stoffer er på sitt høyeste konsentrasjon nær celleoverflaten, til bruk av pericellulær nanonets samle kreft secretome maksimerer utbyttet og kvaliteten på prøvene, reduserer pre-analytiske variasjoner, og gjør at den dynamiske profileringen av secretome prøver. Dermed har denne nye tilnærmingen stort potensial i å identifisere den heterotypic signale i tumor microenvironments dermed bedre forståelse av kreft microenvironments og akselererende oppdagelsen av potensielle biomarkører i kreft biologi. Dataene er tilgjengelige via ProteomeXchange med identifikator PXD003924
Citation. Zhou R, Kuang Y, Zhou J, Du X, Li J, Shi J et al. (2016) Nanonets Samle Cancer Secretome fra pericellulær Space. PLoS ONE 11 (4): e0154126. doi: 10,1371 /journal.pone.0154126
Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA
mottatt: 31 august 2015; Godkjent: 09.04.2016; Publisert: 21 april 2016
Copyright: © 2016 Zhou et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet er delvis støttet av National Institutes of Health (R01CA142746), Kenneth Rainin Foundation og National Science Foundation stipend (DMR-1420382). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
som kreft er en av de mest kostbare og dødelige sykdommer for folkehelsen (f.eks anslår NIH at de totale kostnadene for kreft i 2008 var $ 201 500 000 000 [1]), tidlig oppdagelse av kreft, vanligvis resulterer i mindre omfattende behandling og bedre total utfall, er en optimal løsning for å betydelig redusere kostnadene og redde liv. Faktisk har betydelig innsats fokusert på oppdagelsen av kreft biomarkører. Mens secretome er definert som den samling av alle makromolekyler utskilt av en celle, kreft secretome forskjellig sammensetning fra den secretome av normale vev på grunn av spesifikke genetiske mutasjoner i kreftceller. I prinsippet er kreft secretome en skattekiste av kreft biomarkører. [2] Men den definitive identifisering av kreft biomarkører er fortsatt en stor utfordring fordi proteinene i kreft secretome, nøkkelløselige bestanddeler av kreft microenvironments, [3,4] er
dynamisk og kompleks
. Dessverre, konvensjonelle metoder (f.eks betinget media (CM)) med å samle kreft secretome har sine begrensninger, og har ikke plass til dynamikken og kompleksiteten av kreft secretome. Under vår forskning på enzym-katalyserte dannelsen av supramolekylære nanofibrils, [5-12] vi uventet oppdaget at nanonets /hydrogel av et lite D-peptid selektivt dannes i pericellulær løpet av visse kreftceller på grunn av deres overekspresjon av ectophosphatases [12,13 ]. Ettersom D-peptider som motstår fordøyelse av proteaser, er D-peptid basert nanonets /hydrogel stabil og kan felle utskilte molekylene (fig 1A-1C). Således, pericellulær dannelse av D-peptid-baserte nanonets /hydrogel gir en ny mulighet i samplingsprosessen ved å utnytte biologiske forskjeller mellom kreft og normale celler.
(A) defosforylering av forløperen snu i hydrogelator nær celleoverflaten (dvs. pericellulær plass) ved ectophosphatases. (B) Den selvbygging av hydrogelators danner nettverk av nanofibrils. (C) Illustrasjon av beslaglegging av kreft secretome ved nanonets /hydrogeler dannet i pericellulær plass av kreftceller. (D) Flytskjema av bruken av pericellulær nanonets /hydrogel for å samle proteiner i kreft secretome.
Vårt studium viser at i løpet av 2-4 timer, den pericellulær nanonets /hydrogel ikke bare samler mer av de totale utskilte proteinene fra HeLa-celler enn kondisjonerte medier gjør (for eksempel media dyrket med kreftceller i 24 timer), men reduserer også pre-analytiske variasjoner og lar den tidsmessige profilering av kreft secretome prøver. Som en kraftig teknikk for rask og selektiv samling av kreft secretome, bruk av nanonets av D-peptidet, og dermed tjener som en mye nødvendig generell prøvetakingsmetoden i pericellulær plass, hvor sekretoriske stoffer er på sitt høyeste konsentrasjoner. Innenfor denne tilnærmingen bruker pericellulær nanonets, vår undersøkelse av tidsmessige profiler av kreft secretome gir også observant innsikt i dynamikken av kreft secretome, som kan være et nyttig verktøy når det brukes sammen med andre kvantifisering metoder (for eksempel SILAC), og til slutt avduke klinisk verdt kreft biomarkører for påvisning og behandling av kreft. I tillegg kunne tilnærmingen etablert i dette arbeidet bidra til å utvikle nye metoder for å samle sekretoriske signalstoffer (f.eks exosomes [14] og mirnas [15])
in vitro Hotell og
in vivo
, slutt å bringe ny forståelse til kreft biologi og klinisk arbeid.
eksperimentelle prosedyrer
Byggeklosser av nanonets /hydrogel
Basert på vår tidligere forskning på dannelsen av pericellulær nanofibers /hydrogel på kreftceller, [12] vi brukte et par forløper /hydrogelator for enzymatisk dannelse av pericellulær nanonets /hydrogel via selvbygging. Forløperen av det hydrogelator er en naftalen (Nap) avkortet tripeptid som består av D-aminosyrerester og er fosforylert på tyrosin-rest, Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (PO
3 H
2) (1
p). Ved defosforylering, blir forløperen til Nap-D-Phe-D-Phe-D-Tyr (1), som selv setter sammen i vandig fase for å danne en hydrogel. [16] overekspresjon av ectophosphatases kreftceller muliggjør selv- montering av en rundt cellene til å danne nettverk av nanofibrils (dvs. nanonets). I vårt tidligere arbeid, [12] har vi vist at pericellulær nanonets dannes på overflaten av HeLa-celler i løpet av 2 timer med inkubering med 1
p (400 ug /ml). Vi fulgte vår forrige prosedyre ved oppløsning av forløper en
p i DDH
2o med justering av pH til 7,4 ved tilsetting av 1N NaOH å produsere stamløsning.
Innsamling av nanonets /hydrogeler eller medium i komplett medium
3 x 10
5 av HeLa-celler i 2 ml komplett MEM medium ble podet inn i en 35 mm petriskål. Etter 24 timers inkubasjon ble mediet fjernet, og cellene ble vasket med 2 ml friskt komplett MEM medium en gang. For oppsamling av nanonets /hydrogeler, 1 ml komplett MEM medium inneholdende 1
p på 400 mikrogram /ml (fortynnet fra en 20X stamløsning av 1
p i PBS-buffer, fremstilt umiddelbart før bruk) ble tilsatt for å erstatte kulturmediet. Etter 2 timers inkubasjon ved 37 ° C, ble fatet anbragt i et 4 ° C plass i 5 minutter. Parabolen var på skrå og agitert for å samle de frittliggende nanonets /hydrogeler i medium. Ved hjelp av en vid åpning overføring pipette, samlet vi mediet inn i et 1,5 ml Eppendorf-rør og sentrifugert ved 7500 rpm i 1 minutt. Suspensjonsmediet ble forsiktig fjernet ved anvendelse av en 200 ul pipette for å tilveiebringe nanonets /hydrogeler (figur 1D, også to klipp av video (S1 Video og S2 video) å registrere samlingen av nanonets og medium kan finnes i bære filer) for gel elektroforese. For oppsamling av medium til cellene ble det tilsatt 1 ml komplett MEM medium uten en
p, og cellene ble inkubert ved 37 ° C i 2 eller 24 timer. 100 ul av mediet ble samlet opp etter inkubering. For hvert av forsøkene ble prøven oppnådd fra det samme parti av cellene. Både nanonets /hydrogeler og mediet ble umiddelbart frosset ved -80˚C etter samlingen. Den ekstra kontrollforsøk 2h_N ingen celler og dynamiske profilerings eksperimenter følger samme prosedyre for innsamling nanonets /hydrogel. Detaljene i disse eksperimentene er beskrevet i S1 Fil.
SDS-PAGE
18 ul av hver prøve ble blandet med 12 ul av 2X Laemmli lastebuffer. Løsningene ble blandet og inkubert ved 95 ° C i 5 min. 15μL av løsningen ble anvendt for SDS-PAGE. Prefabrikerte 4-20% gel i tris-HCl (10 brønn, 30 ul) ble anvendt. Gelen ble kjørt ved en konstant spenning på 200 V.
Massespektrometri analyse og database søk
For proteinmasse analyse ble gelen farget av Coomassie. Hvert kjørefelt ble skåret i tre seksjoner med molekylvekt varierer på: 250-80 (250-75); 80-40 (80-37); 40-10 kDa. Gel-bånd ble skåret ut med så lite overskudd av tom gel som mulig, og ble plassert i en mikro sentrifugerør med DDH
2O. Prøvene ble lagret i Eppendorf-rør og sendt til Taplin massespektrometri Facility (TMSF av Harvard Medical School) for analyse. Bildene av gel før fjerning av gelbåndene ble sendt inn (kopi og elektronisk) sammen med prøven. Prøven forberedt for protein massespektrometri er 10 mikrogram per kjørefelt. Massespektrometri og protein identifikasjon ble utført av TMSF.
Alle proteiner ble identifisert ved SEQUEST (databasen søkealgoritme, https://thompson.mbt.washington.edu/sequest) fra massen spec resultater og spådd fragmentering mønster av peptidet. Den SEQUEST utgang informasjonen ble gitt av TMSF, inkludert peptidsekvenser, XCorr (krysskorrelasjon), ΔCn (delta korrelasjon), antall unike og totale peptider, og totale spektrum teller. De SEQUEST resultatfiler konverteres til gyldig PRIDE XML for å forelegges offentlig tilgjengelig PRIDE database av PRIDE omformer [17]. De massespektrometri proteomikk data har blitt avsatt til ProteomeXchange Consortium via PRIDE [18] partner depotet med datasettet identifikator PXD003924 og 10,6019 /PXD003924.
Resultater
Tid for innsamling og celle kompatibilitet av nanonets
for å velge den optimale inkubasjonstiden for innsamling av nanonets ble HeLa-celler inkubert med en
p for 3-9 timer og mengden av tubulins (en markør for autolyse av celler) [ ,,,0],19] i nanonets ble sammenlignet med det samme volum (20 ul) fra CM samlet opp etter 24 timer inkubering. De innsamlede etter 3 eller 6 timers inkubasjon nanonets inneholder mindre tubulin enn at samlet etter 24 CM (Fig A i S1 figur), noe som antyder at de innsamlede innen 6 timers inkubasjon nanonets inneholder mindre proteiner som følge av autolyse. I et annet eksperiment, tester vi levedyktighet av celler etter nanonet samling (4 timers inkubasjon med en
p) og finner ut at kuldesjokk og mellom fjerning knapt bevege noen endring i levedyktigheten av cellene (Fig B i S1 figur). Disse resultatene bekrefter at kuldesjokk å samle nanonets innen 6 timer inkubasjon med cellene er egnet for oppsamling av secretome.
Høyere kvantitet og kvalitet av secretome samles inn av nanonets
For å vise at pericellulær nanonets kan raskt samle sekretoriske proteiner, vi gjennomfører 3 eksperimentelle innstillinger for samme inkubasjonstid 2t: først, pericellulær nanonets samlet inn fra HeLa celler behandlet med 1
p i fullstendig kulturmedium (2h_N); andre, komplett medium inkubert med HeLa-celler (2h_CM) for sammenligning; og til slutt, komplett medium behandlet med 1
p og 0,1 U alkalisk fosfatase uten HeLa-celler (2h_N ingen celler) som en kontroll. Uten ytterligere behandling, vi direkte bruke elektroforese til prøvene. De selv montert nanonets distansere til monomere en ved å blande med Laemmli lasting buffer. På grunn av sin lille molekylvekt (643 Da), 1 går ut av gelen og har liten skadelig effekt på fargingen eller den ytterligere proteinanalyser av gelen. Som vist i figur 2A, til tross for at maskert av serumproteiner (for det meste bovine albuminer), sølvfarging av SDS-PAGE av begge forsøk med 2h_N og 2h_CM avslører at 2h_N har mørkere flekker enn 2h_CM gjør. Bilde J [20] analyse viser at, i begge studier, båndene 300, 160 og 13 kDa alle har tydeligvis høyere tetthet i 2h_N enn i 2h_CM, noe som illustrerer at det er flere proteiner i disse båndene i 2h_N (Fig 2B) . Imidlertid bånd ved 55 kDa, som består for det meste av bovint serumalbumin fra kulturmediet, har en høyere tetthet i 2h_CM enn i 2h_N i prøve I og har de tilsvarende tetthet i 2h_CM og 2h_N i prøve II. Disse resultatene tyder på at de ytterligere proteiner som er samlet inn av nanonets er de sekretoriske proteiner fra HeLa-celler i stedet for serumproteiner fra dyrkningsmediet. Som vist i figur 2C, viser massespektrometri av tandem-proteinet mer
samlede peptider
og
unike peptider
(peptid som bare finnes i en protein i human proteom-) i 2h_N (1995 og 963 (prøve i), 1952 og 990 (prøve II)) enn i 2h_CM (1401 og 603 (prøve i), 1593 og 714 (prøve II)) og 2h_N ingen celler (1209 og 784). I tillegg inneholder 2h_N også betydelig flere
totale proteiner Hotell og
identifisert proteiner plakater (proteinet med 2 eller flere unike peptider) enn 2h_CM og 2h_N ingen cellene (figur 2D). Disse resultatene er enig med observasjon i sølv farget SDS-PAGE som 2t N inneholder mer proteiner enn CM samlinger.
(A) Silver farget SDS-PAGE viser proteinene i HeLa secretome hentet fra pericellulær nanonets etter to h inkubasjon av forløperne med cellene (2h_N) og oppsamlet ved sentrifugering av kondisjonert medium etter 2 timers inkubering (2h_CM). Et stykke av hydrogel (Gel) satses for SDS-PAGE og farget som bakgrunn. (B) Relativ densitet av proteinbånd av 2h_N og 2h_CM i de to studier, med molekylvekt på 300, 160, 55 og 13 kDa. (C) I henhold til protein LC-MS /MS, antall total peptid og unikt peptid observert fra proteiner av HeLa secretome oppnådd i 2h_N, 2h_CM, og proteinene i 2h_N ingen celler. (D) Tall totalt protein og identifisert protein (unikt peptid nummer ≥2) [21,22] observert fra protein LC-MS /MS i HeLa secretome oppnådd i 2h_N og 2h_CM i to studier og proteiner i 2h_N ingen celler. (E) Korrelasjonen av de unike peptid treff proteiner oppdaget i 2h_N fra de to forsøkene. (F) Korrelasjonen av de unike peptid treff proteiner oppdaget i 2h_CM fra de to forsøkene. (G) Sammenligning av identifiserte proteiner mellom 2h_N og 2h_CM (de oppførte proteiner er identifisert i begge studier av 2h_N eller 2h_CM). HeLa secretome rapportert i litteraturen [23] fungerte som referanse. (H) Analyse av de 122 proteinene identifisert i begge forsøk med 2h_N. Den subcellulære stedsinformasjon av proteiner ble samlet inn fra Uniprot. (I) Sektordiagrammer representerer molekylære funksjonelle profiler av proteiner i secretome innsamlet av pericellulær nanonets fra HeLa-celler 2h_N og dyrkingsmedium etter 2h inkubasjon 2h_CM. De spådde sekretoriske egenskapene til proteiner ble analysert ved Secretome 2.0 og funksjonelle klassifisering ble analysert ved PANTHER.
Mens 2h_N studier har 161 og 181 identifiserte proteiner, bare 144 proteiner er identifisert i 2h_N ingen celler rettssaken, betydelig mindre enn tidligere forsøk med HeLa-celler. Mangelen på identifiserte proteiner som er forventet fordi fraværet av HeLa-celler i denne kontrollforsøk ikke ville resultere i cancer secretome. De 2h_CM forsøk på den annen side, har 128 og 108 identifiserte proteiner, som er litt mindre enn 2h_N ingen celler prøve. En mulig forklaring på den unikt protein forskjellen mellom de nanonets og CM kunne være potensielle konsentrere effekten av nanonets. Det er mulig at nanonets ha en viss affinitet til lav konsentrasjon proteiner som finnes i pericellulær plass og medium. Dette berikelse fra nanonets kan føre til at noen identifiserte proteiner i resultatene. I tillegg analyserer vi overlapping av identifiserte proteiner mellom 2h_N ingen celler, 2h_N og 2h_CM. Den gjennomsnittlige overlapping mellom 2h_N ingen celler og 2h_N er 84 proteiner, 30% (89 proteiner, 30% for stien jeg og 79 proteiner, 29% for trail II). Den gjennomsnittlige overlapping mellom 2h_N ingen celler og 2t CM er 63 proteiner, 37% (60 proteiner, 37% for stien jeg og 66 proteiner, 36% for trail II). Denne ekstra kontrollen eksperimentet beviser at selv om nanonets kan ha en konsentrere effekt, nanonets dannet på kreftcelleoverflaten fortsatt felle nok secretome å oppveie mulig påvirkning fra mediet berikelse.
For å evaluere pre-analytiske variasjon mellom de to metodene, nanonets og CM, plotte vi identifiserte proteiner i to studier (utført av forskjellige operatører) av antall unike peptider (dvs. antall unike foreldre ioner) [24] av proteiner. Som vist i figur 2E og 2F, den lineære regresjon av de identifiserte proteiner i de to studier med 2h_N har en R «sup> 2-verdi på 0,77, noe som er signifikant høyere enn den av de to forsøk med 2h_CM (R» sup> 2 -verdi = 0,47), noe som indikerer reproduserbarhet mellom de to studier med 2h_N er mye høyere enn for 2h_CM. Dessuten er sammenligningen av den unike peptidet antall proteiner observert i både 2h_N og 2h_CM indikerer at de fleste av disse proteiner har flere unike peptider detektert i 2h_N enn i 2h_CM, noe som bekrefter at pericellulær nanonets samle mer sekretoriske proteiner enn CM gjør.
i tillegg 67 av de totale proteiner identifisert i begge studier av 2h_N (122 proteiner) og i begge forsøk med 2h_CM (81 proteiner) (figur 2G) er identiske (tabell A i S1 tabell). Ved å utforske den protein-protein interaksjon nettverk [25] av disse 67 proteiner (S2 Fig), finner vi at de fleste (50 proteiner, 75%) er actins, Serpins, kollagen, tubulins og deres samspill proteiner. Til tross for at cytosolic opprinnelse, actins, tubulins og Serpins er ofte til stede i secretome av menneskelige celler, inkludert kreftceller, [26,27] som er enig med den karakteristiske av ukonvensjonelle protein sekresjon. [27] I tillegg til disse 67 proteiner, inneholder 2h N 55 ekstra proteiner (tabell B i tabell S1), og 45 av dem er angivelig forbundet med progresjon av visse typer kreft. Blant de 55 proteinene ble observert bare i 2h N, er 50 av dem blitt observert i secretome andre kreftceller. Det er imidlertid bare 27 av de 55 proteiner har blitt dokumentert i secretome av HeLa-celler (oppnådd fra ultrafiltrert CM av HeLa-celler inkubert med serumfritt medium). [23] På den annen side, har 2h_CM bare 14 tilleggsproteiner, annet enn de 67 delte proteiner (tabell C i S1 tabell). Disse resultatene indikerer at 2h_N er mer følsomme i å samle sekretoriske proteiner enn 2h_CM. Interessant, bare 34,4% av de 122 identifiserte proteiner i 2h_N er sekretoriske proteiner, og mesteparten av resten er intracellulære proteiner, som kategorisert ved Uniprot. [28] Imidlertid viser funksjonen basert prediksjon at over 60% av de proteiner er sekretoriske proteiner, klassisk (ved SignalP [29]), og ikke-klassiske (ved SecretomP [30]) (fig 2 H). Disse dataene er lik den bevis fra observasjonen av kroppsvæske som secretome inneholder klassiske og ikke-klassiske sekretoriske proteiner, så vel som intracellulære proteiner. [31] På den annen side, den proteinprofilen for 2h_N ingen celler (tabell I i S1 tabell) viser kun 35% av de totale anslåtte sekretoriske proteiner. Dette resultatet i stor grad svarer til det faktum at bare kulturmediet proteiner oppsamles uten innblanding fra HeLa celle secretome. Vi så brukt PANTHER- [32] for å analysere data fra protein-massespektrometri av prøver av 2h_N og 2h_CM. Mens prosenter av de fleste kategorier av de identifiserte proteinene er ganske like i prøvene av 2h_N og 2h_CM, de secretome proteiner innhentet av nanonets viser høyere prosenter av proteiner for katalytisk, antioksidant, og bindende aktiviteter (fig 2i). De ovennevnte resultater validere at de selv montert nanonets fungere som en mer nøyaktig og følsom metode for å samle kreft secretome enn CM.
Totalt proteiner fra timelig profilen til kreft secretome registrert av nanonets
Den korte inkubasjonstid gjør at pericellulær nanonets å registrere dynamikken i kreft secretome. Som vist i figur 3A, inkubering av HeLa-celler i FBS-fritt medium for forskjellige lengder av tid og deretter endring av medium til FBS-fritt medium inneholdende 1
p i ytterligere 4 timers inkubering produserer nanonet-oppsamlet secretome av HeLa celler. Kontrollen eksperiment benytter CM å samle secretome av HeLa-celler inkubert i FBS-fritt medium i 24 timer. [33] I henhold til protein massespektrometri-analyse av disse prøver (figur 3B), mengden av totale peptider og unike peptider avta fra N_0 prøven til N_8 prøven før utviklingen reverserer for N_12 prøven, som har en noe høyere mengde av peptider enn N_0 prøven. Selv CM gir de nyttige akkumulerte data fra HeLa secretome etter at den standard 24 timers inkubering, er det selvsagt ikke i stand til å fange den dynamiske endring av mengden av proteiner i secretome i løpet av 24 timers inkubering.
(A) Skjema som viser samlingen av nanonets fra HeLa celler eksponert i FBS-free medium for ulike lengder tid. Som en kontroll, ble CM samlet inn fra HeLa-celler eksponert i FBS-fritt medium i 24 timer. (B) Antall totale peptid og unike peptider observert i N_0, N_4, N_8, N_12, og CM av protein massespektrometri. (C) Antall total protein og unikt protein (unikt peptid nummer ≥2) [34,35] observert i N_0, N_4, N_8, N_12, og CM av protein LC-MS /MS. (D) Endringen i unike peptid antall av flere viktige proteiner i secretome observert i nanonets. (E) Endringen i unike peptid antall flere representative proteiner (samlet i nanonets) som har høye unike peptid treff observert i MS protein profilering.
Kategorier av proteiner forbli globalt balanserte
Selv om visse individuelle proteiner i secretomes utviser stor variasjon, de funksjonelle kategorier av proteiner i secretome forbli ganske konstant. Vi bruker PANTHER å analysere data fra LC-MS /MS av disse prøvene med pre-inkubasjonstid på mellom 0 og 12 timer (figur 4A, Tabell H i S1 tabell). Prosentandelene av hver kategori av identifiserte proteiner som holder seg nesten konstant. Åtte av ti (figur 4B) kategorier av secretomes viser samme trend i tidsmessige endringer-mengden av proteiner i utgangspunktet nedsetter etterfulgt av økende senere. Aktiviteten av antioksidanter og proteinbindingstranskripsjonsfaktorer viser forskjellige reaksjoner på berøvelse av næringsstoffer (dvs. FBS fritt medium): antioksydant proteiner øke etter et kort tidsrom (4 timer) av næringsmangel; proteinbinding transkripsjonsfaktorer øke etter en median intervall (8 h) av næringsmangel. Interessant nok er disse to typer aktiviteter har forholdsvis lave grunnlinjer i form av deres lille mengde av proteiner. Fordi den generelle trenden i sammensetningen av proteiner som er til å forbli konstant til FBS-deprivasjon, er den store variasjon av de enkelte kategorier av små mengder av proteiner lite sannsynlig å være forårsaket av forsøk på å opprettholde proteostasis.
(A) Temporal kakediagrammer representerer molekylære funksjonelle profiler av kreft secretome samlet etter FBS-deprivasjon for ulike lengder tid: 0 (N_0), 4 (N_4), 8 (N_8), og 12 timer (N_12). (B) Tomten representerer timelige atferd av ulike kategorier av kreft secretome basert på molekyl funksjoner, under FBS-deprivasjon for ulike lengder tid (0, 4, 8 og 12 h) og inkubasjon i kondisjonert medium i 24 timer. (C) Plottet viser varierende utvalg (vist som standardavvik) av tinning atferd for kategorisert secretomes.
For å bedre forstå secretome timeprofil ved FBS-deprivasjon, vi har også et resultat av 24 timer inkubasjon i kondisjonert medium (CM) som referanse (figur 4B). Som vist i figur 4B, er mengden av proteiner i CM ligger i nærheten av den gjennomsnittlige mengden av proteiner i secretomes i løpet av tidsmessige endringer (fra 0 til 12 timer). Dette resultatet betyr at de globale cellulære aktiviteter er sannsynlig å forbli balansert i løpet av FBS deprivasjon. I tillegg er disse resultater indikerer at fire timers inkubering med nanonets fører til minimal forstyrrelse av secretome. For å forstå den temporale endringen av secretome i en mer presis måte, beregner vi også de relative mengder av proteiner (S3-S7 Fig) og standardavvik verdier i hver kategori av proteiner. Som vist på figur 4C, fordelingen av standardavvikene til de tidsmessige endringer i hver kategori av protein varierer mellom protein kategorier. For eksempel, mens standardavviket verdien av de utskilte proteiner i kategorien av strukturelle molekylær aktivitet og binding er større enn 20, standardavviket verdien av de utskilte proteiner i kategorien for antioksidant og proteinbinding transkripsjonsfaktor-aktivitet er lavere enn 5. dette skillet i fordelingen tyder på at omfanget av svarene til FBS-deprivasjon varierer mellom hver kategori av sekretoriske proteiner. Disse resultatene, og dermed gi et nyttig innblikk i atferden til kreftceller etter næringsmangel.
Relative endringer i proteiner i hver funksjonell kategori
Den relative endringen av mengden av proteiner, på derimot viser en objektiv endre profilen til secretome ved å bruke den bestemte forskjellen mellom hvert tidspunkt dividert med resultatene fra en kontrollgruppe (24 timer inkubering i FBS-fritt medium) gjennom hele forsøkstidsrommet. Resultatet av relativ endring (RC verdi) for hver secretome beregnes ved hjelp av følgende formel:. Sammenligningen av temporale endringen mønster basert på RC-verdi for 69 utvalgte proteiner med betydelig endring profiler er vist i figur 5. Siden visse proteiner kan tilhøre mer enn en kategori, informasjon om den funksjonelle kategorien av hvert protein er inkludert i kart varmen. Den samlede utvalg av RC-verdier (fra -86% til 100%) gjenspeiler den generelle utviklingen av stabile sekresjon av kreftcelle under stimulans av FBS-deprivasjon. Flere proteiner utviser et stort RC verdi (PCBP1, ALDH7A1, PRMT1, CALD1, etc.). Dette fenomen er sannsynligvis på grunn av det lille antallet detekterte unike peptider i kontrollen. Dette resultatet indikerer at ytterligere ved hjelp nanonets istedenfor CM er en mer kraftig og passende metode for å samle kreft secretome.
Fra 0 til 4 timer, 42 ut av 69 proteiner (vist i farge rød til blå ) oppviser positive RC-verdier (fig 5), noe som antyder en økning i mengden av protein som reaksjon på en mangel på næringsstoffer. Etter ytterligere 4 t, blir den generelle trenden er en nedgang på sekresjon, som dokumentert av negative RC verdier for 38 av 69 proteiner (vist i farge grå til svart). I løpet av de nevnte tidsperioder på 8-12 timer og 12-16 timer, utskillelsen insinuates også en tilsvarende nedad mønster siden mengden av sekresjon utviser negative RC-verdier for 46 og 39 ut av 69 proteiner, henholdsvis, i løpet av disse to perioder. En kategoriseres analyse (figur 5) av kreft secretome viser at mesteparten av proteinene i samme funksjonelle kategori sjelden har en felles trend med tidsmessige profiler av sekresjon ved stimulering. Men for de multifunksjonelle proteiner (dvs. tilhører forskjellige undermenyer), deres timelige profiler vanligvis viser lignende tendenser over hele stimulering tid. For eksempel proteiner gruppert i funksjonelle kategorier av både bindende og katalytisk aktivitet, for eksempel MCM2, DHX9, DHX15, SNRNP200, alle viser en nedgang i overflod for første 4 timer og påfølgende økning i resten av FBS-deprivasjon; men andre proteiner i bare én av disse to kategoriene (enten bindende eller katalytisk kategori) viser knapt fellestrekk. Dette tegnet er tilsynelatende unikt for «multifunksjonelle» proteiner. For eksempel, GCN1L1, PSMD2, og IQGAP1, som tilhører både katalytiske og enzymatiske aktiviteter, oppviser den samme mengde sekresjon økningen for de første 4 timer følge av reduksjon. Dette fenomenet var ukjent tidligere, og det sikkert garanterer videre studier.
Den dynamiske endring av visse spesifikke proteiner
Siden dynamiske endringer av secretome av kreftceller har vært tidligere uoppnåelig, men inneholder svært viktig informasjon, analyserer vi endringer i overflod av flere viktige proteiner i prøvene fra N_0 til N_12. Sammenligning av antall unike peptid treff av disse proteinene bidrar til å etablere sine timelige profiler (Fig 3D og 3E). Som vist i figur 3D, er mengden av a-aktin 2 (ACTA2) og beta-aktin (ACTB) oppviser liten endring over tid (0-4 h (N_0) i 12-16 timer (N_12)) og mengden alfa-tubulin 1A (TUBA1A) og beta-tubulin 2A (TUBB2A) bare endres litt over tid, enige med den observasjon at actins og tubulins har en konstant tilstedeværelse i secretome av pattedyrceller. [26,27] tvert imot, jo mengder av både kollagen alfa-1 (XII) (COL12A1) og fibronektin (FN1) reduseres drastisk, dvs. kollagen alfa-1 (XII) forsvinner fra N_4 til N_12, og fibronektin er fraværende i N_8 og N_12. Mengden av to enzymer, Serpin H1 (SERPINH1) og pyruvat kinase (PKM), også redusere betydelig fra N_0 til N_12. Disse resultatene tyder på at for å takle sult indusert av FBS-deprivasjon, de HeLa-celler betydelig redusere eller muligens reabsorb ekstracellulære matrix proteiner og utskilles enzymer for å opprettholde proteostasis. [36] Vi har også undersøkt flere proteiner med høy unike peptid treff ( fig 3E). Spesielt mengden plectin (PLEC) gjennomgår den største endringen fra N_0 til N_12. Mens reduksjon av plectin fra N_0 til N_8 av HeLa-celler som er egnet for det formål å opprettholde proteostasis, indikerer den plutselige økningen av plectin i N_12 en lindres frigjøring av exosome, [37], godtar de sult atferdskreftceller som forsøker å manipulere tumor microenvironments (dvs. stimulere stromal og endotelceller) for å hjelpe til med deres progresjon [38,39] det er et annet interessant observasjon:., mens mengden av alle andre proteiner reduseres i en viss grad i det minste en prøve av nanonets, mengden av pyruvat
