Abstract
p37 protein på overflaten av
Mycoplasma hyorhinis
celler utgjør en del av en høy affinitet transportsystem og har blitt funnet i forbindelse med dyr og kreft hos mennesker. Her viser vi i NIH3T3 fibroblaster, p37 raskt induserer uttrykket av gener involvert i betennelse og kreft progresjon. Dette genet aktivering var hovedsakelig via TLR4 reseptoren. Aktivitet ble tapt fra p37 når de C-terminale 20 aminosyrer ble fjernet, eller de fire aminosyrene som er spesifikke for hydrogenbinding av tiamin-pyrofosfat var blitt erstattet med valin. Blokkering av IL6 reseptor eller hemme STAT3 signale resulterte i økt p37-indusert genekspresjon. . Siden kreft assosiert fibroblaster støtte vekst, invasjon og metastasering via deres evne til å regulere tumor-relatert betennelse, kan den raske induksjon i fibroblaster av proinflammatoriske gener ved p37 kan forventes å påvirke kreftutvikling
Citation: Gomersall AC , Phan HA, Iacuone S, Li SF, Parish RW (2015)
Mycoplasma hyorhinis
p37 protein raskt Induserer Gener i Fibroblaster er forbundet med betennelse og kreft. PLoS ONE 10 (10): e0140753. doi: 10,1371 /journal.pone.0140753
Redaktør: Yi-Hsien Hsieh, Institutt for biokjemi og bioteknologi, TAIWAN
mottatt: 25 juni 2015; Godkjent: 30 september 2015; Publisert: 29 oktober 2015
Copyright: © 2015 Gomersall et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: Den opprinnelige CEL filer for microarray analyse og andre som støtter data har nå blitt satt inn Figshare på https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.1574136
Finansiering:. ACG var en mottaker av en australsk Postgraduate Award .
konkurrerende interesser:. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
p37 protein ble først oppdaget på overflaten av muse sarkom FS9 celler [1] . Monoklonale antistoffer rettet mot p37-proteinet inhiberte invasiv oppførselen til FS9 cellene konfrontert med kylling hjerte fibroblaster [2]. Den p37 protein ble funnet å være fra
Mycoplasma hyorhinis Hotell og utgjør en del av en tre protein høy affinitet transportsystem [3]. Disse proteinene er svært lik periplasmatisk bindings høy affinitet transportsystemer av gram negative bakterier. Den p37 N-terminus besitter den C-S-N aminosyresekvensen som kreves for en N-terminal glyserid-cystein lipid forlengelse som settes inn i mycoplasmal membran [4]. Når
M
.
hyorhinis
var til stede, Rat-1 celler og FS9, L929 og NIH3T3 musefibroblastere alle invaderte kylling hjerte fibroblaster i konfrontert eksplantering analysen [5]. Hvis p37-spesifikke monoklonale antistoffer ble tilsatt til analyse invasive oppførsel ble inhibert.
Oppdagelsen av p37-indusert celle invasivity antydet at
M
.
hyorhinis
infeksjon kan spille en rolle i utviklingen av kreft.
M
.
hyorhinis
infeksjonen har senere funnet å være assosiert med menneske- og dyre cancere inkludert forskjellige karsinomer [6], så vel som kreft i eggstokkene og lymfeknutemetastase [7].
M
.
hyorhinis
infeksjon er korrelert med metastaser og spår dårlig overlevelse av magekreftpasienter [8]. Fareed et al. analysert immunresponsen til pasienter immunisert intralymphatically med tumorceller og funnet pasienter som viser tumor-regresjon hadde en målbar titer av antistoffer mot et 38 kDa-protein [9]. Ilantzis et al. bekreftet at proteinet være p37 [10]. Det p37-proteinet er funnet assosiert med humane gastriske karsinomer og prostata-tumorer [11, 12]. Ved hjelp av et antistoff rettet mot den N-terminale ende av p37, ble proteinet identifisert i mage, kolon, spiserør, lunge, bryst og glioma karsinomer så vel som på sirkulerende tumorceller fra pasienter med leverkreft [6, 13].
Tilsetning av p37 til human gastrisk karsinom (AGS) celler økt migrasjon i en transwell (Matrigel) analyse [11]. Behandling av prostata kreft linjer PC-3 og DU145 med p37 også økt sin invasivity gjennom Matrigel [14]. Inkludering av en p37-spesifikt monoklonalt antistoff hemmet denne invasjonen. Nivået på metalloproteinase 2 (MMP2) økte i media av p37-behandlet og
p37
-transfected AGS celler [11]. Goodison et al. foreslår økt invasivity kan representere en større migrasjonsrate følgende p37 behandling i stedet for økt kapasitet til å degradere Matrigel [15]. P37 behandling ble også funnet å øke
tumornekrosefaktor α product: (
TNFa)
gentranskripsjon og TNFa-nivåer i media av humane perifere mononukleære blodceller [16].
forskjellige mycoplasmal infeksjoner har blitt assosiert med cancer og artritt hos dyr og mennesker. For eksempel, infeksjon i 32D hematopoetiske celler med
M
.
fermentans
eller
M
.
pene
for 4-5 uker indusert malign transformasjon og når injisert inn i nakne mus cellene raskt dannes svulster [17].
M
.
hyorhinis
,
M
.
pneumoniae
,
M
.
hominis
,
M
.
fermentans
,
M
.
pene Hotell og
M
.
arthritidas
har alle vært involvert i menneskelig leddgikt [18-21].
M
.
fermentans
produserer akutt artritt hos kaniner [21].
M
.
hyorhinis
infeksjon er også assosiert med polyserositis og leddgikt av svine [22].
Målet med arbeidet rapporteres her var å identifisere gener som uttrykk raskt aktiveres etter p37 behandling av NIH3T3 fibroblaster
in vitro
. NIH3T3-celler ble valgt fordi de er en standard-fibroblast-linje som har vist seg å være verdifull i studiet av sykdom hos mennesker, inkludert cancer.The membran reseptor (er) er ansvarlig for genaktivering skulle også bli identifisert.
Methods
Plasmid bygging
Plasmid byggingen ble utført ved bruk av standard restriksjonsenzymet kloning.
p37
genet ble satt inn i
Bam
HI kutt stedet av pUC-avledet pRSET En ekspresjonsvektor. (Invitrogen, Cat # V351-20) (S1A figur)
avkortet p37 ble bygget ved hjelp av polymerase chain reaction (PCR) for å innføre
Bam
HI og
NCO
jeg restriksjonssnitt nettsider flankerer
p37
genet. Den reverse primere (S1 Table) innføres en
Nco
restriksjons snitt område på flere punkter som tilrettelagt fremstilling av DNA-sekvenser som reduserte størrelsen av p37-proteinet ved 20, 60, 80 eller 105 aminosyrer. PCR-produktene ble spaltet med
Bam HI og
NCO
I restriksjonsenzymer og ligert inn i pUC-avledede pRSET A-ekspresjonsvektoren (Invitrogen, cat # V351-20) (S2 fig) .
seterettet mutagenese
mutagenese av genet som koder for p37 ble utført ved hjelp av MutaGene fagmidekspresjonsvektoren
in vitro
mutagenese kit (Bio-Rad, Cat # 170-3581) . Oligonukleotidene leveres i S2 Tabell
De fire aminosyrer S255, F256, S257 og K258 i p37 ble endret til valin bruke QuikChange II XL seterettet mutagenese kit (Agilent Technologies, Cat # 200521). Og primeren motivet metode utviklet av Zheng et al. [23]. To polymerase kjedereaksjoner ble brukt til å utføre de mutasjoner; respektive forover og bakover primere er oppført i S3 tabell og sekvensanalyse i S3 fig. Den optimale primersammensmeltning temperatur ble etablert som 56,4 ° C.
Protein uttrykk og avklaring
Uttrykk av p37 protein, avkortede P37 proteiner (p37-20, p37-60, p37-80 og p37-105) og det muterte p37-protein ble gjennomført i OneShot®BL21 (DE3) celler (Invitrogen, cat # C6000-03). Celler ble dyrket i Luria-Bertani (LB) medium inneholdende 100 ug ml
-1 ampicillin og induseres med IPTG (Isopropyl β-D-1-tiogalaktopyranosid) til en sluttkonsentrasjon på 1 mM i 4 timer ved 37 ° C under omrøring . Induserte celler ble høstet og resuspendert i lyseringsbuffer (50 mM NaH
2PO
4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol, 1 mg ml
-1 Lysozyme, pH 8,0) som inneholder en komplett, Mini proteasehemmer cocktail tablet (Roche, Cat # 11836153001). Rå lysater ble oppnådd ved sonikering (6 sykluser, 30 sekunders intervaller), etterfulgt av omrøring i 30 minutter ved 4 ° C. Lysatet ble klaret ved sentrifugering ved 12.000 g i 10 minutter ved 4 ° C og oppsamlet ved filtrering gjennom et 25 um filter.
Arginin suge protein klargjøring
Høyere konsentrasjoner av den avkortede p37 peptidene var ligger i uløselig brøkdel av
E
.
coli
lysat og så å øke utbyttet av løselig p37 en arginin suge (argSOAK) metoden ble benyttet. Trunkerte peptider ble solubilisert med en 1 M arginin suge før rensing ved anvendelse av fremgangsmåten beskrevet av Tsumoto et al. [24]. Native p37 ble også renset ved hjelp av en M arginin suge å sikre at metoden ikke inaktivere protein
Protein rensing
Protein rensing ble oppnådd ved hjelp Profinity
TM IMAC Resin (BioRad.; Cat # 156-0123) med avvik fra produksjon protokoll.
To ml av Profinity
TM IMAC Resin ble lagt til for hver 25 ml forberedt ryddet lysat. For å tillate binding av protein harpiks /lysatet Blandingen ble inkubert i 1 time ved 4 ° C, under omrøring. Blandingen ble deretter sentrifugert i 1 minutt ved 3000 g for å pelletere harpiksen. Harpiksen ble vasket med 10 ml vaskebuffer (50 mM NaH
2PO
4, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8,0) ved omrøring i 5 minutter ved 4 ° C. Harpiksen /vask blanding ble sentrifugert i 1 minutt ved 3000 g for å pelletere harpiks. Protein avlesninger ved 280 nm (A
280) ble tatt av vaske supernatantene. Harpiksen ble gjentatte ganger vasket inntil vaske supernatantene A
280 var mindre enn 0,01.
Eluering ble oppnådd ved tilsetning av 7 ml elueringsbuffer (50 mM NaH
2PO
4, 300 mM NaCl, 500 mM imidazol, pH 8,0) for hver 2 ml av harpiks, med en times inkubasjon under omrøring ved 4 ° C. Blandingen ble sentrifugert i 1 minutt ved 3000 g for å pelletere harpiks og for hver 7 ml, ble fem 1 ml porsjoner av supernatanten inneholdende det eluerte protein oppsamlet. Det eluerte protein ble lagret ved -80 ° C
Proteinkonsentrasjoner ble beregnet etter den Pierce® BCA Protein Assay Kit. (ThermoScientific; Cat # 23227) og BCA program Eppendorf BioPhotometer 6131.
SDS-PAGE, Coomassie blå flekker og Western blotting
proteinprøver ble denaturert ved 95 ° C varmebehandling i 10 minutter og separert på 12% akrylamid skille geler med en 4% akrylamid stabling gel. De geler ble konstruert etter Mini-protean
® 3 Cell (Bio-Rad, Cat # 165-3301 /165-3302) produsentens instruksjoner. Mini-protean 3 Cell Mini Tank (BioRad, Cat # 165-3302) ble montert i henhold til produsentens instruksjoner og geleer kjørte i 60 minutter, 200 volt ved 4 ° C (Bio-Rad PowerPac
TM Basic strømforsyning ).
For å fastslå renseeffekt SDS-PAGE-geler ble farget med 0,1% Coomassie blå flekk (0,1% Coomassie Blue R-250, 40% metanol, 10% eddiksyre) over natten ved romtemperatur med forsiktig omrøring. SDS-PAGE-geler ble fiksert før Coomassie blå farging med fikseringsløsning (50% metanol, 10% eddiksyre) ved romtemperatur i 10 minutter med forsiktig omrøring. Følgende Coomassie blåfarging geler ble avfarget ved anvendelse av en 40% metanol, 10% eddiksyre avfarging løsning i 2 timer ved romtemperatur med forsiktig omrøring.
For protein identifikasjon, etter separasjon på 12% akrylamid separering av geler, proteiner var overføres til polyvinylidenfluorid membran etter BIO-RAD Mini Trans-blot
® Elektro protokollen (Cat # 170-3930 /170-3935). BIO-RAD Mini Trans-Blot
® Elektrofore system løp i 2 timer ved 200 volt
Membranene ble blokkert i 5% ikke-fettholdig melk i Tris-bufret saltvann med Tween-20 (TBST-buffer.: 137 mM NaCl, 20 mM Tris, 0,1% Tween-20), inkubert på nytt i 1 time med T7-tag monoklonalt antistoff (Novagen, Cat # 69522) fortynnet 1: 10.000 i 5% ikke-fett tørrmelk, etterfulgt av en 1 time inkubering med geite-anti-muse-IgG-pepperrot Peroxide (HRP) konjugat (Invitrogen, cat # G-21040) fortynnet 1: 10.000 i 5% ikke-fett tørrmelk
Western blots ble utviklet ved bruk av alkalisk fosfatase. konjugat Substrat Kit (BioRad, Cat # 170-6432). Membranen ble eksponert for lys i 10 minutter med omrøring og vasket med DDH
2o å stoppe reaksjonen før skanning
PageRuler Prestained Protein Stige. (Fermentas; Cat # SM0671) ble brukt til å analysere protein størrelse.
Microarray analyse
Total RNA ble ekstrahert fra NIH3T3 fibroblaster behandlet med 15 mikrogram ml
-1 renset p37 protein i 24 timer eller ikke-behandlede NIH3T3 fibroblaster bruker RNeasy® Mini Kit ( Qiagen; Cat # 74104). Tre biologiske replikater ble tatt for hver behandling. Genomisk forurensning ble screenet ved PCR og elimineres ved hjelp deoksyribonuklease jeg, Amplification Grade (Invitrogen, Cat # 18068-015) per produsentens anvisninger. RNA integritet og kvalitet ble kontrollert ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA).
RNA ble forsterket og cDNA syntetisert i henhold til instruksjonene i Genechip® 3 «IVT Express Kit bruksanvisningen ( Affymetrix, Cat # P /N702646 Rev.8). Etter biotinmerking av cDNA og fragmentering, ble prøver hybridisert til Affymetrix Mouse Genome 430 2,0 Arrays, vaskes med en Genechip® lufthåndtering stasjon og skannet ved hjelp av Genechip® Scanner 3000. Mikromatrise data ble behandlet med Affymetrix® Expression Console ™ Software 1.2 (Affymetrix ; Cat # P /N 702387 Rev. 2) og CLC Genomics Workbench 4.7 (CLC bio, https://www.clcbio.com;. Vat # DK28305087)
RT
2 Profiler ™ PCR Array systemet
Total RNA ble ekstrahert fra NIH3T3-fibroblaster som var blitt behandlet med p37, p37 og S31-201, S31-201 bare eller ikke-behandlede NIH3T3-fibroblaster ved hjelp av RNeasy® Mini Kit (Qiagen, Cat # 74104) . Tre biologiske replikater ble tatt for hver behandling. Genomisk forurensning ble screenet ved PCR og elimineres ved hjelp deoksyribonuklease jeg, Amplification Grade (Invitrogen, Cat # 18068-015) per produsentens anvisninger. RNA integritet og kvalitet ble kontrollert ved hjelp av Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, California, USA)
RNA Reverse Transcription og RT
2 Profiler
TM inflammatorisk respons Autoimmunitet PCR arrays (SABioscience; Cat # PAMM-077A-12) ble utført etter produksjonen instruksjon (SABiosciences; Part # 1022A). Sterke positive korrelasjoner av syklusen terskel (CT) verdier mellom PCR array-biologiske replikater av hver behandling indikert pålitelig qPCR påvisning av genuttrykk (S4 figur).
En ANOVA analyse ble utført sammenligne genet Ct verdier av det behandlede prøvene til den ubehandlede kontroll
Kvantitativ PCR (qPCR)
RNA ble ekstrahert ved hjelp av RNeasy® Mini Kit. (Qiagen; Cat # 74104) fra tre biologiske replikater av behandlet og ikke-behandlede NIH3T3 fibroblaster. RNA var DNAse behandlet (Invitrogen, Cat # 18068-015) før komplementær DNA konvertering (Super
TM III, Invitrogen, Cat # 18080-044). Kvantitativ amplication av cDNA ble utført i tre eksemplarer av hver biologisk replikere bruker iQ
TM SYBR
® Grønn Supermix (BioRad, Cat # 170-3884) og qPCR oligonukleotider (S4 Table) ved hjelp av en iCycler iQ
TM Fast -Tid PCR Detection System (BioRad, 170-8740). De samme amplifikasjonsbetingelser ble brukt for alle primersettene; innledende denaturering ved 95 ° C i 3 minutter; amplifikasjonsprosessen syklet 40 ganger gjennom denaturering ved 95 ° C i 10 sekunder, primersammensmeltning 60
° C i 30 sekunder, og deretter en forlengelse ved 72 ° C i 30 sekunder. Emittert fluorescens ble målt under syklet forlengelsesfasen. En endelig forlengelse på 95 ° C i 1 minutt ble gjennomført før dissosiasjonskurve. Den dissosiasjonskurve begynte ved 55 ° C med en økning på 0,5 ° C inntil den endelige temperatur på 95 ° C ble nådd.
Negative kontroller ble sjekket for å eliminere urenheter, og bare en enkelt topp ble akseptert i dissosiasjonskurve i alle testet genet. Alle amplifiserte produkter ble sekvensert for å indikere spesifisitet av qPCR oligonukleotider.
Brett Endre
For å normalisere ulike konsentrasjoner mellom prøver alle gener av interesse (GOI) Ct-verdier ble trukket fra den gjennomsnittlige Ct-verdier av de to endogene referanse gener
βactin Hotell og
GAPDH product: (
glyseraldehyd 3-fosfat dehydrogenase
); ΔCt (Eq 1). Alle Ct-verdier ble oppnådd fra tre replikater biologiske og tekniske tre replikater av hver biologisk replikat (N = 9) Ligning 1
Forskjellen mellom det aktuelle genet ΔCt av en behandlet prøve og en kontrollprøve ble beregnet.; ΔΔCt (Eq 2). Forsterkningen effektivitet av den eksponentielle endring per syklus per genet (E) av hver primer ble beregnet fra prosent effektivitet (E%); E (Eq 3). Prosent effektivitet på 100 ± 10% og R
2≥0.985 ble ansett som akseptabelt. Alle primerpar effektivitet kan finnes i tabell S4 ligning 2Equation 3.
ΔΔCt ble anvendt med det respektive genet primeren E verdi for å beregne den relative ganger endring av gen-ekspresjon på grunn av en behandling (ligning 4). Et normalisert ΔΔCt 1 indikerer oppregulering og 1 indikerer downregulation Ligning 4
.
Feilfelt
Standardavviket (
σ
) ble beregnet på grunnlag av ΔΔCt (Eq 5). Standardfeil (SE) ble beregnet fra standardavvik (ligning 6) og den øvre (ligning 7) og nedre (EQ 8) feilfelt ble beregnet ved bruk av standardfeilen, E-verdi og fold endring. N er antall prøven size = 9.
Equation 5Equation 6Equation 7Equation 8
Feil bar verdier for alle grafer leveres i S5 tabell.
variansanalyse (ANOVA)
en ANOVA-analyse ble utført på alle qPCR data som sammenligner den normaliserte syklus terskel (ΔCt) av de behandlede prøvene til kontrollene eller behandlede kontrollprøver. Alle forsøk besto av tre biologiske replikater og tre tekniske replikater av hver biologisk replikere (N = 9).
Pattedyrceller
Mus embryonale (NIH3T3) fibroblaster etablert fra NIH sveitsiske museembryoer, ble oppnådd fra The Peter MacCallum Cancer Centre, East Melbourne.
Cell kultur vilkår
NIH3T3 fibroblaster ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM). Mediet ble supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS), NaHCO
3 og penicillin-streptomycin. Plasmocin
TM (Invivogen) ble lagt til alle dyrkingsmedier i en konsentrasjon på 5 mikrogram ml
1. Cellelinjen og media ble testet for mycoplasma forurensning ved hjelp av Mycoplasma primere beskrevet av Uphoff og Drexler [25]. PCR-forsterkningsforhold som er involvert en innledende denaturering ved 95
° C i 3 minutter og påfølgende amplifikasjon Fremgangsmåte syklet 32 ganger gjennom denaturering ved 95
° C i 10 sekunder, primersammensmeltning 65
° C i 30 sekunder, og en forlengelse ved 72
° C i 30 sekunder. En endelig forlengelse på 95
° C i 1 minutt ble fullført. Cellelinjen og alle forsøk cellemateriale ble funnet negative for mykoplasma forurensning.
Alle Kulturplatene ble inkubert i en inkubator med vannkappe (Forma Scientific). Inkubatoren ble automatisk regulert ved 37
° C med 5% CO
2
hemmere
Følgende hemmere ble brukt. IL6R inhibitor LEAF
TM renset anti- mus /rotte CD126 monoklonalt antistoff (IL6R
i
) (Biolegend; Cat # 115809) (AB_2127939) ved en endelig konsentrasjon på 0,1 ug ml
-1. Den endelige konsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av RT-PCR, som viste at konsentrasjoner av IL6R
i
i området fra 0,1 til 0,5 ug ml
-1 inhiberer p37-indusert
serumamyloid A3 plakater (
Saa3
) uttrykk. Den kjemiske sonde STAT3 Inhibitor VI (S31-201) (Santa Cruz Biotechnology, Cat # sc-204 304) ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 100 uM [26]. Viral Inhibitor Peptide av TLR4 (Viper) og den Viper kontroll peptidet CP7 ble anvendt ved en sluttkonsentrasjon på 0,5 uM (IMGENEX; Cat # IMG-2011set). Viper inhiberingskonsentrasjon 0,5 uM, ble bestemt ved behandling av NIH3T3-celler med 1 pg ml
-1 lipopolysakkarid (LPS) (InvivoGen; Cat # tlrl-3pelps) inhibering med 0,25, 0,5, 0,75, 1, 5, 10 og 25 uM VIPER. Den endelige konsentrasjon på 0,5 uM Viper ble funnet å redusere ekspresjon av
Saa3
fra 12-fold til 5-fold. CP7 ble også funnet å hemme LPS-indusert
Saa3
uttrykk ved høyere konsentrasjoner imidlertid på 0,5 mikrometer CP7,
Saa3
uttrykk var ikke signifikant hemmet.
Cell behandling
NIH3T3-fibroblaster for behandling ble passert inn i det nødvendige antall vevskulturplater for å tillate tre biologiske replikater per behandling. Alle NIH3T3 linjer stammer fra den samme batch fryse ned ved passering 10; behandling inntraff før passasjen 15. Før behandlingen ble DMEM 10% FCS-medium aspireres og cellekulturer ble vasket to ganger med 1 x fosfatbufret saltløsning (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na
2HPO
4.2H
2O, 2 mM KH
2PO
4, pH 7,4), med mindre annet er angitt.
for p37 behandling ønsket konsentrasjon av renset p37 ble tilsatt til DMEM 10% FCS-medium som dekker cellene og kulturene ble inkubert i den nødvendige tid. Når det gjelder tidsprøver, ble celle behandlinger initiert til tider som er tillatt for alle behandlings kurs som skal synkroniseres og klar for RNA ekstraksjon ved T
0.
NIH3T3 fibroblaster ble behandlet med hemmere før 24 timers behandling med eller uten p37. Forbehandling inkubasjonstid varieres avhengig av inhibitor; 1 time for IL6R
i
, 2 timer for VIPER og CP7 og 24 timer for S31-201.
Behandlinger ble avsluttet ved vasking og lysis av celler for umiddelbar RNA ekstraksjon. Celler ble observert etter behandling for toksisitet nivåer, hvis det var en observerbar toksisk effekt forsøket ble avsluttet.
Migrasjon analyser
Cell migrasjon ble stimulert i et enkelt lag ved å bruke en
i vitro
scratch såret analysen. NIH3T3-fibroblaster ble dyrket til en 100% konfluent monolag og skrapet med en steril pipette, som danner et sår på omtrent 300 mikrometer i diameter. Cellerester ble vasket bort med 1x PBS og DMEM 10% FCS ble lagt med 25 mikrogram ml
-1 p37 for behandlede NIH3T3 fibroblaster. Kulturer som ikke hadde nådd et konfluent monolag etter 24 timers behandling, og sår som var større eller mindre enn 300 um ble ekskludert fra analysen. Bilder ble tatt på 0, 14, 19, 24 og 38 timer. Seks bilder ble tatt per tidspunkt per plate. Triplikate plater ble utført ved hvert tidspunkt (N = 18). Valuta celle migrasjon ble uttrykt som areal (mikrometer
2) dekket av trekkende celler dividert med tid (timer). For å etablere området i hvilket cellene hadde migrert ved hvert tidspunkt, ble det område av såret ved hvert tidspunkt subtraheres fra det opprinnelige område av såret. ImageJ ble brukt til å bestemme området av såret.
Resultater
Gene uttrykk profilering av P37 behandlet NIH3T3 fibroblaster
Rekombinant
p37
genekspresjon ble indusert i
Escherichia coli Hotell og proteinet renset ved hjelp av Ni-affinitetskromatografi (figur 1). Til å begynne med ble effekten av den rensede p37 på NIH3T3 fibroblast migrasjon bestemt. I en sårtilheling analysen 25 ng ml
-1 P37 behandlet fibroblaster utstilt økt migrasjon priser (S5b Fig) og raskere lukking av sår enn kontrollene (s5a Fig). p37 påvirket ikke formeringshastigheten av NIH3T3-celler. Det er en rapport av p37 behandling forårsaker en svak økning i spredning av DU145 prostata celler (ingen data tilgjengelig), men PC3 prostata celler var upåvirket (15).
Renset p37 ble skilt med 12% SDS PAGE og farget med Coomassie-blått (A). Det rensede protein ble overført til polyvinylidenfluorid membraner og probet med den T7-tag monoklonalt antistoff og geite-anti-muse-IgG-pepperrot Peroxide (HRP) konjugat (B). Molekylvektstandarder (MW) er i kilo Dalton (kDa) og er angitt på venstre side av figuren. Det rensede proteinet p37 løp til stillingen på omtrent 52 kDa. Det p37-proteinet er anslått til å være 43,5 kDa med en ytterligere 8,5 kDa som et resultat av den 6x His Tag og Xpress epitop av pRSET A leserammen. Identiteten til den rensede p37 protein ble ytterligere bekreftet ved hjelp av protein sekvensering.
NIH3T3 fibroblaster ble inkubert med 15 mikrogram ml
-1 p37 i 24 timer og en microarray analyse av renset total RNA indikert uttrykket av 537 gener påvirkes i betydelig grad (p≤0.001); 288 av disse genene ble oppregulert (foldendring ≥ 3) (S6 tabell). De genet ontologi oppdrag for de 288 genene betydelig oppregulert leveres i S6 fig. De ti mest sterkt oppregulert gener (9- til 64-fold) har alle blitt rapportert å påvirke kreft progresjon og /eller betennelse (se diskusjon). Vi valgte for analyse ytterligere åtte gener (oppregulert 3 til 9 ganger) som også påvirker betennelse /kreft. Microarray data for de atten genene ble validert ved hjelp av kvantitativ PCR (qPCR) (S7 fig). Oppregulering som respons på p37 behandling ble bekreftet til fjorten av genene. De fold endringer holdt seg relativt konstant mellom de ulike (senere) eksperimenter. Vi har senere brukt 25 ng ml
-1 p37 og 24 timers behandlinger; fold endringene var sammenlignbar mellom eksperimenter.
haptoglobin product: (
Hp
) var et unntak.
microarray analyse identifisert 249 gener sterkt nedregulert (endring ≥ 3) (S7 tabell). Nedregulering av fem av disse genene har vært forbundet med tumorprogresjon og aktivering av akutt fase-protein (APP) gener (S8 tabell).
Effekt av ulike p37 konsentrasjoner og behandlingstider
NIH3T3 fibroblaster ble inkubert med 0,5, 1, 5 og 25 ug ml
-1 p37 i 24 timer. De lavere P37 konsentrasjoner var mindre effektiv på å stimulere genuttrykk selv
Komp komponent 3 plakater (
C3
) og
lipokalin to plakater (
Lcn2
) var fortsatt betydelig aktiveres av 5 mikrogram ml
-1 p37 (tabell 1).
for å avgjøre endringer i genuttrykk over tid NIH3T3 fibroblaster ble behandlet med 5 ug ml
-1 p37 for 2 , 4, 8, 12 og 24 timer.
Angiopoietin like-fire plakater (
Angptl4
),
Serum Amyloid A3 plakater (
Saa3
),
karcelleadhesjonsmolekyl en
(
Vcam1
) og
interleukin 6 product: (
IL6
) uttrykk økt kraftig i løpet av de første 4 timer med behandling, men aktiveringen hadde falt til lave nivåer eller var fraværende på 24 timer (tabell 2). Den store økningen i
Lcn2 Hotell og
C3
uttrykk skjedde mellom 12 og 24 timer.
decorin product: (
DCN
) og
leukemi hemmende faktor product: (
LIF
) uttrykk økt i løpet av de første 4 timene, deretter falt og deretter økt litt igjen på 24 timer.
Selv om noen variasjon i ganger endring skjedde da NIH3T3 fibroblaster ble behandlet med 25 ug ml
-1 p37 i 24 timer (Tabell 1 og senere eksperimenter), fem gener
Angptl4
,
Saa3
,
DCN
,
C3 Hotell og
Lcn2
konsekvent ble aktivert mer enn 10 ganger. Tre gener
Hyaluronan syntase to plakater (
has2
),
Hp Hotell og
LIF
av minst fem ganger.
P37 aktiverer genekspresjon via TLR4 reseptoren
den raske økningen i
Angptl4
,
LIF
,
Saa3
,
IL6 Hotell og
Vcam1
uttrykk i p37 behandlet fibroblaster foreslo p37 protein signaliserte via bompenger-like receptor 4 (TLR4). NIH3T3 fibroblaster har TLR4 siden 1 ng ml
-1 lipopolysakkarid (LPS) behandling i 6 timer resulterte i en 28-dobling av
IL6
uttrykk i NIH3T3 fibroblaster [27]. Vi behandlet NIH3T3 fibroblaster med 1 mikrogram ml
-1 LPS i 24 timer og fant en to-fold og en 12-dobling i
IL6 Hotell og
Saa3
uttrykk, henholdsvis (data ikke vist). Viral Inhibitor Peptide av TLR4 (Viper) og dens kontroll peptid (CP7) [28] ble anvendt for å bestemme om p37-signaler via TLR4. NIH3T3-fibroblaster ble inkubert i 24 timer med p37 (25 ug ml
-1) eller pre-behandlet i 2 timer med Viper eller CP7 peptider (0,5 um) før tilsetningen av p37. Virkningen av peptidene på ekspresjonsnivåene for de syv genene mest sterkt indusert av p37 ble bestemt (figur 2). Den p37-indusert ekspresjon av alle sju gener ble betydelig hemmet av Viper. Selv om noen CP7-indusert inhibering forekom, i de fleste tilfeller var betydelig mindre enn inhiberingen forårsaket av Viper. Behandling av NIH3T3 fibroblaster med 0,5 mikrometer VIPER eller CP7 alene hadde ingen effekt på genene som ble testet, med unntak av
Saa3
som ble nedregulert med 0,5 ganger (S8A figur).
Kvantitativ PCR ( qPCR) analyse av NIH3T3 fibroblaster behandlet med 25 mikrogram ml
-1 p37 i 24 timer (svart) eller pre-behandlet i 2 timer med Viper (grå) eller kontroll peptid CP7 (hvite) før 25 mikrogram ml
-1 p37-behandling i 24 timer. Signifikante forskjeller mellom CP7 eller VIPER + p37 behandlinger og p37 behandling ble beregnet ved hjelp av ANOVA analyse (+ p≤0.05, ++ p≤0.01, +++ p≤0.001).
Trunkering av p37 eller mutere TPP-bindingssetet hemmer genaktivering
Fire avkortede p37-peptider ble fremstilt som 20, 60, 80 eller 105 aminosyrer hadde blitt fjernet fra den C-terminale ende. Oppløselige peptider (25 ug ml
-1) renset ved anvendelse av argSOAK metode ble brukt til å behandle NIH3T3 fibroblaster. Kapasiteten av p37 til å indusere genekspresjon var tapt når de C-terminale 20 aminosyrer var fraværende (figur 3). Unntaket var
Angptl4
som uttrykk nivå indusert av 20 aminosyrer avkuttet peptid var lik den full lengde p37 peptid. Uttrykket nivåer av de andre gener som ble testet (syv er vist) ble ikke signifikant påvirket av de avkortede p37 peptidene.
Kvantitativ PCR analyse av NIH3T3-fibroblaster behandlet med 25 ug ml
-1 p37 eksklusiv 20 aminosyre (aa), 60aa, 80aa eller 105aa (mørk grå til hvit) fra den C-terminale ende; i 24 timer. Arginin suge (argSOAK) renset p37 (mørkeste grå) litt reduserer p37-indusert (svart) genekspresjon i NIH3T3 fibroblaster. Signifikante forskjeller mellom behandlet og ubehandlet fibroblaster ble beregnet ved hjelp av ANOVA analyse (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001)
Den krystallinske strukturen av p37 er definert til. 1.9 Å oppløsning [29]. P37 er en alpha /beta klasse proteiner som består av to domener adskilt med en spalte som modellering indikerer binder tiamin-pyrofosfat (TPP).
