Abstract
Bakgrunn
leverkreft (HCC) er den vanligste formen for leverkreft og den tredje ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. Den eneste godkjent systemisk behandling for unresectable HCC er den muntlige kinase inhibitor, sorafenib. Rekombinant human syre sfingomyelinase (rhASM), som hydrolyserer sfingomyelin til ceramid, er frittstående medikament under utvikling for behandling av type B Niemann-Picks sykdom (OD). På grunn av den hepatotrope natur rhASM og dens evne til å generere pro-apoptotiske ceramid, denne studien evaluerte bruken av rhASM som en adjuvant behandling med sorafenib i eksperimentelle modeller av HCC.
metodikk /hovedfunnene
In vitro
, rhASM /sorafenib behandling redusert levedyktighet Huh7 lever kreftceller flere enn sorafenib.
In vivo
, ved hjelp av en subkutan Huh7 tumormodell, ble mus overlevelse økt og spredning i svulstene redusert til en tilsvarende grad i både sorafenib og rhASM /sorafenib behandlingsgruppene. Men kombinert rhASM /sorafenib behandling betydelig redusert tumorvolum, økt tumor nekrose, og redusert tumor blodkar tetthet sammenlignet med sorafenib. Disse resultater ble oppnådd til tross for dårlig levering av rhASM til tumorene. En annen (orthotopic) modell av Huh7 svulster også ble etablert, men beskjeden ASM aktivitet ble likeledes påvist i disse svulstene sammenlignet med friske mus lever. Viktigere var ingen kronisk levertoksisitet eller vekttap observert fra rhASM terapi i begge modeller.
Konklusjon /Betydning
rhASM /sorafenib kombinasjonen viste en synergistisk effekt på å redusere tumorvolumet og blodårer tetthet i Huh7 xenografter, til tross for beskjeden aktivitet rhASM i disse svulstene. Ingen signifikant økning i overlevelse ble observert fra rhASM /sorafenib behandling. Den dårlig levering av rhASM til Huh7 tumorer kan skyldes, i det minste delvis, til lav ekspresjon av mannosereseptorer. Sikkerhet og effekt av denne tilnærmingen, sammen med nye funn vedrørende enzym målretting, fortjener videre undersøkelser
Citation. Savić R, Han X, Fiel jeg, Schuchman EH (2013) Rekombinant humant Acid sfingomyelinasen som en adjuvant til Sorafenib Behandling av Experimental leverkreft. PLoS ONE 8 (5): e65620. doi: 10,1371 /journal.pone.0065620
Redaktør: Alexander Arlt, Christian-Albrechts-universitetet i Kiel, Tyskland
mottatt: 03.02.2012; Godkjent: 02.05.2013; Publisert: 28 mai 2013
Copyright: © 2013 Savić et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. NIH HD28607 . Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
den siste estimatet av American Cancer Society for 2013 er at om lag 30 640 mennesker vil bli diagnostisert med primær lever og gallegang kreft i USA, med om lag 21 670 (71%) kreftrelaterte dødsfall. HCC er den mest vanlige (~90%) form av leverkreft, ofte diagnostisert ved fremskredne stadier av sykdommen [1]. HCC er en genetisk heterogen malignitet i hvilken en rekke deregulerte signalveier som fører til forhøyet proliferasjon og angiogenese, inkludert RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-catenin, IGF, og HGF /c-MET [2]. Inntil nylig har behandlingstilbud for avansert /inoperabel HCC vært relativt ineffektiv og komplisert av den underliggende hepatitt og skrumplever. I 2007 godkjente FDA en muntlig stoff for unresectable HCC – sorafenib, et lite molekyl multikinasehemmer inhibitor med en
in vitro
aktivitet mot dusinvis av serin /treonin (f.eks RAF) og tyrosin kinaser (f.eks VEGFR) i tumorceller og blodkar [3], [4]. I pivotale kliniske studier, sorafenib gis 2,8 måneder bedre overlevelse i behandlingsgruppen (10,7 måneder median) sammenlignet med placebo (7,9 måneder), som danner grunnlaget for godkjenning av FDA [3], [5]. Imidlertid, til tross for den viste klinisk effekt har noen pasienter med fremskreden sykdom unnlater å svare på sorafenib og de som har en begrenset nytte [5]. Derfor undersøkelser i alternative /støttende medikamentell behandling har vært å få fart [6].
I motsetning til HCC omfatter OD en familie av ultra sjeldne monogene lidelser med kjente genetiske og biokjemiske forandringer. For eksempel mutasjoner i
SMPD1
genet resultat i mangel av ASM aktivitet, som fører til opphopning av sphingomyelin i lysosomer og andre cellulære avdelinger. Type A OD er nevrodegenerative, infantile form for ASM mangel, vanligvis dødelig i løpet av de første 2-3 årene av livet. I kontrast, mangler Type B OD nevrologisk engasjement og overlevelse kan være i sen barndom eller voksen alder, selv om berørte enkeltpersoner ofte vise progressiv hepatosplenomegaly og luftveissykdom [7]. Enzymerstatningsbehandling med eksogene rhASM mottatt foreldreløs narkotika status for type B OD i 2000 [8], og har blitt testet i en fase I klinisk studie hos voksne type B OD pasienter (clinicaltrials.gov identifikator NCT00410566). En fase Ib gjentatt dosering studie er i gang. Hydrolyse av sfingomyelin ved rhASM frembringer et høyt bioaktivt og cytocidale lipid, ceramid, som er i stand til å indusere tumor suppresjon [9]. Det er kjent at heving av ceramid på celleoverflaten gjen organiserer cellemembranen aliserte plattformer, sannsynligvis indusere nedstrøms cellulære forandringer, men de nøyaktige mekanismer som ligger til grunn for disse effektene er fortsatt et aktivt område undersøkelses [9].
Due til de pro-døden effekter av ceramid, har kreftceller utviklet flere forsvarsmekanismer for å overvinne dette lipid, herunder redusert produksjon og /eller forbedret klaring, eller forhøyet produksjon av motvirke pro-overlevelse lipid, sfingosin-1-fosfat (S1P). Disse forsvarsmekanismer kan også bidra til sfingolipid formidlet medisinresistens [10], [11]. Derfor narkotika terapi rettet mot sphingolipid metabolisme, herunder overproduksjon av ceramider for å drepe kreftceller eller redusere angiogenese, representerer attraktive tilnærminger for kreftbehandling. Mange av disse nye sphingolipid narkotika terapi har blitt evaluert i cellekultur og /eller dyremodeller, og har fokus på direkte distribusjon av ikke-fysiologiske ceramider [12] til svulster, eller administrasjon av hemmere av ceramidases eller sfingosin kinaser ansvarlig for syntese av S1P [13]. Siden rhASM er a) selektivt tas opp av leveren etter systemisk administrasjon, b) svært effektiv i å generere ceramid, og c) tilgjengelig i en klinisk klasse formulering, vi fokusert på å undersøke potensialet for rhASM som en adjuvant å sorafenib behandling i eksperimentell lever kreft.
Tidligere viste vi at rhASM i kombinasjon med bestråling hadde en dyp effekt på melanom
in vivo.
til rekapitulere denne effekten
in vitro
media for å være syrnet (pH 6,5), en tilstand som etterligner mikromiljøet av svulsten og favoriserer ASM aktivitet [14]. Vi viste også at rhASM alene (1 mm) hadde ingen reproduserbar effekt på levedyktigheten til 60 kreftcellelinjer omfatter leukemi, ikke-småcellet, tykktarm, CNS, melanom, eggstokkreft, nyre, prostata og bryst svulster, noe som tyder på at
in vivo
mikromiljøet av svulsten var viktig for de observerte effektene [15], [16].
med tanke på hepatotrope natur rhASM, hypotese vi at leverkreft kan være en hensiktsmessig modell der til neste test effekten av rhASM som adjuvans til standardbehandling sorafenib behandling. Her viser vi at kombinasjonsbehandling med høye doser rhASM (25 mg /kg hver tredje dag (q.72 h), intraperitonealt (ip)) og sorafenib (30 mg /kg hver dag (qd), gavage) reduserer tumorvolum Huh7 subkutane xenografter
in vivo
, reduserer blodårer tetthet, og gir økt nekrose i svulstene. Disse effektene ble oppnådd til tross for begrenset levering av enzymet til de subkutane svulstene. Kombinasjonsbehandling ble godt tolerert hos BALB /C-mus ingen behandlingsrelaterte dødsfall, uten tap av vekt, og med normal leverfunksjon. Vi har også etablert en orthotopic modell av Huh7 svulster i leveren hos SCID /beige mus, og overraskende funnet tilsvarende dårlig levering av rhASM til disse svulstene i forhold til sunn leveren. Videre undersøkelser antydet at lav uttrykk for mannosereseptorer i Huh7 svulster kan delvis forklare denne effekten.
Resultater
Deregulering av sphingolipid signalisering i menneskelige leverkreft
Sammenligning av normale lever til hepatocellulært karsinom, ved hjelp av fire uavhengige sett av prøver som er tilgjengelige i Oncomine databasen, avslørte betydelig redusert nivå av ASM (
SMPD1
) og S1P fosfatase (
SGPP1
) mRNA uttrykk (tabell 1).
SMPD1
genet rangert blant de topp 1, 9, 17 og 11% av undertrykt gener i Mas [17], Chen [18], Wurmbach [19], og Roessler lever 2 datasett [20]. Tilsvarende
SGPP1
genet ble rangert på topp 4, 5 og 7% trykt gener i tre av fire datasett [17], [18], [19]. S1P er en meget bioaktivt sfingolipid som fremmer cellevekst [11], og S1P fosfatase er det enzym som er nødvendig for å hydrolysere fosfatgruppe fra S1P (figur 1A). Undertrykkelse av disse to genene /enzymer vil derfor favorisere lav ceramid og høye nivåer S1P, sannsynligvis fører til celleproliferasjon og /eller medikamentresistens.
(A) ASM driver produksjonen av pro-apoptotiske ceramid gjennom hydrolyse av sfingomyelin, som omdannes til sfingosin ved ceramidases slik som syre ceramidase (AC). Sphingosine kinase 1 (SPHK1) phosphorylates deretter sfingosin til sfingosin-1-fosfat (S1P), som omdannes tilbake til sfingosin av S1P-fosfatase (SGPP1) eller metaboliseres av S1P lyase 1 (SGPL1). (B) Aktivitet av ASM i Hep3B celler var signifikant høyere (ANOVA, df (2,6), F = 48,49, p 0,001) enn i Huh7 (Tukey sin post hoc test p 0,001, **) og HepG2 celler (Tukey sin post hoc test p 0,001). AC var lik på tvers av alle cellelinjer, men HepG2 celler hadde signifikant høyere SPHK1 aktivitet (ANOVA, df (2,6), F = 8,68, p = 0,017, *) enn Huh7 (Tukey sin post hoc test, p = 0,041) og Hep3B (Tukey sin post hoc test, p = 0,019). (C) Huh7-celler ble valgt for videre studier og deres levedyktighet testet ved pH 6,5 (se metoder) i nærvær av 500 pg /ml rhASM, 3 uM sorafenib, eller en kombinasjon av rhASM og sorafenib ved 48 timer. Sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001, **) og kombinert rhASM /sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001, **) behandlede celler hadde signifikant lavere levedyktighet enn kontrollcellene (ANOVA, df (3,38), F = 26.47, p 0,001). rhASM var ikke signifikant forskjellig fra kontroll (p = 0,118). Den rhASM og sorafenib kombinasjonen viste signifikant lavere levedyktighet i forhold til sorafenib alene (t-test, en ensidig, * p 0,05, ** p 0,001).
Valg av et menneske hepatoma cellelinje og
in vitro
effekten av rhASM på spredning
Vi neste undersøkt grunnlinjen virksomheten til tre viktige enzymer involvert i sphingolipid metabolisme – ASM, syre ceramidase (AC), og sfingosin kinase 1 (SPHK1) – i tre brukte menneskelever-cellelinjer: HepG2, Huh7 og Hep3B. Hep3B celler hadde høyest baseline ASM aktivitet, mens SPHK1 aktiviteten var høyest i HepG2 celler (Figur 1b). Alle tre celler hadde sammenlignbar AC aktivitet. Basert på disse resultatene vi valgte Huh7 celler for videre eksperimenter siden baseline aktiviteter var moderat og mellom de av HepG2 og Hep3B. I tillegg Huh7 subkutan muse xenografter er en veletablert modell brukes til å vurdere ulike eksperimentelle medikamentell behandling for HCC [21], [22], [23]. Effekten av rhASM ble undersøkt i Huh7-celler ved forhåndsbehandling (2 timer) med den rhASM i en surgjort medium (6,5) – ligne svulsten mikromiljøet pH – etterfulgt av inkubasjon i 46 timer ved pH 7,4. Ingen signifikant effekt av rhASM behandling alene ble observert på levedyktigheten av Huh7-celler i løpet av de 48 timene, slik det ble observert tidligere i melanomceller [14]. I motsetning til dette, sorafenib førte til en betydelig reduksjon i proliferasjon, som var betydelig forbedret i celler eksponert for rhASM /sorafenib kombinasjon (figur 1C). Disse dataene videre støttet forestillingen om at rhASM alene har liten effekt på tumorceller, og kan være nyttig som en adjuvant behandling for å sorafenib [14].
Redusert tumorvolum og økt overlevelse hos mus behandlet med rhASM og sorafenib
Deretter undersøkte vi effekten av rhASM /sorafenib kombinasjonsbehandling
in vivo
hjelp Huh7 subkutane xenografttumorer i mus. Dyrene ble randomisert i 4 grupper som ble behandlet med sorafenib (n = 10), rhASM (n = 13), rhASM /sorafenib (n = 14), eller bærer (n = 9). Som i de
in vitro
eksperimenter, rhASM behandling alene hadde ingen gunstig effekt
in vivo plakater (median overlevelse 10 dager, tumorvolumet 925 ± 80 mm
3 på dag 11) (data ikke vist). Imidlertid, sammenlignet med vehikkel, ble signifikant lavere tumorvolumer målt i rhASM /sorafenib gruppe på dag 8 og 11. Også på dag 11 reduksjon av tumorvolumet observert i kombinasjonsgruppen var signifikant lavere enn i mus behandlet med sorafenib alene ( Figur 2A). Overlevelsen av mus var signifikant større i både den sorafenib (13 dager) og kombinasjoner behandlede mus (19 dager) sammenlignet med bærestoff (11 dager) (figur 2B). Selv om det var en trend mot forbedring, ble det ikke observert noen signifikante overlevelses forskjeller mellom de to behandlingsgruppene. Av notatet, men to dyr i rhASM /sorafenib kombinasjonsgruppen hadde svulster 1.000 mm
3 og overlevde utover 5 uker. Disse musene ble avlivet på dag 43 som sine tumorvolumer holdt seg relativt stabil (132 mm
3 (mus ID # 452) og 267 mm
3 (mus ID # 443) på tidspunktet for offer.
(A) Det gjennomsnittlige tumorvolum hos mus behandlet med rhASM og sorafenib var betydelig mindre enn den for kontrollmusene ved dag 8 (Dunnetfs post hoc-test p = 0,035, ANOVA df (2,30), F = 3,24, p = 0,053) På dag 11 både sorafenib (Dunnetts post hoc test p = 0,034) og kombinert rhASM og sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001) behandlede mus hadde mindre svulster enn kontroll mus (ANOVA, df (2,27)., F = 12,22, p .. 0.001) den rhASM /sorafenib kombinasjon gruppen hadde også betydelig mindre svulster enn sorafenib gruppe på dag 11 (t = 2.32, df (20), p = 0,031) (B) betydelig lengre median overlevelse ( 13 dager) av sorafenib behandlet mus (chi-kvadrat 5,02, df (1), p = 0,025) og kombinerte rhASM /sorafenib behandlet mus (19 dager) (chi-kvadrat 14,57, df (1), p 0,001) ble observert sammenlignet med kontrollgruppen (11 dager). To mus i rhASM /sorafenib gruppe levde utover fem ukers studieperioden, og ble til slutt avlivet på dag 43 (tumor volum 132 mm
3, 267 mm
3). *, # P 0,05, ** p. 0,001
Redusert spredning og blodkartetthet og økt celledød i svulster fra kombinert rhASM /sorafenib behandlet mus
På molekylær nivå, antall celler positive for den Ki67 proliferasjon markør ble signifikant redusert i både sorafenib og rhASM /sorafenib behandlingsgruppene til en tilsvarende grad (figur 3A). Imidlertid nekrose var signifikant økt i den kombinerte rhASM /sorafenib behandlede mus (figur 3B). For å undersøke dette funnet nærmere, vi neste undersøkt vaskularisering av svulstene. Antallet blodårer farget med anti-αSMA var signifikant lavere i tumorer fra både sorafenib (6,9 ± 0,5) og rhASM /sorafenib (5,5 ± 0,4) behandlede mus sammenlignet med kontroll (9 ± 0,6). Viktigere, antall anti-αSMA positiv blodkar var signifikant lavere i rhASM /sorafenib enn i sorafenib behandlede mus (p 0,001). Lignende resultater ble oppnådd ved anti-CD34-farging, hvor rhASM /sorafenib (5,3 ± 0,4) var betydelig lavere enn sorafenib alene (7,5 ± 0,4), og begge var lavere enn kontrollen (11,6 ± 0,9). Både anti-αSMA og anti-CD34 tillatt for selektiv farging av blodårer i parafin innleiret tumorsnitt, som vist i figurene 3 E, F. De rhASM /sorafenib lang overlevende mus (ID # 452 og ID # 443) var i området fra målinger for kombinasjonsgruppen enten ved hjelp av analysene ovenfor.
(A) Gjennomsnittlig antall Ki67-positive celler i svulster fra mus behandlet med sorafenib (Dunnett post-hoc p 0,005) og med rhASM /sorafenib kombinasjon (Dunnett post-hoc p 0,001) var betydelig lavere enn bilen (ANOVA df (2,30), F = 14,63, p 0,001). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom Ki67 flekker i svulster fra sorafenib og rhASM /sorafenib behandlet mus (t = 1.19, df 22, p = 0,249). (B) Nekrose betydelig høyere (ANOVA, df (2,30), F = 3,66, p = 0,038) i rhASM /sorafenib behandlet mus (Dunnetts post hoc kontroll, p = 0,043) sammenlignet med kjøretøy behandlet mus, mens sorafenib behandlede mus var ikke forskjellig fra kontroll (Dunnetts post hoc kontroll, p = 0,760). Nekrose i rhASM /sorafenib behandlede mus var signifikant større enn i mus behandlet med sorafenib alene (t = -2,39, df (22), p = 0,26). (C) Anti-αSMA blodåre flekker avdekket et betydelig lavere antall fartøy (ANOVA df (2,30), F = 12,57, p 0,005) i sorafenib (Dunnetts post hoc test p = 0,020) og rhASM /sorafenib behandlet mus (Dunnetts post hoc test p 0,001). Den rhASM /sorafenib gruppe hadde også betydelig mindre αSMA blodkar enn sorafenib gruppen (t = 2.25, df (22), p = 0,031). (D) Anti-CD34 blodåre flekker bekreftet αSMA resultater, som viser et betydelig lavere antall fartøy (ANOVA df (2,30), F = 32,07, p 0,001) i sorafenib (Dunnetts post hoc test p 0,001) og rhASM /sorafenib behandlet mus (Dunnetts post hoc test p 0,001). Den kombinerte rhASM /sorafenib gruppen hadde signifikant færre CD-34 positive blodårer enn sorafenib gruppen (t = 3.56, df (22), p = 0,002). Selektiv farging av blodårer i parafin innleiret tumorsnitt farget er vist med anti- αSMA (E) og anti-CD34 markører (F). * P 0,05, ** p. 0,001
Analysen av ceramid nivåer i svulster, som viste ingen forskjell mellom gruppene (data ikke vist), ble gjort som et endepunkt måling ved avslutningen av studien (opp til 48 timer etter siste injeksjon). Siden heving av ceramid i celler som respons på ASM er rask og kan gå tilbake til baseline i løpet av minutter, har vi sett på tumor nekrose og blodkartetthet (over) som surrogatmarkører for de biologiske effektene av behandlingen. Siden vi observert en reduksjon i tumorvolum, økning i nekrose, og reduksjon i blodårer tetthet i rhASM /sorafenib gruppe, vi gjorde ikke måle nivåene av andre sphingolipid metabolitter som S1P. Generelt er det imidlertid klart fra våre data at den dominerende effekten av rhASM kombinasjonsbehandling var celledød, og dermed noe nedstrøms S1P som kan ha blitt generert hindret ikke disse rhASM /sorafenib skapte endringer.
Modest distribusjon av rhASM inn subkutane svulster i forhold til sunn leveren
dataene ovenfor viste en positiv, selv om beskjeden, virkningen av kombinert rhASM /sorafenib behandling i denne subkutan Huh7 HCC modell. For å undersøke biofordelingen av enzymet til tumorene, målte vi ASM aktivitet ved slutten av studien. Hvert dyr mottok den siste injeksjonen rhASM 1, 24 eller 48 timer før avlivelse i henhold til det enkelte dyr s doseringsregime. Ingen tilsynelatende forskjell i ASM-aktivitet ble observert i forhold til tiden ventet etter den siste rhASM injeksjon. Som forventet, ASM aktiviteten var betydelig høyere i tumor utdrag fra rhASM /sorafenib behandlet mus sammenlignet med sorafenib alene (Figur 4A). Men ASM aktivitet i friske lever av disse musene var 12 ganger så stor som i de subkutane svulster (figur 4B). Således kan beskjeden biofordelingen av rhASM til de subkutane svulstene forklare den beskjedne effekten av kombinasjonsbehandlingen i denne modellen.
(A) ASM-aktivitet i tumor ekstrakter av rhASM /sorafenib behandlede mus var signifikant høyere (ANOVA, df (2,30), F = 22,58, p 0,001; Dunnetts post hoc test p 0,001) enn kontroll, mens sorafenib hadde ingen effekt på grunnlinjen ASM aktivitet. (B) ASM aktivitet i lever ekstrakter av rhASM /sorafenib behandlet mus også var høyere enn bilens behandlede mus (ANOVA, df (2,30), F = 11,17, p 0,001; Dunnetts post hoc test p 0,001), og sorafenib hadde ingen effekt på grunnlinjen ASM aktivitet. Av notatet, dyr i kombinasjonsbehandlingsgruppen hadde 12 ganger høyere ASM aktivitet i lever enn i tumorer, demonstrere hepatotrope natur rhASM ved kronisk administrasjon og relativt beskjeden fordeling til de subkutane svulster. ** P 0,001. Merk: Y-akser aktivitet (10
-6 mol /L /time) ble målt i like deler av 20% vekt /volum vev ekstrakter som beskrevet i materialer og metoder
Sikkerhet for. rhASM /sorafenib kombinasjonsbehandling
i den fasen jeg sikkerhetsstudie av rhASM i type B OD pasienter, ble den høyeste trygg startdosen fast bestemt på å være 0,6 mg /kg [24]. På grunn av de svært høye doser av rhASM brukt i denne studien (25 mg /kg q.72 h), undersøkte vi potensialet toksisitet av kombinasjonsbehandling ved å overvåke kroppsvekt i løpet av studien og ved å undersøke leverfunksjonen av musene ved slutten av behandlingen. Vektene på starten og ved slutten av behandlingen var ikke signifikant forskjellige (fig S1A). I tillegg ble det ikke observert noen signifikant forskjell i alanin-transaminase (ALT) i enten sorafenib eller rhASM /sorafenib behandlede mus sammenlignet med kontroll (figur S1B). To dyr med høy uteligger verdier av ALAT hadde lommer av betennelsesceller (figur S1B) i en ellers sunt leveren, uten tegn til kronisk skade (figur S1C). Av notatet, den langlivet rhASM /sorafenib mus ID # 452 (ALAT 52 U /L) og ID # 443 (ALAT 53 U /L) var ikke uteliggere. Aspartattransaminase (AST, figur S1D) og total bilirubin (figur S1E) også ble ikke vesentlig endret ved kombinasjonsbehandling. Sammen utgjør disse data tyder på at kombinasjonen av rhASM (25 mg /kg q.72 h) og sorafenib (30 mg /kg qd) er godt tolerert.
Evaluering av rhASM /sorafenib behandling i en orthotopic modell av Huh7 svulster
de ovennevnte positive resultatene av rhASM /sorafenib behandling ble oppnådd til tross for dårlig biodistribusjon av rhASM til subkutane svulster. Vi har derfor begrunnet at resultatene kan bli bedre i en orthotopic modell av HCC. For å etablere en slik modell, ble Huh7-celler som stabilt uttrykker den luciferase-rapportørgenet injiseres i leveren parenchyma av SCID /beige-mus. Dyrene ble fotografert 24 timer og en uke etter operasjonen, og kontrolleres hver 4-5 dager før en fortsatt økning i luminescens ble observert (figur 5A). Dette ble gjort for å sikre at cellene overlevde prosedyren implantasjon og begynte å utvide og generere tumorer. Alle mus hadde påvisbare luminescerende områder i leveren området ved begynnelsen av behandlingen, og sterkt forstørret luminescens områder på slutten av studien -. Svarende til de tumorer som vokser i lever (figur 5B)
(A ) Etter kirurgisk injeksjon av luciferase-merket Huh7 celler, ble luminescens overvåket over tid. Økning i luminescens ≥6 fold grunnlinje (dag 1) ble anvendt som bevis for vellykket implantasjon av celler, initiering av tumorvekst og et punkt for randomisering av mus i behandlingsgrupper. (B) Representative bilder av mus i begynnelsen av medikamentell behandling viser vel påviselig luminescens fra leveren (sett), stor selvlysende område som tilsvarer leveren Huh7 svulst på tidspunktet for offer (innsatser b, c). Lever og tumor ble skåret ut og separert (d) for videre behandling. Scale bar i innsats d er 1 cm. (C) Betydelig lenger median overlevelse av sorafenib behandlede mus (n = 5, 42 dager, chi-kvadrat 4,88, df (1), p = 0,027), og kombinerte rhASM /sorafenib behandlede mus (n = 5, 44 dager, kine- firkantet 4,43, df (1), p = 0,035) ble observert sammenlignet med kontroll (n = 4, 14 dager). ble ikke observert noen signifikant forskjell mellom rhASM alene (n = 4, 19 dager) og kontroll eller mellom sorafenib og rhASM /sorafenib. (D) rhASM aktivitet i orthotopic HCC fra kjøretøy og sorafenib behandlet mus (naive til rhASM behandling, baseline rhASM) var betydelig, 6,4 ± 1,4 ganger lavere enn rhASM aktivitet i svulster fra rhASM og rhASM /sorafenib behandlet mus (t = -3,99 , df (15), p = 0,001). Tilsvarende referanse rhASM i leveren var betydelig lavere, 13,6 ± 1,6 fold, enn aktiviteten til rhASM i leveren hos mus som mottok rhASM eller rhASM /sorafenib (t = -9,07, df (14), p = 3,1 · 10
– 7). Viktigere, forskjellen mellom aktiviteten av rhASM i behandlede mus (rhASM og rhASM /sorafenib) mellom ortotopisk HCC og lever var mye høyere i leveren, 20,8 ± 2,4 fold (t = -8,7, df (13), p = 8,8 · 10
-7, **). Merk:. Y-akser aktivitet (10
-6 mol /L /time) ble målt i like deler av 20% vekt /volum vev ekstrakter som beskrevet i materialer og metoder
Randomisering og initiering av behandling ble utført som beskrevet i Materialer og Metoder. Mus som fikk rhASM /sorafenib kombinasjonen ble startet på samme dose og behandlingsplan som i det subkutane modellen – 30 mg /kg sorafenib q.d. ved gavage og 25 mg /kg rhASM q.72 timer i.p. Selv om vi ikke var i stand til nøyaktig å kvantifisere tumorstørrelsen ved luminescens over tid (sannsynligvis på grunn av det lille antall dyr og kinetikk for luciferin aktivering innen tumorer), var det ingen tydelig platå av luminescens i de behandlede mus. Derfor ble hyppigheten av rhASM administrasjon økte (2-dager-on, en-dag-off) 2 uker i studien i et forsøk på å dempe mulige sub-dosering av rhASM.
Overlevelses profiler av behandlede mus var lik de som ble observert i det subkutane modellen, nemlig ingen signifikant forskjell mellom sorafenib alene og rhASM /sorafenib kombinasjonsgruppene (figur 5C). Overraskende er imidlertid ASM aktivitet i friske leveren hos de behandlede mus var flere ganger større enn i de ortotopiske Huh7 svulster fra de samme dyrene. Dette ligner på resultatene fra de subkutane svulster (figur 4B), noe som indikerer at de fattige biodistribusjon av rhASM å Huh7 svulster var uavhengig av xenograft plassering.
Gitt lignende ASM aktivitetsprofil i de to forskjellige modellene vi neste utforsket ekspresjonen av to reseptorer er viktige i den cellulære internalisering av rhASM – insulinlignende vekstfaktor-reseptor 2 (IGF2R) og mannose-reseptor 1 (MRC1) – i HCC. Analyse av Oncomine database indikerte at uttrykket av
IGF2R
er ikke konsekvent deregulert mellom 4 forskjellige menneskelige HCC datasett, mens uttrykk for
MRC1
ble nedregulert i 3/4 datasett (genet rekkene: topp 11, 2 og 5%). (Tabell 2)
Vi undersøkte derfor uttrykk for
MRC1 /Mrc1
i lever og ortotopiske Huh7 svulster. To ulike sett med PCR-primere ble utformet for å beregne uttrykk for menneskelig og mus
MRC1 Hotell og
Mrc1
hhv. Resultatene (tabell 3) viste ingen påvisbare uttrykk for
MRC1
i humane Huh7 celler eller ortotopiske Huh7 svulster. Ekspresjon ble påvist i friske human lever som en positiv kontroll. Ekspresjonen av mus
Mrc1
var detekterbar i ikke-tumor og lever i Huh7 tumorer. Sistnevnte er på linje med vert-graft «forurensning» som er blitt dokumentert for [25]. Gitt at C
T verdier av ~21 ble observert for begge
Mrc1 Hotell og
Srsf4
husholdningsgenet i muselever, og -25 for
Mrc1 Hotell og
Srsf4
i Huh7 leversvulster, vises uttrykk for
Mrc1
i svulstene å være ~ 10 ganger lavere.
Srsf4
ble anvendt som en husholdningsgenet basert på den stabil ekspresjon ved forskjellige stadier av HCC utvikling [26]. Samlet er disse resultatene avslørende svært lavt
MRC1
uttrykk i Huh7 celler /svulster var i samsvar med den lave ASM aktivitet observert i xenografttumorer etter behandling.
Diskusjoner
endringer i membranlipider av tumorceller, inkludert glykosfingolipider, har blitt anerkjent i over 40 år [27]. Siden da har de strukturelle roller sphingolipids blitt utvidet til å omfatte et intrikat nettverk av bioaktive lipider med ulike roller i mange celleprosesser, herunder celledød og overlevelse. I dag har de viktige rollene som to av disse lipider, ceramider og S1P, blitt godt etablert i kreft. Fokus på ceramider og S1P for kreftterapi er godt plassert siden opprettholde en riktig ceramid /S1P balanse er avgjørende for å bestemme celle skjebne, og endret sfingolipid metabolisme er et felles trekk ved mange kreftformer, noe som fører til reduksjon i ceramid og /eller heving av S1P [10]. Således er sfingolipid medikamenter under utvikling med sikte på å gjenopprette dette stoffskiftebalanse og /eller forbedre ceramid-mediert død av tumorceller eller tumorer mikrovaskulaturen [10], [11]. Flere behandlinger basert på enten heve pro-død ceramid eller redusere pro-overlevelse S1P er aktivt under etterforskning, herunder bruk av ceramid analoger og hemmere av ceramidases eller sfingosin kinaser [28]. I løpet av det siste tiåret rekke artikler har belyst rollene til ceramid, og ASM særlig i cellesignalisering og potensialet for å modulere denne veien i behandling av kreft [14], [29], [30]. Kolesnick og kolleger var den første til å foreslå at lysosomalenzymet, ASM, kan ha en rolle i disse prosessene, og vist betydningen av ASM generert ceramid i Radiosensitivity av tumorceller og tumor microvasculature [31].
Her bringer vi oppmerksomheten til en potensiell anvendelse av sphingolipid modulasjon i eksperimentell HCC ved hjelp rhASM, som har blitt produsert for menneskelig bruk og evaluert for enzymerstatningsterapi i type B OD pasienter. HCC er en spesielt dødelig solid malignitet med en voksende global forekomst og dødelighet [32]. I del, lite lovende resultater i HCC pasienter skyldes til patogenesen av sykdommen, som innbefatter avvikende aktivering av større signalveier så som RAF /MEK /ERK, PI3K /AKT /mTOR, WNT /β-catenin, IGF, HGF /c-MET og angiogenese [2].
