Abstract
Den svært repetitive Alu retroelements regnes som metylering sentre i genomet. Metylering i genet arrangører kan spre seg fra dem. Arrangøren metylering av
MLH1
ofte påvises i kreft, men den underliggende mekanismen er uklar. Målet med denne studien er å forstå om metylering i Alu-elementer er assosiert med arrangøren metylering i MLH1 genet. Bisulfitt genomisk sekvensering ble benyttet for å analysere CpG områder av 5′-enden (promoter, ekson 1 og Alu-inneholdende intron 1) av
MLH1
genet i kolorektal kreft celler og vev, og magekreft vev. Hypometylering i Alu-elementer og hypermethylation i arrangører og regionene mellom arrangører og Alu-elementer ble påvist i to kreftcellelinjer og syv kreft vev. Imidlertid demetylering eller hypometylering av MLH1 promoteren og områder mellom promotoren og de Alu-elementer, og hypermethylation i Alu-elementer, ble identifisert i normalt vev.
MLH1
promoter metylering kan spre seg fra Alu-elementer som er plassert i intron 1 av
MLH1
genet.
trans-virkende
elementer binding til mutasjon områder kan spille en rolle i metylering spre
Citation. Wang X, Vifte J, Liu D, Fu S, Ingvarsson S, Chen H (2011) Spredning av Alu Metylering til arrangøren av
MLH1
Gene i Gastrointestinal Cancer. PLoS ONE 6 (10): e25913. doi: 10,1371 /journal.pone.0025913
Redaktør: Alfons Navarro, Universitetet i Barcelona, Spania
mottatt: 14 juli 2011; Godkjent: 13 september 2011; Publisert: 12 oktober 2011
Copyright: © 2011 Wang et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble støttet av Huazhong University of Science and Technology (2010MS034). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
MLH1
er en stor misparringssystemet som spiller en rolle i å opprettholde stabiliteten av genomet.
MLH1
dysfunksjon kan føre til en høy grad av genmutasjoner i genomet. Arrangøren metylering av
MLH1
, spesielt C-regionen (-310 til -240 i forhold til startkodonet) inneholder 8 CpG områder, er en hyppig hendelse i kreft, noe som kan resultere i tap av
MLH1
uttrykk [1] – [3]. Til dags dato, mekanismen av
MLH1
metylering er uklart. Våre tidligere studier har vist at
MLH1
metylering kan være forbundet med
MLH1
-93SNP [4], [5]. Men det molekylære grunnlag bak dette er ikke kjent.
Alu er en av de repeterende elementene i genomet, som er hypermethylated i normale celler [6]. Alu-elementer antas å være metylering sentre i genomet [7]. I kreft, kan genet promoter metylering spre seg fra tilgrensende repeterende elementer [7]. Graff et al. [8] kartlagt metylering mønstre av
E-cadherin Hotell og
von Hippel-Lindau
tumorsuppressorgener i både normale og neoplastiske celler, og funnet ut at grensene eksisterer mellom unmethylated arrangører og den nærliggende hypermethylated Alu-elementer, for å opprettholde den unmethylated status av promotorene i normale celler, og at grensene kan bli progressivt overstyrt ved metylering av de Alu-elementer, noe som resulterer i promoter metylering i neoplasi.
Tre Alu-elementer har blitt identifisert i intron 1 av
MLH1
ved å søke en database av menneskelige Alu gjenta elementer (fig. 1). Ingen Alu-elementer finnes i
MLH1
promoter-regionen. Metylering status for hvert CpG stedet innen Alu elementer av
har MLH1
ikke vært fant. Det er mulig at
MLH1
promoter metylering oppstår fra nærliggende Alu-elementer. For å teste dette, vi analyserte metylering status for alle CpG områder av
MLH1
5 «enden (C region som inneholder promoteren exon 1 og flertallet av intron 1) (Fig. 1) i kolorektal kreft celler og vev , mage kreft vev og normalt vev ved hjelp av sulfitt genomisk sekvensering, og funnet ut at Alu-elementer i intron 1 av
MLH1
er hypomethylated og arrangører og regionene mellom
MLH1
arrangører og Alu-elementer er hypermethylated i kreft. Men i de normale vev Alu-elementer er hypermethylated, og arrangører og regionene mellom arrangører og Alu-elementer er ikke metylert eller hypomethylated.
Det er tre Alu-elementer i intron 1, hvis størrelser og plasseringer er vist ved nukleotid tall. De relative størrelser og plasseringer av de 27 PCR amplikonene er avbildet med dristige linjer, som dekker et område -339 til 116 + 2876.
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne forskningen har blitt godkjent av gjennomgangen styret i Huazhong University of Science and Technology. Vi har innhentet vevsprøver med skriftlig informert samtykke fra deltakerne i studien. Den etiske komiteen godkjent spesielt prosedyrene.
Normal og kreftprøver
To kolorektal kreft cellelinjer, RKO og SW48, med
MLH1
arrangøren metylering [2] ble bestilt fra Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina). Totalt 188 tykk- og 27 mage kreft vev med matchet normal slimhinne ble hentet fra Tongji sykehus (Wuhan, Kina). Den perifere blod fra en frisk person ble også oppnådd fra sykehus Tongji (Wuhan, Kina).
Cellekultur og DNA
Celler ble dyrket i DMEM supplementert med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C med 5% CO
2 atmosfære. DNA ble ekstrahert fra celler, kreft vev, normal slimhinne og blodprøver ved hjelp av DNA kit (Sangon, Shanghai, Kina) og TIANamp genomisk DNA kit (Tiangen, Beijing, Kina).
Karakterisering av svulster
Alle svulster ble vurdert for mikro ustabilitet (MSI) med fem mikro gjentar (BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, og D17S250), som beskrevet tidligere [1]. For MSI positive tumorer, ble hentet DNA omregnes EZ DNA Metylering Kit (Zymo Research Corporation, Orange, CA, USA).
MLH1
metylering ved cytosines på -250 og -252 i forhold til startkodonet ble vurdert ved hjelp av kombinert bisulfit restriksjonsanalyse (COBRA) med BstUI [1].
Immunhistokjemisk (IHC) farging
IHC farging for MLH1 proteiner ble utført på 5-mikrometer seksjoner fra parafin-embedded tumor og tilstøtende normale vevsblokker med antistoff MLH1 (ab92312, Abcam, UK). Seksjonene ble deparaffinised, rehydrert, og skylt i ledningsvann før antigen gjenfinning ved koking i en 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) to ganger i 5 min. Seksjoner ble inkubert med antistoff over natten ved 4 ° C. IHC farging ble visualisert ved hjelp av streptokokk ABC Complex /pepperrot peroxidise (HPR). Svulster ble gradert av intensiteten av flekker som negativ, svakt positiv, moderat positiv og sterkt positiv.
Bisulfite genomisk sekvense
For COBRA-positive prøver, metylering status for
MLH1
5’end ble fastsatt ved hjelp bisulfit genomisk sekvensering. Totalt var det 27 PCR-amplikoner utformet for å dekke området -339 til 116 + 2 876, i forhold til translasjonsstartsetet (fig. 1). Primerne anvendt er vist i tabell S1. PCR ble utført ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 40 sykluser på 95 ° C i 30 sek, 55-61 ° C i 45 sekunder og 72 ° C i 1 min med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. En varmstart ble benyttet ved å tilsette enzymet i løpet av den første syklusen ved ca. 72 ° C, etter en forinkubering på 5 minutter ved 95 ° C. PCR-produktene ble testet i 2% agarose gel og deretter klonet inn i peasy-T1 vektor (TransGen Biotech, Beijing, Kina). Kolonien PCR ble gjennomført for å skjerme de positive kolonier. De kloner med de riktige størrelser av PCR produktene ble sekvensert på en ABI sequencer med fargestoffterminatorer (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Med sekvense resultatene av fem kloner ble metylering frekvens bestemmes for hver CpG nettstedet.
Mutation screening
MLH1
5 «enden for metylering analyse ble sekvensert med uomvendte DNA fra kreftceller og vev. De 10 par av primere som brukes er vist i tabell 1. PCR ble utført ved 95 ° C i 5 minutter etterfulgt av 35 sykluser av 95 ° C i 30 sek, 58-66 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 min med en endelig forlengelse ved 72 ° C i 7 min. Deretter PCR produktene ble direkte sekvensert ved hjelp av ABI sequencer.
Resultater
Screening av kolorektal og magekreft vevsprøver med MLH1 arrangøren metylering
Av de 188 colorectal og 27 magekreft vev, 48 kolorektal og 9 magekreft prøver ble funnet å ha MSI positiv fenotype. MSI positive prøvene ble deretter undersøkt for MLH1 promoter metylering, og fire tykktarms og 3 magekreft prøvene viste MLH1 promoter metylering (fig. 2).
De fire kolorektal kreft (C8T, C15T, C35T og C156T) og 3 mage kreft (G9T, G19T og G24T) ble analysert. Symbol «-«. Betyr at PCR produktene ble fordøyd uten
BstUI
, og «+» betyr fordøyelse med
BstUI
Association of MLH1 metylering og negative eller svake uttrykk for MLH1
De sju MLH1 metylering prøvene, sammen med sine tilstøtende normalt vev ble analysert for MLH1 uttrykk ved hjelp av IHC farging. Alle de syv cancervev viste negativ eller svakt positiv ekspresjon av MLH1, og deres tilstøtende normale vev hadde sterk ekspresjon (Fig. 3).
A og B representerer en kolorektal tumor (T) og den tilstøtende normalt vev (N ) henholdsvis; C og D viser en gastrisk tumor (T) og den tilstøtende normalt vev (N). A: negativ farging; C: svak flekker; B og D:. Sterk farging
Sammenligning av MLH1 metylering mønstre mellom normaler og kreft
I alt 93 CpG områder som ligger på regionen analysert ble målt for metylering status hjelp bisulfite genomisk sekvensering (fig. 4). De to kolorektale cancercellelinjer, fire MSI positve kolorektal kreft vev, og tre MSI positive magekreft vev viste ulike mønstre i forhold til MSI negative colorectal cancer vev, det normale tykktarms og mageslimhinne og perifert blod (fig. 5). MSI negative kolorektal kreft vev, vises normal colorectal og mageslimhinnen og perifert blod ingen metylering i
MLH1
promoter, og demetylering eller hypometylering (mindre enn 50%) i regionene mellom arrangører og Alu-elementer, mens regionene inne i eller på nedstrømssiden av Alu-elementer oppviste hypermethylation (mer enn 50%). I motsetning til dette, for kolorektal kreft celler og vev (MSI positiv) og magekreft vev (MSI positiv),
MLH1
promotorer og områdene mellom promotorene og Alu-elementer er hypermethylated, med unntak av en svært få hypomethylated CpG nettsteder. Imidlertid regionene inne i eller på nedstrømssiden av Alu-elementer viste en viss grad av hypometylering eller demetylering i forhold til de normale vev. Videre hypometylering og demetylering ble oftere sett i kolorektal og mage kreft vev (MSI positiv) sammenlignet med kolorektal kreft celler (Fig. 5).
CPG nettsteder er understreket. Klon 1, 3 og 4 viste metylering, og kloner 2 og 5 ingen metylering. Metyleringen frekvensen til CpG området er 60%. WT, hvete; CT, konverterte type.
I alt 93 CpG nettsteder er analysert. Imidlertid kan 92 CpG områder ses i normal tykktarmsslimhinne, på grunn av en overgang fra G til A i et område mellom CpG Alus 1 og 2. •, ▴, ▪, □, △ og ○ representerer metylering frekvens på 100%, 80%, 60%, 40%, 20% og 0, respektivt. 80% indikerer at av de 5 kloner, 4 oppviste metylering ved et CpG område. RKO og SW48: kolorektal celler; C8T, C15T, C35T, C156T: MSI positive kolorektal kreft vev; C161T: MSI negativ kolorektal kreft; C161N: C161T matchet normalt vev; og G9T, G19T og G24T. MSI positive mage kreft
Mutasjon screening i kreftceller og vev
Mutasjoner i
MLH1 5 «
ende for metylering analysen ble screenet i 2 kreftceller og 7 cancervev. En tykk- og en magekreft vev ble funnet å ha mutasjoner sammenlignet med sine tilstøtende normale vev (fig. 6). En kolorektal og en magekreft utstilt et identisk heterozygot mutasjon, A → G, på samme sted, IVS1 681 bp. Deres tilstøtende normalt vev viste ikke mutasjonen, noe som indikerer at det er somatisk og tumor-spesifikke.
En kolorektal og en magekreft, C15T og G19T, viste en identisk heterozygot mutasjon, A → G, på samme stedet, IVS1 681 bp. Deres tilstøtende normalt vev, C15N og G19N, viste ikke mutasjonen. Piler viser områder av mutasjonene.
Diskusjoner
metylering mønstre av Alu-elementer i
MLH1
ikke tidligere har vært utforsket i normalt vev. I denne studien, analyserte vi metylering status av CPG steder innenfor de tre Alu-elementer som ligger i intron en av
MLH1
, og fant at alle tre Alu-elementer er i nivåer på hypermethylation i normal tykk- og mageslimhinnen og perifert blod (fig. 5). Det er i samsvar med tidligere funn at Alu-elementer er hypermethylated i normale mageslimhinne, bryst epiteliale og nyrevev [6], [8]. MSI negative colorectal tumor viste meget lik metylering mønster til de normale vev (Fig. 5). Normalt metylering innenfor de Alu-elementer bør ikke spre seg til de tilstøtende CpG øyer på grunn av blokkering av de SP1 elementene [9], [10]. Her viste vi at regionene oppstrøms av Alu-elementer er unmethylated eller hypomethylated i den normale tykktarms og mageslimhinne og perifert blod. Klare grenser er sett mellom hypermethylated Alu-elementer og hypomethylated regioner oppstrøms av dem (Fig. 5). Det er flere hypomethylated CpG områder oppstrøms av de Alu-elementer på de normale vev, og disse CpG områder er ute av C-regionen (Fig. 5), noe som tyder på en begrenset spredning av Alu metylering i normale celler. Noen CpG områder rundt eller inne i Alu-elementer i normale vev vises mindre enn 100% metylering (fig. 5), hvilket antyder at metylering av de enkelte områder ikke er klonalt avledet, selv om det generelle mønster av metylering overføres fra celle til celle. I tråd med dette har det blitt vist at mus adenin-fosforibosyltransferase genet har metylering mønstre som er forskjellige mellom leverceller [10]. Mekanismen bak dette kan være at metylering sentrene identiske gener i ulike celler har variabel styrke på signalet som reiser oppstrøms eller nedstrøms [11].
Brudd SP1 elementene letter
de novo
metylering av de tilstøtende områder CpG [9], [10], [12], og induserer epigenetisk geninaktivering [12]. Det foreslås at Alu-elementer er metylering sentre i genomet [8]. De metylering mønstre av Alu-elementer i
MLH1
denaturert tykktarmskreftceller RKO og SW48 er ikke undersøkt tidligere. RKO og SW48 har blitt funnet å ha metylering i
MLH1
promoter-regionen, spesielt i C-regionen (-310 til -240 i forhold til startkodonet), noe som fører til redusert
MLH1
uttrykk [2]. I denne studien har vi også analysert metylering mønstre i
MLH1
arrangører, de tre Alu-elementer og regionene mellom arrangører og Alu-elementer. Sammenlignet med normal kolorektal og mageslimhinnen og perifert blod, de Alu-elementer viste hypometylering spesielt i Alus 2 og 3 i både RKO og SW48. Videre regionen nedstrøms for Alu 3 viste hypometylering i både RKO og SW48 (fig. 5). Imidlertid ble arrangører og spesielt regionene mellom arrangører og Alu-elementer hypermethylated i RKO og SW48 (Fig. 5). Dette tyder sterkt på at
MLH1
promoter metylering sprer seg fra de metylering sentre innen intron 1 av
MLH1
.
Fordi kultivert kreftcellelinjer anses å ha en høyere grad av metylering enn primærsvulster [13], bestemte vi oss for å analysere de primære svulster for MLH1 metylering mønster i de samme områdene som cellelinjene. En noe lavere grad av metylering ble detektert i MLH1 promotorområdet i fire MSI positive tykk- og 3 MSI positive gastriske cancere i forhold til de to cellelinjer (Fig. 5). Imidlertid hypermethylated promotorer, særlig i C-regionene, og områdene mellom promotorene og Alu-elementer blir observert i alle syv kreft analysert. Noen regioner i og rundt Alu-elementer ble åpenbart hypomethylated i tumorvev. Derav data fra cancervev tyder sterkt på at metyleringen sprer seg fra de Alu-elementer til 5′-regionen av MLH1 i MSI positiv kolorektal og magekreft vev, så vel som i de kolorektale cancercellelinjer. Alu hypometylering er blitt identifisert i gastriske karsinomer og melanomcellelinjer [6], [14]. En annen repeterende sekvens, LINE-1, viste også hypometylering i maligne gastrointestinale stromale tumorer [15]. Hypometylering kan øke malignitetspotensiale av svulster ved å fremkalle opphopning av kromosomavvik eller metylering sprer seg til arrangører av tumorsuppressorgener. Dermed metylering av repeterende sekvenser kan være en nyttig markør for malignitet vurdering.
En SP1 element ble identifisert på -119 av
MLH1
promoter-regionen bruker transkripsjonsfaktor søkeprogramvare (TFSEARCH versjon 1.3 ). For å fastslå om det er mutasjoner i SP1 element, sekvensert vi hele regionen analysert ovenfor i kreftcellelinjer og vev. Ingen mutasjoner i SP1 element ble oppdaget, men en MSI positiv kolorektal og en MSI positiv magekreft viste A → G mutasjon, på samme sted, IVS1 681 bp i MLH1 genet. Dette nettstedet er mellom arrangøren og Alu-elementer. Våre funn tyder på at regionen er et mutasjons hotspot i patogenesen av tykktarms og magekreft. Vi spekulerer i at
trans-virkende
elementer binding til dette nettstedet eller andre nettsteder som er mellom arrangøren og Alu-elementer, kan være involvert i metylering spredning fra Alu-elementer til promoter-regionen. Derfor, de
trans-virkende
elementer kan oppføre seg som voktere av metylering sentre, f.eks Alu-elementer. Videre studier er nødvendig for å søke etter de
trans-virkende
elementer, som kan være de terapeutiske mål av kreft i fremtiden.
Hjelpemiddel Informasjon
Tabell S1.
Oligonukleotid-sekvensene av primerne for metylering analyse.
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025913.s001 plakater (DOC)
Takk
Vi takker Anna Yates for kritisk gjennomgang av manuskriptet
