Abstract
Cancer stamceller bidra til ondartede fenotyper av en rekke kreftformer, men markører for å identifisere menneskelige hypopharyngeal kreft (HPC) stamceller forbli dårlig forstått. Her rapporterer vi at CD271
+ befolkningen sortert fra xenotransplanted HPCS besitter en forbedret tumor initiere evne i immunsvikt mus. Svulster som genereres fra den CD271
+ -celler inneholdt både CD271
+ og CD271
– celler, noe som indikerer at populasjonen kunne gjennomgå differensiering. Immunohistologiske analyser av tumorer viste at CD271
+ celler lokalisert til en perivaskulær nisje i nærheten av CD34
+ vaskulatur, til invasive fronter, og til basallaget. I samsvar med disse egenskapene, en stemness markør,
Nanog
, og
matriksmetalloproteinaser (MMP)
, som er innblandet i kreft invasjon, var signifikant oppregulert i CD271
+ sammenlignet med CD271
– cellepopulasjon. Videre bruker primær HPC prøver, viste vi at høy CD271 uttrykk ble korrelert med en dårlig prognose for pasientene. Til sammen våre funn tyder på at CD271 er en roman markør for HPC stilk-lignende celler og for HPC prognose
Citation. Imai T, Tamai K, Oizumi S, Oyama K, Yamaguchi K, Sato jeg, et al. (2013) CD271 Definerer en stamcelle-Like Befolkning i hypopharyngeal Cancer. PLoS ONE 8 (4): e62002. doi: 10,1371 /journal.pone.0062002
Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children Hospital Medical Center, USA
mottatt: 12. desember 2012; Godkjent: 17 mars 2013; Publisert: 23 april 2013
Copyright: © 2013 Imai et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av JSP KAKENHI tilskudd tall 24300326, 21791589, 24592613, JST CREST, og tilskudd-i-hjelp fra Helsedepartementet, Arbeids- og velferdsdirektoratet, og Takeda Medical foundation, Ichiro Kanehara fundament. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
hode og hals plateepitelkarsinom (HNSCC) er den sjette vanligste kreftformen i verden, med nesten 500 000 nye tilfeller og anslagsvis 300.000 dødsfall hvert år. Dette begrepet omfatter ulike uavhengige kreftformer, som muntlig, nasofaryngeal, orofaryngeal, og hypopharyngeal kreft [1]. Hypopharyngeal kreft (HPC), en malignitet av hypopharynx, står for omtrent 10% av alle HNSCCs. Epidemiologiske studier viser at tobakk og alkohol bidrar til dens karsinogenese [2]. Dessverre er ca 80% av tilfellene HPC avansert på diagnosetidspunktet, dvs. pasientene er i stadium III eller IV [3], slik at behandling er vanskelig. Radikal kirurgi som totalt laryngopharyngoesophagectomy resulterer i tap av stemmen, og samtidig kjemoradioterapi fører ofte livstruende bivirkninger. Forsinket regional lymfeknutemetastase, fjernmetastaser, og flere kreftformer forekommer ofte i løpet av sykdommen [3]. Den 5-års overlevelse av HPC pasientene er ikke mer enn 30% [4], noe som tyder på et sterkt behov for innovative behandlingsstrategier.
akkumulere bevis på de siste årene støtter kreftstamcelle (eller initiere celle) teorien [5], [6]. I denne fascinerende scenario, er kreft består av et hierarki av heterogene cellepopulasjoner, og er initiert fra en begrenset undergruppe av celler med stamcellelignende egenskaper. Med sin selvfornyelse aktivitet og tumor-initiering evne, kreft stamceller (cscs) eller kreft initiere celler (CIC) genererer ikke-kreftstamceller som en «Avkom «befolkning. Motstand mot kjemoterapi og strålebehandling er et annet karakteristisk for cscs. Dermed kan cscs være ansvarlig for behandlingssvikt med kjemoterapi og strålebehandling, og dårlige kliniske resultater. Mot målet om å utvikle nye CSC-målretting terapier, har forskere forsøkt å identifisere og karakterisere celleoverflatemarkører for cscs.
I HNSCC, har CD44
+ celler er identifisert som cscs. Når kliniske kreft prøvene er xenopodet inn i immunodefekte mus, CD44
+ -celler, men ikke CD44
– celler initiere tumorer, og de resulterende tumorer generere et hierarki av heterogene cellepopulasjoner [7]. Men en fersk studie viste at CD44
– cellene danner kuler, har tumor-initiering evne, og er kjemoresistent, som CD44
+ celler [8]. Således kan cscs være dynamisk og heterogene i ulike microenvironments [9], og de CD44
+ celler kan ikke representere rene HNSCC cscs. I tillegg HNSCC seg selv er heterogent, som representerer forskjellige krefttyper, slik som beskrevet ovenfor. Derfor rettet mot forskning for hver type kreft kan føre til identifisering av ytterligere CSC markører.
CD271 er et trans protein som tilhører tumor nekrose faktor reseptor super. Det er også en nervevekstfaktor-reseptor (NGFR), og samvirker med neurotrofiner, slik som NGF, hjerne-avledet neurotrofisk faktor (BDNF), neurotrofin-3 (NT3), og neurotrofin-4 (NT4), med lav affinitet [10 ]. Tidligere studier tyder på at vev stamceller av oral [11], strupehodet [12], og esophageal [13] plateepitel epitel uttrykke CD271. CD271 er også forbundet med cscs av malignt melanom [14], [15] og esophageal plateepitelkarsinom [16].
I denne studien, viser vi at CD271
+ cellepopulasjonen av HPC besitter tumor-initiering evne
in vivo
, og har flere CSC-lignende egenskaper.
Materialer og metoder
tumor Implantasjon
Etter å innhente samtykke, friske vevsprøver ble oppnådd ved Miyagi Cancer (MCC), transportert til laboratoriet i avkjølte PBS (-), og utsatt for videre analyser. Alle tumorprøver ble anonymisert i henhold til MCC Institutional Review Board. NOD /SCID /IL-2RγC
null (NOG) mus kjøpt fra Sentralinstitutt for forsøksdyr Japan ble bedøvet med pentobarbital. Når mus sov, ble hud innsnitt gjort, og små biter av vevsprøver ca. 50 mm
3 ble implantert under huden på flanken på begge sider. Tumordannelse ble overvåket ukentlig, og tumorvolumet ble beregnet ved formelen: 1/2 x vertikalt område x horisontal rekkevidde x høyde. Når de opprinnelige svulster i xenotransplanted nog musene nådde over 10 mm i diameter, ble musene avlivet og tumorene ble oppdelt i prøver for enkeltcelle-fordøyelse, sfære formasjon, formalin fiksering for histologi eller seriell passasje i mus. Dyret omsorg og eksperimentelle protokoller ble utført i henhold til de prosedyrer og retningslinjer fastsatt av MCC administrative paneler for forsøksdyr omsorg. Alle operasjoner ble utført under bedøvelse, og alle anstrengelser ble gjort for å minimere lidelse.
Utarbeidelse av encellede utestengelse fra Tumor vevsprøver
Under aseptiske forhold, svulster ble kuttet opp i små fragmenter, og fint hakket med en steril skalpell. Etter å ha blitt vasket med PBS (-), ble tumorvevet dyppet i en oppløsning inneholdende PBS (-), 1 mg /ml DNase1 (Roche), og 1 mg /ml Collagenase /Dispase (Roche), og inkubert ved 37 ° C i 2 eller 3 timer, inntil fullstendig spaltning hadde funnet sted. Cellene ble ført gjennom en 40-mikrometer nylonduk, og vasket 3 ganger med PBS (-). Etter sentrifugering ble pool av enkeltceller delt, og cellene ble anvendt for FACS-analyser eller sfære kultur. For sfære kultur ble cellene suspendert i serumfritt DMEM /F12 supplert med B27 (Invitrogen), human rekombinant epidermal vekstfaktor (EGF: 20 ng /ul: Peprotech), og human basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF: 20 ng /. ul: Peprotech) på ultralave festekulturskåler (Corning)
Flow Cytometry Analysis and Cell Sorting
Dissosierte enkeltceller ble suspendert i PBS (-) med 3% FBS. Cellene ble farget med anti-human spesifikke EpCAM antistoffer (1:10, FITC-konjugert, Miltenyi Biotec), anti-human CD271 antistoffer (1:10, APC-konjugert, Miltenyi Biotec), anti-human CD44 antistoff (1: 10, APC-konjugert, Becton Dickinson), anti-humane CD133 antistoff (1:10, APC-konjugert, Miltenyi Biotec), og anti-mus IgG1, κ isotypekontrollantistoffer (1:20, APC og FITC-konjugert, Biolegend og Becton Dickinson, henholdsvis). 7-AAD ble benyttet for å ekskludere døde celler (Sigma, 1 pg /ml). De fargede celler ble enten analysert med en FACSCanto ™ II (Becton Dickinson) eller sortert med en FACSAria ™ II (Becton Dickinson), i samsvar med produsentens protokoll.
Sanntids Reverse Transcription (RT) -PCR
Den totale RNA ble renset fra sortert enkeltceller eller vevsprøver ved hjelp av en Mirvana ™ miRNA Isolation Kit (Ambion), og transkribert ved hjelp av en PrimScript II cDNA Synthesis Kit (Takara Bio). Real-time RT-PCR ble utført ved hjelp av Brilliant III Ultra-Fast SYBR Grønn QPCR Master Mix (Agilent Technologies).
GAPDH
ble anvendt som et endogent gen referanse. Primersekvensene brukes for real-time RT-PCR er oppført i tabell S1.
Immunohistochemistry (IHC)
Parafin-embedded, formalinfiksert, 3-mikrometer vevssnitt ble deparaffinized i xylen og rehydrert gjennom etanol for å destillert vann. Heat-indusert epitop gjenfinning ble utført av mikrobølgeovnen seksjoner i en pH 9,0 mål henting løsning (Dako). Endogen peroksidase ble blokkert med 0,3% H
2o
2. Snittene ble inkubert med primære antistoffer mot humant CD271 (1:4000, BD Biosciences) i 20 minutter, eller til CD34 (Nichirei Biosciences) eller Ki-67 (01:10, Santa Cruz Biotechnology) i 60 minutter, ved 37 ° C . Seksjonene farget for CD271 ble inkubert i 15 min med musen linker (Dako), deretter sekundære antistoffer og DAB kromogen (Envision ™ FLEX Kit, Dako) ble brukt som beskrevet i produsentens protokoll. Til seksjonene farget for CD34 eller Ki-67 ble enkelt Stain AP (M) (Nichirei Biosciences) anvendt som det sekundære antistoff, og fargingen ble visualisert med ny Fuchsin Substrat (Nichirei Biosciences). For den doble farging av CD34 eller Ki-67, med CD271, CD34 eller Ki-67 farging ble utført først, etterfulgt av at for CD271, som beskrevet ovenfor.
In vivo
tumorigenesis analyse~~POS=TRUNC
Dissosierte svulster ble sortert basert på den menneskelige EpCAM og CD271 uttrykk, som EpCAM
+ CD271
+ celler eller EpCAM
+ CD271
– celler. De sorterte celler ble suspendert i 200 ul Matrigel matrise (BD Biosciences) ved 4 ° C, deretter injisert subkutant inn i flankene av nog mus med en 1 ml sprøyte. Hver mus mottok CD271
+ celler i høyre side, og CD271
– celler i venstre. Svulstdannelse ble overvåket av ukentlig inspeksjon og palpasjon.
In vivo
Kjemoterapi analysen
Cisplatin (CDDP), en anti-kreft narkotika klassifisert som en platina reagens, ble administrert intravenøst eller intraperitonealt i 5 eller 7,5 mg /kg. En uke senere ble musene avlivet og tumorene ble ekstrahert. Svulstene ble delt og enten fast med formalin for IHC eller dissosiert til enkeltceller og utsatt for FACS-analyse.
statistikker
Analysene av sykdomsspesifikk overlevelse og tilbakefall overlevelse ble utført med Kaplan-Meier metoder, og log rank test ble anvendt for å evaluere forskjellen mellom gruppene. Fishers eksakte test ble brukt for å sammenligne to grupper ( «sterke» versus «moderat til svake» CD271 uttrykk) i resected svulster fra 28 tilfeller av HPC, og chi-kvadrat test ble brukt til å sammenligne de samme to gruppene i IHC studie av 83 HPC tilfeller. De gjennomsnittlige verdier av
Nanog
uttrykk mellom de to gruppene ble analysert med t-test. Signifikansnivået ble satt til
p
. 0,05
Etikk
Institutional Review Board of MCC godkjent denne studien protokollen, og skriftlig informert samtykke ble innhentet fra hvert fag. Protokollen fra dyreforsøk ble godkjent av MCC Animal Care og bruk Committee (Permit Number: MCC-AE-2011-8).
Resultater
HPC Svulster Inkluder en undergruppe av CD271
+ Cells
for å undersøke startfasen og kreft stamceller, ble friske primære vevsprøver hentet fra HPC-pasienter som gjennomgår kirurgi implantert under huden på 8-10 uker gamle Nog mus. Tre uavhengige menneskerettighets HPC prøver med lignende kliniske kjennetegn ble brukt til å etablere primær xenograft linjer (HPCM1-3) (tabell S2). Den histologi av hver xenograft var i samsvar med sitt primære prøven (Figur S1).
For å karakterisere serielt xenotransplanted tumorlinjer, ble deres celleoverflaten markør uttrykk analysert. Hver tumor ble ekstrahert fra verten og fremstilt som en én-cellesuspensjon. Fordi EpCAM er rapportert å være en diagnostisk tumor-cellemarkør for HNSCC [17], de humane EpCAM-positive celler ble strengt gated for å eliminere verts-avledede celler, og analysert ved hjelp av strømningscytometri. Blant de CSC markører som ble testet, ble cellene negative for CD133, og 3,4% av tumorcellene var positive for CD44 (data ikke vist). Uventet, observerte vi en CD271
+ undergruppe blant de tre HPC linjene som ble testet (figur 1A). I gjentatte forsøk ble CD271
+ -populasjonen representert 2,99 til 20,1% av cellene i HPCM1. Lignende CD271
+ populasjoner var tydelig til stede i de to andre linjene: 2,90 til 9,54% for HPCM2 og 19,1% for HPCM3. Deretter analyserte vi parafininnstøpte deler av svulster avledet fra xenotransplanted HPC-linjer for CD271 ved IHC (figur 1B). Innenfor de typiske squamous cell carcinoma er dannet av tre linjer, CD271
+ -celler var hovedsakelig tilstede i basallaget av tumoren, nesten begrenset til den perifere sone av tumoren reiret, og knapt i det sentrale parti (figur 1B) . Under høy forstørrelse, ble CD271
+ celler observert ved siden av stroma (Figur 1B-d). Disse CD271
+ celler oppviste morfologisk umodne fenotyper, mens den CD271
– celler i den sentrale sone av tumoren reiret hadde mer modne, flat, og keratiniserte former (figur 1B-e). For ytterligere å karakterisere lokalisering av CD271
+ celler i HPC, farget vi cytokeratins (CKs) i seriesnitt (Figur S2). CK5 /6 tendens til å lokalisere til basale lag og prolifererende suprabasal avdelinger, og CD271
+ celler ble lokalisert innenfor CK5 /6-positive regionen. Den CD271
+ celler var også moderat positiv for CK8, som markerer udifferensierte SCC celler. Disse resultater antyder at den CD271
+ -populasjonen er inkludert i basal-lags parti av CK5 /6-positive område, og delvis overlapper med CK8-positive udifferensierte celler.
(A) Celler avledet fra tre HPC xenotransplanted linjer ble farget for CD271 og analysert ved FACS. (B) Tumor vev dissekert fra mus transplantert med de tre HPC linjer ble analysert for ekspresjon av CD271 IHC. Immunopositivity vises brun (a, b og c). Høy forstørrelse bilder er knyttet til sine respektive eske områder med piler. Skala: 100 mikrometer. Rød linje angir grensen av svulsten og stroma (d). Rød linje angir grensen til en CD271
+ celle klynge og CD271
– celler, og røde og blå pilene viser CD271
+ celler og CD271
– celler, henholdsvis (e). (C) Representative resultater av IHC for CD271 i kliniske prøver. Normal slimhinnen (a), karsinom
in situ
. (B). Pilspisser indikerer en invasiv front, og sterkt positiv CD271 uttrykk (c, d). (D) IHC for CD34 med ny Fuchsin substrat (a), og dobbel farging for CD34 (New Fuchsin) og CD271 (DAB) (b-e). CD34 immunopositivity vises rødt. Innfellinger viser høy forstørrelse bilder av eske områder. Røde pilspisser indikerer CD34-positive microvessels, og brune pilspisser indikerer CD271
+ celler. (E) Sphere dannende celler av HPCM1 og forhøyet CD271 uttrykk i FACS analyse. Skala: 25 mikrometer. (F) IHC for dobbel farging av Ki-67 (New Fuchsin) og CD271 (DAB). Ki-67 immunopositivity vises rødt i kjernen. Røde pilspisser indikerer Ki-67-positive celler. Skala:. 100 mikrometer
Vi har også undersøkt CD271 uttrykk innen klinisk dissekert HPC prøver. Først må vi bekreftet at CD271
+ -celler var tilstede i den mest basale lag av normal hypopharyngeal slimhinne (figur 1C-a). Tilsvarende, i en carcinoma
in situ product: (
CIS
) prøven, CD271
+ celler ble begrenset til basal laget, og var borte fra de mer differensierte øvre lag (Figur 1C- b). Vanligvis er de fleste kreftceller som befinner seg i den invasive foran var CD271
+ (figur 1C-c, d). Vi undersøkte også om CD271
+ celler ble plassert i nærheten av blodkar i svulster. Vi fant ut at CD34
+ mikrovaskulære endotelceller (rødt i figur 1D) ble plassert i CD271
+ celleområder, og forstørret bildene viste at noen CD34
+ og CD271
+ celler var nær hverandre annen, eller i direkte kontakt (figur 1D-a, b). Av notatet, i de fleste av prøvene, den CD271
+ celler dannet tette klynger som var omgitt av stroma, som inneholdt CD34
+ microvessels (figur 1D-c, d, e). Sammen utgjør disse data antyder at det CD271
+ celler er til stede i invasiv foran og i det perivaskulær område av tumors.It er vel kjent at celler fra forskjellige krefttyper, inkludert HNSCC, som danner kuler i henhold til opphengsdyrkningsforhold omfatter cscs [18 ]. Derfor undersøkte vi om sfære-formasjon kulturen vil påvirke CD271 uttrykk. Dissosierte kreftceller generert kuler som overlevde i 12 dager, og enkeltceller fremstilt fra disse kulene ble utsatt for CD271 analyse (figur 1E). CD271 ble uttrykt i 46,5% av disse cellene, i motsetning til den opprinnelige tumorcelle HPCM1, hvori 2,99 til 20,1% av cellene var CD271
+. Dette resultatet antydet at
in vitro
sfære dannelse forårsaket anriking av CD271
+ celler.
Vi undersøkte også om CD271
+ celler er en prolifererende populasjonen. Doble -staining eksperimenter med Ki-67 og CD271 viste at CD271
+ celler for det meste vært bosatt i basal laget, mens Ki-67-positive celler lokalisert hovedsakelig til relativt differensierte suprabasal lag (figur 1F). Disse resultatene tyder på at CD271
+ celler er ikke aktivt prolifererende
in vivo
.
CD271
+ Cells er Svulst og Skille
in vivo
Vi neste undersøkte
in vivo
tumorigenicity av CD271
+ celler av de tre HPC linjer. Tretti til 100000 CD271
+ eller CD271
– celler ble subkutant injisert inn i hver side av den samme musen for å unngå eventuelle verts /miljø forskjeller (figur 2A). Nøyaktigheten av sorterings ble bekreftet ved FACS-analyse (figur 2B). De xenotransplantasjon Resultatene er oppsummert i tabell 1. I HPCM1, den CD271
+ -celler initiert tumorer ved en ekstremt høy hastighet, selv om færre enn 300-celler (men minst 30 celler) ble injisert. Tretti CD271
– celler som genereres en tumor i bare en av seks forskjellige vaksiner, og tumoren som ble dannet var mye mindre enn de som er initiert av CD271
+ celler (figur 2C). Tilsvarende for HPCM2, alle svulster som dannes, med unntak av én, oppsto fra CD271
+ celler. Selv om CD271
– cellene i HPCM3 generert svulster, viste de en lengre ventetid og lavere frekvens enn de som utviklet seg fra CD271
+ celler. Disse data indikerte at CD271
+ celler besatt høyere tumorigenicity enn CD271
-. Celler
in vivo
(A) Representative svulster hos mus inn som angitt antall celler ble transplantert. Røde pilspisser indikerer CD271
+ celle injeksjonssteder (høyre side), og blå pilspisser indikerer CD271
– celleinjeksjonssteder (venstre side). Sirkler og stiplede sirklene viser transplantasjons steder resulterer i suksess og fiasko for tumordannelse, henholdsvis. (B) Flowcytometri analyse av de sorterte cellene (96.8~99.5% CD271
+ eller CD271
– celler). (C) Tretti CD271
+ celler (høyre side) og CD271
– celler (venstre side) ble transplantert inn i en mus, og de genererte svulster ble resected. Tumorvekst ble plottet ved hjelp av gjennomsnittsverdien. (D) Strømningscytometri-analyse av CD271 ekspresjon av tumorceller som følge av injeksjon av CD271
+ -celler. Tumorsnitt ble farget med hematoksylin og eosin (H E). Skala:. 100 mikrometer
Morfologisk den CD271
+ celler dannet svulster som lignet den originale histologisk, med typiske SCC funksjoner: basalcellelignende morfologi i randsonen og differensierte celler i det sentrale parti av tumoren reiret (figur 2D). De genererte Tumorene ble også kontrollert for CD271 ekspresjon ved strømningscytometri. Svulstene oppstår ved CD271
+ celler inneholdt både CD271
+ og CD271
– celler (figur 2D). Dermed blir CD271
+ populasjonen har potensial til å generere et hierarki av CD271-uttrykkende og ikke-uttrykkende celler, så vel som evne til å initiere kreft.
Gene Expression Profil av CD271
+ celler avslører noen kjennetegn ved Stemness og Invasivitet
neste bedt om CD271
+ befolkningen hadde egenskaper knyttet til ondartede celler i form av stemness og invasjon /metastasering. Først uttrykk for pluripotent stamcellerelaterte gener,
Nanog
,
Sox2
, og
Oct-4
ble undersøkt. Real-time RT-PCR-analyser indikerte at
Nanog
uttrykk var signifikant høyere i CD271
+ celler av de tre HPC linjer enn i CD271
– celler (figur 3A). IHC av seriesnitt viste at inkludering av CD271
+ -celler i Nanog-positive basallaget (figur S3A). Men uttrykket av
Sox2 Hotell og
Oct-4
viste ingen konsistent tendens (figur S4). Deretter uttrykket av tre sekresjon-type invasjonsrelaterte gener,
MMP1
,
MMP2
, og
MMP10
ble undersøkt (Figur 3B). CD271
+ celler fra de tre HPC linjene viste en markant økning i
MMP1
, som varierte 2,3 til 7,3 ganger sammenlignet med CD271
– celler. Likeledes
MMP2
ble økt 3,6 til 4 ganger i CD271
+ celler. Prominent
MMP10
oppregulering ble sett i CD271
+ befolkningen i HPCM3, på et nivå som var mer enn 40 ganger større enn i CD271
– celler. Vi utførte serie IHC-farging av MMP1, MMP2, og MMP10, og fant at CD271
+ celler var positive for disse MMP’er (fig S3b). De mRNA nivåer for
MMP9, MMP11, og MMP14 (MT1-MMP)
varierte mellom cellelinjene, med to linjer ut av de tre Vise økt uttrykk av hver MMP (figur S5). Med tanke på lokalisering av CD271
+ celler ved invasive fronter, disse resultatene antydet at CD271
+ celler er bevæpnet med MMP som gjør at vevet invasjon ved å bryte ned den ekstracellulære matrise.
Nanog
uttrykk (A) og
MMP1
,
MMP2
, og
MMP10
uttrykk (B) i CD271
+ og CD271
– celler avledet fra de tre HPC linjer ble analysert ved hjelp av sanntids-RT-PCR. De transkripsjonsnivåer ble normalisert til de for
GAPDH
, og folden endringen i MMP ekspresjonsnivået i CD271
+ celler versus CD271
– celler ble beregnet for hver prøve. Verdier er gjennomsnitt ± SD av tredoble eksperimenter.
CD271
+ Cells er kjemoresistent
in vivo
For å finne ut om CD271
+ befolkning er kjemoresistent ble effekten av CDDP på cellene analysert. Vår første
in vitro
analyse mislyktes på grunn av vanskeligheter i vevskultur vedlikehold, enten under vanlige vev kultur forhold med serum eller under serumfrie sfære dyrkningsforhold (data ikke vist). Derfor brukte vi en
in vivo
evaluering modell. Mus som bærer HPCM1-avledede tumorer ble behandlet med CDDP, og på dag 7, ble tumorene tatt reseksjon, gjennomskåret og undersøkt ved IHC for CD271 (figur 4A). Det utflatede og keratiniserte CD271
– celler i den sentrale sone av tumoren var i ferd med å dø, noe som tyder på at kjemoterapi hadde forårsaket massiv nekrose i disse celler (figur 4A). I motsetning til dette, som var mest tydelig i basallaget, CD271
+ celler overlevde og var omgitt av stroma. For å verifisere at CD271
+ celler var refraktære til CDDP ble en encellet suspensjon fremstilt av en CDDP-behandlede tumor analysert ved FACS (figur 4B). Etter CDDP administrasjon, den CD271
+ befolkningen økt fra 16,3% til 35,2%, noe som tyder på at CD271
+ celler var resistente mot CDDP. Den multi-medikamentresistens av cscs er knyttet til en forhøyet ekspresjon av ATP-bindende transportører [19], for eksempel, ABCC2 bidrar til utstrømningen av CDDP og docetaxel, og ABCB5 og ABCG2 bidrar til utstrømningen av 5-FU. Vi sammenlignet derfor uttrykket av disse tre ATP-bindende transportører i CD271
+ og CD271
– celler HPCM1 (figur 4C). Uttrykket av
ABCC2
,
ABCB5
, og
ABCG2
i CD271
+ celler ble omtrent 2,5 ganger, 4,8 ganger og 2,4 ganger høyere enn i det CD271
– celler, respektivt. Sammen utgjør disse resultatene indikerer at CD271
+ celler er kjemoresistent.
(A) HPCM1- transplanterte mus ble behandlet med 7,5 mg /kg av CDDP i en uke, deretter den genererte tumorer ble analysert ved IHC for CD271. Boxed områder er knyttet til sine respektive høy forstørrelse bilder ved horisontale piler. Skala: 100 mikrometer. (B) FACS analyser for CD271 i HPCM1 celler avledet fra mus med eller uten CDDP behandling. (C) Uttrykk for
ABCC2
,
ABCB5
, og
ABCG2
i CD271
+ og CD271
– celler analysert ved real-time RT-PCR . Transkripsjonsnivåer ble normalisert til de av
GAPDH
, og dobling av hvert genuttrykk nivåer i CD271
+ celler versus CD271
– celler er vist. Verdier er gjennomsnitt ± SD av tredoble eksperimenter.
CD271 uttrykk på HPC kliniske prøver er korrelert med en dårlig prognose
For å undersøke om CD271 uttrykk var forbundet med noen prognostiske faktorer for primær HPC pasienter, ble 83 kliniske prøver hentet fra kirurgi eller biopsi undersøkt for CD271. For denne evalueringen, fordi CD271
+ celler ble heterogent ligger innenfor hver svulst, brukte vi et karaktersystem som klassifiseres hvert tilfelle som enten «sterk», hvis det hadde mer enn 50% CD271
+ celler i hele tumor, eller «moderat til svak,» hvis den hadde mindre enn 50%. Alle lysbildene ble evaluert uavhengig av to forskere (I. S. og K. M.) uten forutgående kunnskap om hver enkelt pasients kliniske opplysninger. Ved IHC farging av HPC vevsprøver med en anti-CD271 antistoff, ble 36 av de 83 tilfellene klassifiseres som sterk, og 47 var moderat til svak (figur 5A). De kliniske og patologiske egenskaper ved de 83 pasientene er oppsummert i Tabell S3. Den CD271 karakteren ble analysert statistisk med hensyn til klinisk T-stadium, N-stadium, og det stadium av sykdommen. Prosentene kreft ved avansert T stadium (T3 eller mer) og avansert N stadium (N2 eller mer) var signifikant høyere i CD271 sterk gruppe enn i moderat til svak gruppe (47,2% vs 23,4%:
p
= 0,023, og 69,4% vs 40,4%:
p
= 0,009, henholdsvis). Tilsvarende tilfeller av avansert sykdom (stadium III og IV) var hyppigere i CD271 sterk gruppe enn i moderat til svak gruppe (80,6% vs 55,3%:
p
= 0,016). Deretter ble sykdomsspesifikk overlevelse sammenlignet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoder. De tre-års overlevelse var signifikant lavere i CD271 sterk gruppe i forhold til CD271 moderat til svak gruppe (54,3% vs 83,2%:
p
= 0,043) (figur 5B). Disse data indikerer at den histologiske ekspresjonen av CD271 er forbundet med dårlige kliniske resultater.
(A) Representative resultater av IHC analyser for CD271 i kliniske prøver erholdt fra 83 pasienter HPC ved kirurgi eller biopsi. Immunopositivity vises brun. Prøver med mer enn 50% positive celler i hele svulsten ble klassifisert som «sterk» (øverst), og mindre enn 50%, som «moderat til svak» (nederst). (B) Kaplan-Meier analyse for sykdomsspesifikk overlevelse (3 år) av de «sterke» og «moderat til svake» grupper. * Statistisk signifikant.
Vi videre undersøkt om
CD271
genuttrykk i kliniske prøver ble assosiert med pasientenes prognose. For denne analysen ble 28 tilfeller av HPC som ble helt resected, som vurderes både kirurgisk og histologisk, undersøkes for
CD271
uttrykk. Umiddelbart etter reseksjon, ble hver prøve separert i tumor og normal hypopharyngeal slimhinne. De totale RNA renset fra disse respektive vev, ble utsatt for
CD271
mRNA kvantifisering. Fordi normal slimhinne uttrykker også CD271 (figur 1C), vi brukte en «CD271-uttrykk indeksen,» verdien av
CD271
i tumor versus at i normal slimhinne, som CD271 nivå. Under den gjennomsnittlige 20-måneders oppfølgingsperiode, 11 av de 28 tilfellene tilbakefall. Alle tilbakefall inntraff innen 18 måneder, og tilbakefall overlevelse i 18 måneder ble analysert ved hjelp av Kaplan-Meier metoder (Figur 6A). Ved hjelp av en cut-off verdi for CD271-uttrykk indeks på 1,5,
CD271
-Høy expressers tilbakefall betydelig oftere enn de
CD271
-Lav tilfeller (41,1% vs 80,0% residivfri overlevelse, henholdsvis:
p
= 0,035). De demografiske og kliniske karakteristika for disse pasientene er vist i tabell S4. For klinisk sykdom klassifisering, pT3 eller mer var signifikant hyppigere i CD271-høy tilfeller (CD271-høy 15/17, CD271-lav 5/11;
p
= 0,022). Samlet utgjør disse resultatene indikerte at CD271 uttrykk er assosiert med dårlig kliniske resultater i form av prognose og tilbakefall.
(A) Kaplan-Meier analyse for tilbakefall overlevelse sats i henhold til
CD271
mRNA nivå, i tumorvev avledet fra 28 HPC-pasienter etter operasjon. Real-time RT-PCR-analyser ble gjennomført, normalisert til uttrykk av
GAPDH
, og fold-endring i
CD271
uttrykk nivåer i tumor mot normal slimhinne ble beregnet. Cut-off verdi for
CD271
ekspresjon indeksen var 1,5. *Statistisk signifikant. (B)
Nanog
uttrykk ble undersøkt ved real-time RT-PCR. Cut-off verdien for
Nanog
uttrykk indeksen var 1,5. *Statistisk signifikant. Lukkede sirkler, CD271 høy;
