Abstract
Den menneskelige
cystein dioxygenase en product: (
CDO1
) genet er en ikke-heme strukturert, jernholdig metalloenzyme involvert i omdannelsen av cystein til cystein sulfinat, og spiller en nøkkelrolle i taurin biosyntese. I vår søken etter nye denaturert genet arrangører har vi analysert differensial RNA uttrykk profiler av kolorektal kreft (CRC) cellelinjer med eller uten behandling av 5-aza-2′-deoxycytidine. Blant de genene som er identifisert, ble
CDO1
arrangøren funnet å være forskjellig metylert i primær CRC vev med høy frekvens i forhold til normal kolon vev. I tillegg er en statistisk signifikant forskjell i frekvens av
CDO1
promoter metylering ble observert mellom primær- normale og tumorvev avledet fra bryst, spiserør, lunge, blære og mage. Nedregulering av
CDO1
mRNA og proteinnivåene ble observert i kreftcellelinjer og svulster avledet fra disse typer vev. Uttrykk for
CDO1
ble kontrollert av arrangøren metylering, noe som tyder på at arrangøren metylering og stanse all
CDO1
kan være en vanlig hendelse i menneskelig kreftutvikling. Videre tvunget uttrykk for full-lengde
CDO1
i humane kreftceller markert redusert tumorcellevekst i en
in vitro
cellekultur og /eller en
in vivo
mus modellen, mens knockdown av
CDO1
økt cellevekst i kultur. Våre data implisere
CDO1
som en roman tumor suppressor genet og en potensielt verdifull molekylær markør for kreft hos mennesker
Citation. Brait M, Ling S, Nagpal JK, Chang X, Park HL, Lee J, et al. (2012) Cysteine dioxygenase 1 Er en tumorsuppressorgen Silenced av arrangøren Metylering i flere kreft hos mennesker. PLoS ONE 7 (9): e44951. doi: 10,1371 /journal.pone.0044951
Redaktør: Chun-Ming Wong, University of Hong Kong, Hong Kong
mottatt: 20 januar 2012; Akseptert: 14. august 2012; Publisert: 27.09.2012
Copyright: © Brait et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Cancer Institute (U01-CA84986 Early Detection Research Network) og Flight Attendant Medical Research Institute (Myoung S. Kim). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Under en lisensavtale mellom Oncomethylome Sciences og Johns Hopkins University, er D. Sidransky rett til en andel av royalty mottatt av universitetet på omsetningen av alle produktene som er omtalt i denne artikkelen. D. Sidransky eier Oncomethylome Sciences, SA lager, som er underlagt visse restriksjoner under universitetspolitikk. D. Sidransky er en betalt konsulent for Oncomethylome Sciences, SA og er en betalt medlem av selskapets Scientific Advisory Board. The Johns Hopkins University i samsvar med sin konflikt av interesse politikk er å styre betingelsene i denne avtalen. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Kreft er forårsaket av avvikende genregulering, herunder inaktivering av negative regulatorer av celleproliferasjon ( herunder tumorsuppressorgener, TSG) og aktivering av positive regulatorer (for eksempel onkogener). I tillegg til genetiske endringer som omfatter mutasjoner av onkogener og TSGs, kan kreftfremkallende prosess skje gjennom epigenetiske forandringer i gen-promotorer [1]. Epigenetiske forandringer, arvelige endringer i genekspresjon som oppstår uten endringer i DNA-sekvensen, bidrar til utvikling og progresjon av tumorceller [2] og anses å være kjennetegnene til kreft. DNA metylering og histon acetylering er de hyppigste og studerte epigenetiske forandringer [1]. Det er CG-rike regioner som er kjent som CpG-øyer som kan være plassert inne i 5’end regionen, inkludert promoter, ikke-translatert område og ekson 1 av eventuelle gener med TSG aktivitet [3]. CpG øyer er vanligvis ikke metylert i normale celler [3], men avvikende hypermethylation i CpG øyer som fører til transcriptional inaktivering og genet Slå kan være tidlige hendelser i kreftutvikling og regnes for å være en felles mekanisme for tap av TSG funksjon i humane kreftformer [1], [4]. Foreløpig er det vel akseptert at epigenetiske forandringer selv disponere til genetiske endringer i løpet tumorigenesis [5]. Klinisk kan TSG metylering brukes som et epigenetisk biomarkør for tumor-diagnostikk og prognose prediksjon. Dermed kan kunnskap om metylering mønstre over hele genomet bidra til å identifisere viktige TSGs inaktivert under svulstdannelse [6], [7], [8].
Pattedyr
cystein dioxygenase product: (
CDO
, EC 1.13.11.20) er et viktig enzym for human helse er involvert i nedbrytning av giftige cystein og derved regulering av cystein-konsentrasjonen i kroppen. Det er en ikke-heme strukturert, jernholdig metalloenzyme involvert i omdannelsen av cystein til uorganisk sulfat, og spiller en nøkkelrolle i taurin biosyntesen [9]. Den åpne leseramme på
CDO
-genet koder for et protein med 200 aminosyrer (molekylvekt 23 kD, som binder en Fe
2
– ion pr molekyl). Mus
CDO Hotell og rotte
CDO
ha en identisk aminosyresekvens som er 92% identisk med menneskelig
CDO
, og de fleste aminosyresubstitusjoner er konservative erstatninger.
CDO
gen dekker ca 15 kb og inneholder 5 eksoner. Den 5′-flankerende region av det humane
CDO
genet inneholder flere antatte konsensus
cis
-acting regulatoriske sekvenser, spesielt for binding av hepatisk nukleær faktor-3 (HNF-3) og dens homologer, som er kjent for å være involvert i lever-spesifikk gentranskripsjon. Tilstedeværelsen av disse konsensus-bindingsseter er konsistent med den høyeste grad av
CDO
mRNA finnes i leverekstrakter i forhold til andre vevsekstrakter (nyre, lunge og hjerne) [10]. Det finnes to typer av CDO; cytosolisk (CDO1) og membran-bundet (CDO2), og murin CDO1 er postulert å være involvert i reguleringen av proteinfunksjon og antioksidant forsvarsmekanismer gjennom sin evne til å oksydere cysteinrester [11].
humane
CDO1
genet ligger på kromosom 5 q23.2 som ofte slettet i avansert lungekreft [12]. Staub et al. [13] antas at sletting eller epigenetisk stanse av det kromosomale region 5 q23.2 der
CDO1
ligger er en hyppig mekanisme som bidrar til tykktarms tumorigenesis;
adenomatøs polypose coli product: (
APC
) og
mutert ved kolorektalkreft product: (
MCC
) ligger i nabolaget til 5 Q23 [12]. Det er sterkt uttrykt i lever og placenta, og svakt i hjerte, hjerne og bukspyttkjertel [14]. Cystein regulerer CDO1 omsetning gjennom Ubiqutin-26S-proteasomet-mediert degradering [15], og et høyt nivå av cystein er cytotoksisk, og kan føre til revmatoid artritt [16], [17], [18], Parkinsons sykdom [17], Alzheimers sykdom [ ,,,0],17], økt risiko for kardiovaskulær sykdom [19] og uønskede svangerskapsutfall [20]. Nylig, over-uttrykk for CDO1 ble beskrevet for Sezary syndrom, en aggressiv kutant T-cellelymfom [21].
Tidligere rapporterte vi et sett av kandidat gener som utgjør en del av den nye «kreft methylome» ved hjelp av en ny promoter struktur algoritme og microarray data generert fra 22 kreftcellelinjer avledet fra 5 store krefttyper [22], [23]. I våre tidligere studier undersøkte vi nylig identifiserte kreftspesifikke denaturert gener i et panel på 300 primære svulster som representerer 13 typer kreft;
onkostatin M reseptor-β product: (
OSMR
) og
β-1,4-galactosyltransferase-en product: (
B4GALT1
) var to av de nye gener identifisert i studien å bli metylert i primær CRC vev, men sjelden i tilsvarende normal tilstøtende slimhinner og i ikke-maligne normale kolon vev [23]. I tillegg er en kombinasjon av farmakologisk avsløring og oligonukleotid microarray analyse [24], [25], [26] gjorde oss i stand til å finne nye metylert gener i esophageal plateepitelkarsinom (ESCC) og CRC cellelinjer og primære vev.
NEFH product: [27],
DFNA5 product: [26],
OSMR product: [23],
LIFR product: [28] og
NMDAR2B
[25] var representative gener som vi har funnet for å være epigenetiske inaktivert i menneskelig ESCC og CRC ved høy frekvens. mRNA-uttrykket av disse genene i kreft vev var også signifikant nedregulert sammenlignet med normale vev. Videre funksjonelle studier antydet kreft undertrykkende roller for disse genene i menneske CRC og ESCC cellelinjer.
I denne studien rapporterer vi at
CDO1
var en av kandidatgener identifisert ved en kombinasjon av farmakologisk avsløring strategi og uttrykk microarray analyser. Vi observerte hyppige promoter metylering og nedregulering av
CDO1
i flere typer kreft hos mennesker. Funksjonelle studier viste at
CDO1
havner svulst undertrykkende aktivitet.
Resultater
CDO1
er epigenetiske inaktivert i Human Colon Cancer
I vår søken etter gener epigenetiske forstummet i menneskelig CRC, utførte vi en kombinasjon av farmakologisk avsløring og påfølgende differensial microarray analyse ved hjelp av mikromatriser inneholder 22,284 transkripsjoner (Affymetrix) [26]. Vi brukte demethylating midlet 5-aza-2′-deoksycytidin (5-Aza-dC) for å aktivere gener epigenetiske dempede i tre CRC-cellelinjer (HCT116, HT29 og DLD-1). Vi har tidligere rapportert utvalgskriterier for å identifisere gener ofte inaktivert i tykktarmskreft med DNA promoter metylering [26]. Vi re-analysert kandidat tumorsuppressorgener vårt genet listen og funnet at uttrykket av
cystein dioxygenase en product: (
CDO1
) var «fraværende» før farmakologisk behandling, men «til stede» etter 5- aza-dC behandling i alle tre CRC-cellelinjer som ble testet. Den fraværende og re-aktivert
CDO1
uttrykk med 5-Aza-st i fem CRC cellelinjer (HCT116, HT29, DLD-en, RKO og SW480) ble validert av RT-PCR-analyse (Fig. 1A ).
A, uttrykk for
CDO1
i CRC cellelinjer ble undersøkt ved RT-PCR-analyse. Ingen basal uttrykk for
CDO1
ble sett i alle CRC-cellelinjer, og alle disse cellelinjene næret
CDO1
metylering (M). Silenced
CDO1
ble reaktivert etter behandling med demethylating agent, 5-Aza-DC, noe som indikerer at
CDO1
metylering korrelerer tett med tap av genuttrykk i CRC cellelinjer. β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. m, celler behandlet med bærer bare; en, celler behandlet med 5-Aza-dC (5 uM i tre dager). L, 1 Kb Plus DNA stigen. B, Metylering status av individuelle CPGs av øya i 5 CRC cellelinjer og 21 par av primær CRC (PT) og deres tilsvarende normale kolon vev (PN) er vist. Totalt 38 CGS ble nummerert fra første til siste CG i sekvensene som angitt. Svart sirkel, metylering; hvit sirkel, unmethylation; grå sirkel, sameksistens av denaturert og unmethylated lene; stiplet sirkel, ubestemt. C, Analyse av
CDO1
promoter aktivitet ved luciferase reporter analysen i
CDO1
-negativ (HCT116) og -positive (HEK293) celler. Arrangøren konstruksjoner (pGL2-
CDO1 Anmeldelser – # 1 og – # 2) ble forbehandlet med eller uten
Sss
jeg metylase for 8 timer før transfeksjon. Høy aktivitet i
CDO1
promoter ble oppdaget i HEK293 der
CDO1
ble uttrykt. Data er uttrykt som gangers økning i forhold pGL2-grunnleggende aktivitet. Forsøkene ble gjort i tre eksemplarer, og verdier indikerer gjennomsnitt ± SD. Middelverdier er presentert. D. Scatter tomt på
CDO1
metylering nivåer i vev og cellelinjer (CL) (til venstre). TaqMan metylering verdier (TaqMeth V) er beskrevet i Materialer og metode. TaqMan-MSP ble utført i duplikat format, og forsøkene ble gjentatt to ganger. Dataene viste reproduserbare og samstemmige resultater. PT, primær CRC; PN, matchet normale kolon vev fra kolon kreftpasienter; NN, normal tykktarm epitel fra ikke-kreftpasienter. Linjen angir den optimale cut-off verdi for
CDO1
beregnet fra ROC analyse. Prøvenummer som viser TaqMeth V over cut-off er indikert. Den samlede TaqMeth V detektert i PT var signifikant høyere enn i PN (til høyre). TaqMan verdi av to NN (22%, 2/9) var over cut-off verdi (24,56 og 17,86 hver), noe som tyder på at et lavt nivå av CDO1 metylering kan være forårsaket av andre ukjente mekanismer. E, ROC kurven analyse av TaqMeth V av
CDO1
i CRC. Arealet under ROC (AUROC) formidler nøyaktigheten skille matchet normal kolon (PN) fra CRC (PT) i form av sin sensitivitet og spesifisitet (
P 0,001
). Solid linje,
CDO1
; stiplet linje, ingen diskriminering. F, metylering nivåer av normal (PN) og tumorvev (PT) i den enkelte pasient.
For å undersøke om
CDO1
uttrykk er regulert av arrangøren metylering, vi søkte etter CpG øyer i
CDO1
promoter ved hjelp av online tilgjengelig programvare Methprimer (https://www.urogene.org/methprimer/index1.html).
CDO1
havner en CpG øy i promoter proksimalt for transkripsjon start hotellet (TSS) (fig. S1 A). Vi analyserte metylering statusen til CpG øya i 5 CRC-cellelinjer (HCT116, HT29, DLD-1, SW480 og RKO) og 4-tumor tilstøtende normalt utseende vev (PN) av bisulfitt-sekvensering. CPG øya ble tett metylert i CRC cellelinjer, men ikke i normale kolon vev (Fig S1B . 1B). Delvis demetylering av CpG øya etter 5-Aza-dC behandling i cellelinjer ble også bekreftet ved bisulfitt-sekvensanalyse (data ikke vist). Vi har også utført COBRA parallelt med bisulfit-sekvensering for å bekrefte
CDO1
metylering i 10 par tilfeldig valgt matchet tumor (PT) og normal kolon vev (PN) (Fig. S1C). Hyppigheten av
CDO1
metylering i tumorer (7/10, 70%) var høyere enn i tilsvarende normalt vev (1/9, 11,11%). Å analysere
CDO1
metylering status i primære svulster, undersøkte vi 21 par av PT og PN av sulfitt-sekvensering. Ifølge våre kriterier for å avgjøre
CDO1
metylering i cellelinjer og vev ved sulfitt-sekvensering (beskrevet i materialer og metoder), hyppigheten av
CDO1
metylering i tumorer var 100% (21 /21) og at det i normal metylering var 0% (0/21), som indikerer at
CDO1
er hypermethylated i CRC (fig. 1B). Representant sulfitt-sekvense resultatene av
CDO1
er vist i figur S1D.
For å belyse hvilken rolle DNA metylering i reguleringen av
CDO1
uttrykk, har vi gjort to luciferase reporter konstruksjoner (pGL2-
CDO1 Anmeldelser – # 1 og – # 2) som inneholder forskjellige deler av
CDO1
promotersekvenser (posisjon -1100 bp til 104 bp for # 1, og -430 bp til 104 bp for # 2) (fig. 1C, øvre). Tomme pGL2-luciferase plasmider ble transfektert for mock aktivitet. Vi transfektert disse konstruerer i to cellelinjer;
CDO1
-negative HCT116-celler og
CDO1
-positivt HEK293 celler. Aktiviteten av
CDO1
promoter var minimal i HCT116-celler, men et høyt nivå av promoter-aktivitet ble detektert i HEK293 (fig. 1C, lavere). I tillegg er både pGL2-
CDO1 Anmeldelser – # 1 og – # 2 konstruerer hadde tilsvarende nivåer av
CDO1
promoter aktivitet i HEK293 celler, men induksjon av CpG metylering med
Sss
i metylase før transfeksjon nedsatt aktivitet til et minimalt nivå. Disse resultatene indikerer at DNA metylering av CpG island spiller en stor rolle i genet Slå av
CDO1
.
For å studere arrangøren metylering av
CDO1
av kvantitativ TaqMan-MSP analyse, har vi designet primere og probe spesifikt rettet mot CpG øy i
CDO1
promoter (fig. S1 A). Vi økte prøvenumrene til 100 par primære CRC (PT) og tilsvar normal kolon (PN) vev. Ni normale tykktarmsslimhinne vev fra ikke-kreft pasienter (NN) ble inkludert for å sammenligne metylering spesifisitet mellom kreft og ikke-kreftpasienter. Vi inkluderte også 5 CRC cellelinjer som tidligere ble analysert i TaqMan-MSP analyse. Fordelingen av metylering verdier (TaqMan metylering verdier, TaqMeth V) viser en klar kreft bestemt mønster; å være statistisk forskjellig mellom PT og PN (Fig. 1D, venstre). På grunn av heterogene klonale plaster som er kjent for å ekspandere utover tumor grenser, ble et lavt nivå av metylering i PN også ofte observert. Den samlede metylering nivået
CDO1
detektert i PT (38,42 ± 22,97, middelverdi ± SA, n = 100) var betydelig høyere enn de i PN (5,00 ± 6,51, middelverdi ± SA, n = 100) (
P 0,0001, Wilcoxon-Mann-Whitney test
) (figur 1D, høyre).. Metylering av
CDO1
genet i vev viste svært diskriminerende mottaker-operatør karakteristiske (ROC) kurve profiler, klart skille PT fra PN (Fig. 1E). Arealet under ROC (AUROC) var 0,962 ± 0,0138 (
P 0,001
). For å maksimere sensitivitet og spesifisitet, den optimale cut-off for metylering av
CDO1
genet ble beregnet fra ROC analyse (verdi, 12,50) (PT
vs
. PN). På dette cut-off, den optimale spesifisiteten var 93% og sensitiviteten var 91% (
P 0,001
,
Fishers eksakte
test). I tillegg til en enkel frekvens, sammenligning av metylering nivåer av PN og PT fra de samme individuelle pasienter viste at flertallet av PT næret mye høyere verdier enn PN (
P 0,0001, Wilcoxon matchet-parene inngåtte-rekkene
test) (fig. 1F). Et høyt nivå av
CDO1
promoter metylering ble også funnet i CRC cellelinjer (5/5, 100%), i samsvar med bisulfit-sekvensering og COBRA resultater. Disse resultatene indikerer at
CDO1
er kreft-spesifikt metylert i CRC med høy frekvens.
CDO1
er denaturert i flere typer kreft hos mennesker
Å undersøke metylering status for
CDO1
i andre vevstyper, vi utførte TaqMan-MSP i
CDO1
promoter i primær vev avledet fra bryst, spiserør, lunge, blære og mage. Som vist i figur 2A,
CDO1
promoteren var sterkt metylert i tumorer i alle typer vev som ble testet. Bryst Prøvene bestod av en ikke-tumorigen (MCF-12A) og 5 cancercellelinjer (BT20, MDA-MB-231, MCF-7, Hs748.T, Hs578.T), og 3 typer primære vev (34 PT- 10 PN, og 10 NN). Twenty-syv av 34 (79%) bryst PT næret verdier over den optimale cut-off verdi på 10, og ingen normale bryst vev fra pasienter med (PN) eller uten (NN) kreft var over verdien (0%). Nivået på
CDO1
metylering i MCF-12A var under cut-off.
CDO1
arrangøren ble også høyt metylert i blærekreft. Førti-tre ut av 55 (78%) blære PT næret verdier over den optimale cut-off-verdi på 5, og bare to prøver av 32 (6,2%) normale blærevevet var over cut-off-verdi. ROC kurven analyse generert de optimale cut-off-verdier (Fig. 2B) samt maksimal følsomhet og spesifisitet for hver type kreft. Middelverdien av TaqMeth V, AUROC, cut-off-verdier,% sensitivitet og spesifisitet, og p-verdiene for statistisk analyse i hver type av prøvene er vist i tabell 1. Følsomheten og spesifisiteten av
CDO1
var over 78% i PT og over 90% i PN, henholdsvis, i alle vevstyper testet. Disse resultatene viser at
CDO1
er ofte metylert i flere typer kreft hos mennesker. De clinicopathological funksjoner av pasienter analysert i denne studien var ikke tilgjengelig.
, Kvantitative metylering nivåer av
CDO1
ble bestemt i primær vev avledet fra bryst, spiserør, lunge, blære og mage. TaqMan metylering verdier (TaqMeth V) er beskrevet i Materialer og metode. PT, primær tumor; PN, matchet normalt vev; NN, normale vev fra ikke-cancerpasienter; CL, cellelinjer. Linjer angir den optimale cut-off-verdi for hvert vev. Arrow, MCF-12A, et ikke-tumorigen cellelinje, næret et lavt nivå av
CDO1
metylering (TaqMeth V, 6,2). Alle analyser ble utført i duplikat format, og forsøkene ble gjentatt to ganger. Dataene viste reproduserbare og samstemmige resultater. B, ROC-analyse (PT
vs
. PN) i
CDO1
i flere kreft hos mennesker. Solid linje,
CDO1
; stiplet linje, ingen diskriminering.
CDO1
forstummet i Kreftcellelinjer og Re-aktiveres ved Farmakologisk Demety
Vi deretter undersøkt transkripsjonsnivået av
CDO1
av RT-PCR og QRT-PCR-analyser i cancercellelinjer avledet fra bryst, spiserør, lunge, blære, og mage, og i ikke-tumorigene cellelinjer (HEK293 og MCF-12A). Basal uttrykk for
CDO1
var knapt synlig i kreftcellelinjer, men sterkere uttrykk ble observert i HEK293 og svakt i MCF-12A cellelinjer (Fig. 3A). Vi har også undersøkt metylering status for
CDO1
promoter i hver cellelinje ved sulfitt-sekvensering, og fant at kreftcellelinjer med
CDO1
tap næret et tett metylering i
CDO1
promoter (angitt som M).
CDO1
metylering ble ikke observert i HEK293 celler (U), og både denaturert og unmethylated alleler ble funnet i MCF-12 celler (M /U). I tillegg reaktivert 5-Aza-dC behandling
CDO1
uttrykk i de fleste kreftcellelinjer (Unntakene var A549 og H1828), noe som indikerer at transkripsjonen uttrykk for
CDO1
tett korrelerer med arrangøren metylering.
, Expression of
CDO1
i cellelinjer ble undersøkt ved RT-PCR eller QRT-PCR-analyser. m, mock behandling. a, 5-Aza-dC behandling (5 uM i tre dager). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. Metylering status for
CDO1
promoter i hver cellelinje ble undersøkt og angitt som M for metylering, U for unmethylation, og M /U for sameksistens av denaturert og unmethylated alleler.
CDO1
var helt metylert i alle kreftcellelinjer siden bare cytosin topper ble observert i CPGs sekvensert (100% metylering), mens det ikke ble metylert i HEK293 siden bare tymidin topper ble observert (0% metylering).
CDO1
var delvis metylert i MCF-12A siden ble observert både denaturert og unmethylated alleler i 10 CPGs av
CDO1
arrangører undersøkt. Når en cytosin topp ble sammenlignet med en tymidin topp i hver CpG av de 10 CPGs, cytosin toppene var dominant (denaturert), men siden disse «denaturert CPGs» ble funnet i mindre enn 50% av de totale CPGs (10/34), det ble ansett som «metylering-negativ» i henhold til de kriterier som er beskrevet i Materialer og Metoder. B. QRT-PCR ble utført på cDNA avledet fra pasienter med tykktarm, bryst, spiserør, blære og mage kreft (T) og pasienter uten kreft (nn) (øvre). Relativ uttrykk (Fold) ble beregnet ved å sammenligne forholdene av mRNA uttrykk for
CDO1
til en intern kontroll genet, β-aktin.
CDO1
uttrykk nivå ble bestemt i 10 lungekreftpasienter og 10 pasienter uten kreft (lavere). 2 – () * 100, uttrykk for
CDO1
forhold til p-aktin beregnet basert på terskelen syklus (C
t) som 2
-ΔCt (ΔCt = C
t,
CDO1 Anmeldelser – C
t, β-actin). Forsøkene ble gjort i to eksemplarer, og verdier indikerer gjennomsnitt ± SD. *,
P 0,05
i
T-
test. C,
CDO1
uttrykk nivået ble undersøkt i fem par (A ~ E) av matchet cDNA fremstilt fra pasienter med tykktarms og lungekreft. PT, primær tumor; PN, matchet normalt vev.
For å undersøke uttrykket av
CDO1
i primær kreft, utførte vi QRT-PCR analyse med cDNA avledet fra pasienter med tykktarm, bryst, spiserør, blære og magekreft (T, n = 1 for hver tumor) og pasienter uten kreft (NN, n = 1 for hver normal).
CDO1
var dramatisk nedregulert i T i forhold til NN (Fig. 3B, øvre). Den samlede midlere verdi av
CDO1
ekspresjonsnivået av 10 pasienter uten kreft var omtrent 2,5 ganger høyere (19.14 ± 21.56) enn det i 10 lungekreftpasienter (8.03 ± 9.20) (fig. 3B, lavere). Vi utførte også QRT-PCR i 5 par matchet cDNA fremstilt fra tumor (PT), og tilsvarende normale vev (PN) for kolon og lungekreft. Alle fem krefttilfeller tykktarm vev utstilt
CDO1
nedregulering, og tre av fem tilfeller av lungevevet som vises reduserte nivåer av
CDO1
i PT forhold til PN (Fig. 3C). Disse resultatene tyder på at spesifikk reduksjon av
CDO1
mRNA er en vanlig hendelse i menneskelig utvikling kreft.
CDO1
uttrykk ble også undersøkt ved hjelp Cancer Profilering Array II som omfatter normalisert cDNA av svulsten og de matchet ikke-kreft (normal) vev for 19 forskjellige typer kreft. Som vist i figur 4,
CDO1
ekspresjon ble tydelig påvist i de tilsvarende normale vev (N) i rekken, og nedregulert i tumorer i mer enn 50% av pasienter med tykktarm, mage, bukspyttkjertel, tyroid , hud, nyre, blære, lunge, bryst, ovarie, uterus, cervix og vulva kreft. Motsatt, en økning på
CDO1
i tumorer ble observert i løpet av mindre enn 20% av pasientene med disse typer kreft (Tabell 2). I lungekreft, alle tumorer (100%, 10 av 10) vises nedregulering av
CDO1 plakater (Fig. 4, øverst), mens uttrykk for
CDO1
i leveren var for høy å sammenligne mellom normale og tumorvev (ikke bestemt, n /d). I tillegg er en høy frekvens av
CDO1
nedregulering (mer enn 80%). Det ble observert for det meste i prøver avledet fra kvinnelige kreftpasienter (bryst, ovarie, uterus, cervix og vulva) (figur 4, nedre ). Dermed
CDO1
er nedregulert i flere kreft hos mennesker, særlig i kreft fra kvinnelige organer.
Kreft profilering arrays II ble utført for å sammenligne
CDO1
uttrykk mellom tumor (T) og matchet normal kontroll (N) vev i flere typer vev. Matrisen ble hybridisert med
CDO1
cDNA probe merket med
32P-α-deoksytidintrifosfat henhold til produsentens protokoll. Vevstype og antall saker med nedregulering av
CDO1 vs.
totale tilfeller er indikert. Arrow, nedregulering av
CDO1
i tumor i forhold til normalt vev. Ubiquitin cDNA (Ubi) ble anvendt som en kontroll. n /d, ikke bestemt.
For å undersøke protein uttrykk for
CDO1
, utførte vi immunhistokjemisk (IHC) flekker ved hjelp av både tykktarm og arrays spiserør vev med normal og kreft vev. I flere organ normalt vev matrise som inneholder ikke-maligne vev (NN) avledet fra spiserør, mage, lever, tykktarm, lunge og bryst (# BN00011), ble det observert ekspresjon av CDO1 protein i alle ikke-maligne vev; CDO1 uttrykk var positiv i seks av seks saker for alle vevstyper med bare ett unntak i bryst (4 av 6 tilfeller) (data ikke vist). Figur 5A og figur S2A viser representative resultatene av tre positive tilfeller av ikke-ondartet tykktarm (NN1 ~ NN3). I tillegg blant 36 grupper av prøver som består av adenokarsinomer (AD), matchet kreft tilstøtende normalt vises vev (NAT) og matchet kreft tilstøtende vev (tilstøtende) i hver gruppe som ble hentet fra 36 individuelle tykktarmskreftpasienter (# BC05021 og # BC05022 ), nedregulering av CDO1 ble observert i 25 tilfeller av AD i forhold til NAT eller Tilstøtende vev (69%) (figur 5B . fig. S2B). Fem tilfeller av 36 AD vises oppregulering av CDO1, men de andre seks tilfeller viste ingen forskjell mellom AD, NAT og tilstøtende vev (data ikke vist). Den høye forekomst av nedsatt CDO1 ekspresjon ble også observert i 33 av 40 tilfeller av ESCC (PT) i forhold til matchede normale opptrer vev (PN) (82%) (Figur 5C-amp;. Fig S2C). Bare to tilfeller av ESCC utstilt økt CDO1 uttrykk, og fem tilfeller viste ingen forskjell mellom PT og PN (data ikke vist) (# ES801). CDO1 uttrykket ble så analysert i colon adenokarsinom med ulike kreft karakterer og NAT (# BC05118 og # CO1922). CDO1 protein ble påvist i 41 av 41 tilfeller (100%) av NAT, mens AD viser CDO1 positivitet var ca. 40% (37% 44%, henholdsvis) (figur 5D-amp;. Tabell 3). Svak eller fraværende uttrykk for CDO1 i AD var statistisk signifikant sammenlignet med NAT i begge matriser (
P 0,001
), og den fraværende uttrykk for CDO1 i mucinous AD (84%, 32/38) var også statistisk signifikant (
P 0,001
). CDO1 uttrykk ble påvist i 30 av 30 tilfeller (100%) av ikke-maligne esophageal vev (normal, betennelse og hyperplasi), mens fraværende eller svak uttrykk for CDO1 ble observert i 35 av 49 tilfeller (71%) av neoplastiske vev (tabell 4) (# ES804). Sammenlignet med normal spiserør vev, den negative uttrykk for CDO1 i esophageal AD (80%, 16/20) (
P 0,001
), SCC (55%, 9/20) (
P 0.001
), og metastatisk kreft (89%, 8/9) (
P 0,001
) var statistisk signifikant, men dette var ikke tilfelle i hyperplasia (100%, 10/10) (fig. 5E).
, Strong uttrykk for
CDO1
i ikke-maligne kolon vev. Uttrykket av
CDO1
protein var positiv i seks av seks pasienter. NN1, en pasient uten cancer, og to flere tilfeller er vist i figur S2A. B, var en gruppe på prøvene stammer fra en enkelt pasient består av kolon adenokarsinomer (AD), matchet kreft tilstøtende normalt vises vev (NAT) og matchet kreft tilstøtende vev (tilstøtende).
CDO1
uttrykk ble undersøkt i totalt 36 grupper av prøver. Pasientene ble nummerert vilkårlig (Pt1 ~ Pt3). CRC Pt1, en pasient med CRC. To mer tilfellene er vist i figur S2B. C,
CDO1
uttrykk i ESCC. PT, ESCC; PN, matchet normalt utseende vev. ESCC Pt1, en pasient med ESCC. Tre flere tilfeller er vist i figur S2C. D,
CDO1
uttrykk i colon adenokarsinom (AD) med ulike kreft karakterer. Mu-AD, mucinkjertler adenokarsinomer. E,
CDO1
uttrykk i ESCC med ulike kreft karakterer. EAD, esophageal adenokarsinomer; Me-ESCC, metastatisk ESCC.
CDO1
Controls tumorigenitet av humane kreftceller
in vitro Hotell og
in vivo
for å få innsikt i funksjon av
CDO1 Hotell og konsekvensen av et tap av
CDO1
aktivitet, må vi først undersøkte vekstegenskapene til kreftcellelinjer med eller uten tvang uttrykk for
CDO1
. HCT116 og DLD-en cellelinjer, som ikke uttrykker
CDO1
genet ved baseline, ble valgt for transient
CDO1
genet levering. Vi utførte MTT analyse for å sammenligne cellevekst med eller uten uttrykk for
CDO1
. De kontrollceller som ikke uttrykker
CDO1
gående vokste i 3 dager med inkubasjon men veksten i
CDO1
uttrykker HCT116 og DLD-1 celler ble redusert til 42% og 27% av kontrollen -celler, henholdsvis (fig. S3A). Men ektopisk uttrykk for
CDO1
hadde ingen effekt på celle morfologi (data ikke vist). β-aktin ble benyttet som en kontroll lasting.
