Abstract
Ansettelse av anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) antistoffer representerer en ryggrad behandlingsalternativer for behandling av metastatisk kolorektalcancer (mCRC). Imidlertid er denne behandlingen dårlig effektivt eller ineffektivt i uselekterte pasienter. Mutasjoner i KRAS, BRAF og PIK3CA gener har nylig dukket opp som den beste prediktive faktorer for lav /fraværende respons på EGFR-målrettet terapi. På grunn av behovet for effektive behandlinger for mCRC pasienter som bærer disse mutasjoner, i denne korte rapporten undersøkte vi den antitumorale aktivitet av protease inhibitor gabexate mesilat, alene og i kombinasjon med anti-EGFR-monoklonale antistoff cetuximab, i et panel av human CRC cellelinjer skjuler et annet uttrykk mønster av villtype /muterte KRAS, BRAF og PIK3CA gener. Resultater oppnådd viste at gabexate mesilat vesentlig hemmet vekst, invasiv potensial og tumorindusert angiogenese i alle CRC-cellene som benyttes i denne studien (inkludert de som skjuler dual KRAS /PIK3CA eller BRAF /PIK3CA mutasjon), mens cetuximab påvirkes disse parametrene bare i CRC celler med KRAS, BRAF og PIK3CA villtype. Spesielt ble antitumor effekten av gabexate mesilat og cetuximab i kombinasjon funnet å være ikke bedre enn det som ble observert med gabexate mesilat som monoterapi. Samlet er disse foreløpige funn tyder på at gabexate mesilat kunne representere en lovende behandlingsalternativ for mCRC pasienter, særlig for de skjuler KRAS, BRAF og PIK3CA mutasjoner, enten som monoterapi eller i tillegg til standard kjemoterapiregimer. Videre studier for å bedre belyse gabexate mesilat virkningsmekanisme i CRC cellene er derfor garantert
Citation. Brandi G, Tavolari S, De Rosa F, Di Girolamo S, Agostini V, Barbera MA, et al. (2012) antitumor effekt av proteasehemmer Gabexate mesilat i tykktarm kreft celler Harbouring KRAS, BRAF og PIK3CA mutasjoner. PLoS ONE syv (7): e41347. doi: 10,1371 /journal.pone.0041347
Redaktør: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu «, Italia
mottatt: 17 februar 2012; Godkjent: 20 juni 2012; Publisert: 24.07.2012
Copyright: © 2012 Brandi et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
i de siste femten årene, innføring av ved minst seks sentrale midler (oksaliplatin, irinotecan, kapecitabin, bevacizumab, cetuximab og panitumumabs), etter «æra» av 5-fluorouracil som monoterapi, har forbedret median total overlevelse av metastatisk kolorektalcancer (mCRC) pasienter opp til 24 måneder [ ,,,0],1], [2]. Ansettelse av anti-epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR) antistoffer panitumumab og cetuximab, enten som monoterapi eller i tillegg til standard kjemoterapiregimer, representerer en ryggrad av de terapeutiske muligheter for behandling av mCRC. Imidlertid har randomiserte kontrollerte studier gitt overbevisende bevis for at EGFR-rettet behandling er dårlig effektive eller ineffektive i uselekterte mCRC pasienter. I de senere årene, aktive mutasjoner i kodon 12 og 13 i KRAS onkogen (KRAS
G12V og KRAS
G13D) har dukket opp som den beste prediktive faktorer for lav /fraværende respons på anti-EGFR terapi hos disse pasientene, enten i første-linje eller påfølgende behandlingslinjer [3] – [5]. Av denne grunn er mCRC pasienter nå profilert for KRAS mutasjon og ansettelse av cetuximab og panitumumabs er for tiden begrenset kun til de som bærer KRAS villtype, som anbefalt av European Medical Agency og American Society of Clinical Oncology [6] . Selv om tilstedeværelsen av villtype KRAS synes å være en forutsetning for respons på EGFR-målrettet terapi, opp til 50-65% av mCRC pasientene ikke klarer å dra nytte av denne behandlingen, grunnet flere iboende resistensmekanismer [7]. I denne forbindelse, involvering av BRAF
V600E og PIK3CA
H1074R på exon 20 mutasjoner i svikt i slik behandling har nylig dukket opp [7] – [11]. På grunn av mangel på en effektiv målrettet terapi, oppdagelsen av nye terapeutiske muligheter for mCRC pasienter med muterte KRAS, BRAF og PIK3CA genene representerer derfor en intens område av etterforskningen.
proteasehemmer gabexate mesilat har vist seg å utøve en betydelig antitumor-aktivitet i CRC-celler, både in vitro og in vivo [12]. Men effekten av dette stoffet, alene eller i kombinasjon med cetuximab, i menneskelige CRC celler husing et annet uttrykk mønster av villtype /mutert KRAS, forblir BRAF og PIK3CA fortsatt uavklart. Denne studien tar sikte på å undersøke denne hypotesen.
Resultater
Vi foreløpig valgt et panel av menneskelige CRC celler husing et annet uttrykk mønster av villtype /mutert KRAS, BRAF og PIK3CA gener. For dette formål, basert på Katalog av somatiske mutasjoner i Cancer (COSMIC) database (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/cosmic/) og på studiet av Jhawer et al. [13], CACO-2, ble SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 CRC celler valgt (se tabell 1 for deres tilsvarende KRAS, BRAF og PIK3CA status). Spesielt ble det ikke CRC cellelinje med co-forekommende KRAS og BRAF-mutasjoner funnet og tatt med i denne studien, ifølge tidligere rapporter som viser et mønster av gjensidig eksklusivitet for KRAS og BRAF mutasjon i menneskelig CRC [14]. Effekten av gabexate mesilat, alene og i kombinasjon med cetuximab, ble deretter undersøkt på CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 celleveksten, invasive potensial og tumorindusert angiogenese , ettersom de representerer tre fundamentale prosesser i kreft angrep og progresjon.
som vist i figur 1, 24 og 48 timer med behandling med cetuximab (100 ug /ml) ble funnet å påvirke cellenes levedyktighet bare i CRC celler som villtype KRAS, BRAF og PIK3CA gener (Caco-2 og SW48), som forventet. Motsatt gabexate mesilat (0,1-1 mm) induserte en betydelig tid og doseavhengig reduksjon av denne parameteren i alle CRC-cellelinjer inkludert i studien (Caco-2: IC
50 48 timer = 0,31 ± 0,01; SW48 : IC
50 48 timer = 0,33 ± 0,01; HT-29: IC
50 48 timer = 0,55 ± 0,03 mm; Colo205: IC
50 48 timer = 0,46 ± 0,02; SW480: IC
50 48 timer = 0,45 ± 0,02 mm; SW620: IC
50 48 timer = 0,39 ± 0,02; RKO: IC
50 48 timer = 0,49 ± 0,01 mm; LS174T: IC
50 48 timer = 0,59 ± 0,03; HCT-116: IC
50 48 timer = 0,56 ± 0,0 3 mm). Vi observerte at effekten utløst på celle levedyktighet ved gabexate mesilat alene var lik den som ble observert når dette stoffet ble gitt i kombinasjon med cetuximab 100 mikrogram /ml (figur 1).
Evaluering av MTT analyse av CACO-2 , SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 cellelevedyktigheten etter 24 og 48 timer etter behandling med cetuximab 100 ug /ml og gabexate mesilat 0,1-1 mM, alene og i kombinasjon. Tre uavhengige eksperimenter ble utført. For hver cellelinje, ble middelverdien av ubehandlede prøver antatt som 100%, og gjennomsnittsverdier for behandlede celler ble plottet som prosent med hensyn til deres matchede kontroller. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilat. * P 0,05; ** P 0,001; *** P. Ikke signifikant
Deretter undersøkte vi effekten av disse to stoffene på CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT- 116 invasivitet. Behandling for 6 timer med gabexate mesilat 1 mM betydelig redusert invasiv potensial i alle CRC-cellelinjene som ble testet (CACO-02:53%, SW48:42%, HT-29:45%, Colo205:43%, SW480:55% ; SW620:69%, RKO: 63%; LS174T: 54%; HCT-116:52%) (figur 2). Spesielt, en slik reduksjon ikke skyldes en cytotoksisk effekt av dette stoffet, som bekreftes av et parallelt eksperiment hvor ingen signifikant endring av cellelevedyktighet mellom kontroll og behandlede celler ble observert på dette tidspunkt av behandling (data ikke vist). Omvendt, 6 timer behandling med cetuximab 100 ug /ml ga ingen vesentlige endringer på CRC-celle invasiv potensial, bortsett fra på Caco-2 og SW48 celler, hvor en 25% og 22% av inhibering ble observert, respektivt. Igjen, da dette stoffet ble brukt i kombinasjon med gabexate mesilat, fremkalte effekten var lik den som ble observert med gabexate mesilat som monoterapi (figur 2).
Evaluering av Boyden kammer invasjon analysen av CACO-2, SW48 HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 invasiv potensial etter 6 timer med behandling med cetuximab 100 mikrogram /ml og gabexate mesilat 1 mm, alene og i kombinasjon. For hver cellelinje, ble middelverdien av ubehandlede prøver antatt som 100%, og gjennomsnittsverdier for behandlede celler ble plottet som prosent med hensyn til deres matchede kontroller. Fotografier av invaderende cellene er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende funn. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilat. Skala: 50 mikrometer. * P 0,05; *** P. Ikke signifikant
Til slutt, vurderte vi effekten av cetuximab og gabexate mesilat på tumorindusert angiogenese. Det ble observert en meget sterk hemmende effekt på denne parameteren når vi undersøkt virkningen av gabexate mesilat alene. Faktisk 24 timer inkubasjon av EA.hy926 celler med den betingede medium for CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 celler, som tidligere er behandlet for 6 timer med dette stoffet på dose på 1 mM, nesten fullstendig hemmet endotelial celledifferensiering i kapillar-lignende strukturer, som indikert ved tilstedeværelsen av et innbyrdes forbundet nettverk av anastomosering av celler i kontrollprøvene og for sfæriske celler, isolert eller aggregeres i små klumper, i behandlede seg (figur 3 ). Også på denne parameteren, cetuximab alene (100 ug /ml) ble funnet å være moderat effektivt bare i CRC-cellelinjer med villtype KRAS, BRAF og PIK3CA gener (inhibering av rør dannelse indeks, 22% og 20% i CACO-2- og SW48-celler, henholdsvis). På grunn av den sterke inhibering av tumorindusert angiogenese ved gabexate mesilat alene ved dosen 1 mM, ble effekten av dette stoffet alene og i kombinasjon med cetuximab også vurdert i en dose på 0,1 og 0,5 mM. Men også ved disse dosene, anti-angiogene effekt vises av gabexate mesilat pluss cetuximab var ikke overlegen enn det som er observert med gabexate mesilat ansatt som monoterapi (data ikke vist).
Evaluering av in vitro Matrigel angiogenese-analyse av EA.hy926 endothelial celledifferensiering i kapillær-lignende strukturer etter 24 timer inkubasjon med den kondisjonerte mediet av CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 celler, som tidligere er behandlet for 6 timer med cetuximab 100 ug /ml og gabexate mesilat 1 mM, alene og i kombinasjon. Tube formasjon indeksen ble vurdert som beskrevet i Materiale og metode delen. For hver cellelinje, ble middelverdien av ubehandlede prøver antatt som 100%, og gjennomsnittsverdier for behandlede celler ble plottet som prosent med hensyn til deres matchede kontroller. Fotografier er representative for tre uavhengige eksperimenter med lignende funn. Cetux: cetuximab; GM: gabexate mesilat. Skala: 50 mikrometer. * P 0,05; ** P 0,001; *** P. Ikke signifikant
Totalt disse funnene, i tillegg bekrefter mangelen på respons på cetuximab i CRC celler med KRAS, BRAF og PIK3CA mutasjoner, tyder på at gabexate mesilat er i stand til å utøve en betydelig antitumor aktivitet i CRC celler husing enten villtype eller mutert KRAS, BRAF og PIK3CA gener, med en effekt sammenlignbar med den som sees når den brukes i kombinasjon med anti-EGFR-antistoffer.
Diskusjoner
Personlig terapi representerer et attraktivt mål i onkologi. Til dags dato har kreft genomsekvense bli et kraftig verktøy for å identifisere kreftrelaterte mutasjoner og for å velge pasienter som kan ha nytte av en bestemt terapeutisk regime. I denne sammenheng har analyse av KRAS mutasjon raskt økt terapeutisk indeks for EGFR-målrettet terapi hos pasienter mCRC, begrenser denne behandling bare til de seg som bærer KRAS villtype. Selv om ytterligere validering er nødvendig før en eventuell søknad i klinisk praksis, har det blitt klart at BRAF og PIK3CA ekstra genotyping kunne gi en betydelig bedre objektiv responsrate hos disse pasientene. Faktisk aktiverer KRAS, BRAF og PIK3CA mutasjoner er i stand til å omgå EGFR farmakologisk hemming, og dermed resulterer i en konstitutiv aktivering av mitogenaktiverte protein kinase og AKT trasé, kjent for å spille en sentral rolle i kreft angrep og progresjon [15]. I form av terapeutiske implikasjoner, tyder dette på at også mCRC pasienter med muterte BRAF og PIK3CA gener bør få liten eller ingen nytte av EGFR-målrettet terapi. Spesielt, er KRAS, BRAF mutasjoner og PIK3CA vanligvis aktivert (opp til 50-60% som en helhet) i CRC-pasienter [14]. Av denne grunn, oppdagelsen av nye behandlingstilbud effektive i mCRC pasienter som bærer slike mutasjoner representerer i dag en intensiv område av etterforskningen [11], [16] -. [18]
proteasehemmer gabexate mesilat er et stoff rutinemessig anvendes i klinisk praksis i Italia, Japan og Korea for behandling av akutt pankreatitt og disseminert intravaskulær koagulasjon, sammen med profylakse av post-ercp pankreatitt [19], [20]. Spesielt, har gabexate mesilat toksikologiske profil blitt testet på mennesker og alvorlige bivirkninger har sjelden blitt beskrevet. Interessant, i tidligere prekliniske studier, dette stoffet viste en potent antitumoraktivitet, inkludert hemming av CRC primær tumorvekst og levermetastaser i nakne mus [12].
Dette preklinisk studie forsøkte å undersøke den antatte antitumor effekten av gabexate mesilat, alene og i kombinasjon med anti-EGFR-monoklonale antistoff cetuximab, i et panel av humane CRC cellelinjer som bærer et annet uttrykk mønster av villtype /muterte KRAS, BRAF og PIK3CA gener. Resultater oppnådd (foruten bekrefter mangelen på respons på cetuximab i CRC celler som bærer slike mutasjoner) viste at gabexate mesilat var i stand til å utøve en bred antitumor effekt i slike celler, være i stand til å påvirke cellenes levedyktighet, invasiv potensial og tumorindusert angiogenese i alle cellelinjene som ble testet i denne studien, inkludert de som de skjuler dual KRAS /PIK3CA eller BRAF /PIK3CA mutasjon. Effektiviteten av gabexate mesilat som monoterapi ble funnet å være sammenlignbar med det som observeres når dette stoffet ble brukt i kombinasjon med cetuximab, og således indikerer at den antitumorale effekten av disse medikamentene i kombinasjonen var ikke bedre enn den til gabexate mesilat anvendes som monoterapi.
Spesielt, cellevekst, et høyt potensial invasiv og tumorindusert angiogenese er tre svingbare prosesser for kreftutvikling og metastatisation, og representerer således et attraktivt mål for behandling av kreft. Som et spørsmål om faktum, mange terapeutiske strategier basert på integrering av selektive hemmere av disse banene blir nå allment utforsket i prekliniske og kliniske studier. I denne sammenheng, også tar hensyn til god toksikologiske profil, de foreløpige resultatene viste i denne korte rapporten tyder på at gabexate mesilat kunne representere en lovende behandlingsalternativ for mCRC pasienter, spesielt for de som peiling muterte KRAS, BRAF og PIK3CA gener, enten som monoterapi eller i tillegg til standard kjemoterapiregimer. Videre studier for å bedre belyse gabexate mesilat virkningsmekanisme i CRC cellene er derfor berettiget.
Materialer og metoder
Celler og cellekultur
Den menneskelige CRC cellelinjer HT-29 , LS174T og HCT-116, så vel som human udødeliggjort endotel-lignende EA.hy926 cellelinje, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). RKO, CACO-2, SW480 og SW48, SW620 og Colo205 menneskelige CRC cellelinjer var en generøs gave fra Dr. Luigi Ricciardiello (Institutt for klinisk medisin, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Bologna, Italia) og Prof. Massimo Derenzini (Clinical Department of Radiological og histopatologiske Sciences, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Bologna, Italia), henholdsvis. Alle cellelinjer ble dyrket i Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 4,5 g /l glukose (Euroclone, Milano, Italia), supplert med 10% (volum /volum) varme-inaktivert FBS (Euroclone), 2 mM L-glutamin, 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Celler ble dyrket ved 37 ° C i en fuktig atmosfære med 95% luft og 5% CO
2 og rutinemessig passert ved hjelp av trypsin-EDTA 0,025% (Sigma-Aldrich). For hver cellelinje benyttet i denne studien, en cellelinje autentiseringstesten ved å evaluere DNA kort tandem repeat (STR) profil ble utført, for å utelukke en kontaminering eller forveksling med andre cellelinjer.
medikamentell behandling
Gabexate mesilat (Foy, Sanofi Aventis, Milano, Italia) og cetuximab (erbitux, (Merck, Darmstadt, Tyskland) ble fortynnet i mediet for å oppnå den ønskede sluttkonsentrasjonen før hvert forsøk. for begge stoffer er de doser som anvendes (100 ug /ml for cetuximab og 0,1-1 mM for gabexate mesilat) ble valgt i henhold til foregående in vitro studier [12], [13], [21], [22]. Som gabexate mesilat har blitt rapportert å være delvis degradert ved serumalbumin [23], ble alle forsøk utført i serumfritt medium. i forsøk utført med det kondisjonerte medium av CRC cellelinjer, ble cellene behandlet med medikamenter, alene og i kombinasjon, i 6 timer og deretter kondisjonert medium ble høstet, sentrifugert ved 500 x g i 5 min ved 4 ° C for å fjerne celler og rusk, og frosset ved -80 ° C inntil bruk.
cellenes levedyktighet Assay
cellenes levedyktighet eksperimenter ble utført ved å 3- [4,5-dimetyltiazol-2-yl] -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) assay. I korthet CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116-celler (1 x 10
4 celler /brønn) ble sådd ut i en 96-brønns plate i fire og tillatt å følge i 24 timer. Da celler ble behandlet med cetuximab og økende konsentrasjoner av gabexate mesilat i 24 og 48 timer. Ved slutten av inkuberingen, ble MTT tilsatt til hver brønn og cellene inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Formazankrystaller ble deretter oppløst ved tilsetning DMSO. Absorbans ble deretter målt ved 570 nm i en 96-brønners mikroplater spektrofotometrisk leser (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). For hver cellelinje, IC
50 verdi ble beregnet ved lineær regresjonsanalyse ved hjelp PRISM 5,01 programvareversjon (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
Chemoinvasion analysen
invasiv potensialet i CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT-116 celler ble bestemt ved chemoinvasion-analyse [24]. Kort fortalt ble polyvinylpyrrolidon frie polykarbonat filtre (Millipore, Co Cork, Irland) med 12 mikrometer porer belagt med Matrigel (Sigma-Aldrich). Frisk DMEM supplert med 10% varme-inaktivert FBS ble plassert i det nedre kammer som kjemotiltrekkende og 1 x 10
5-celler ble deretter sådd i det øvre kammer og inkubert i 6 timer med gabexate mesilat og cetuximab, alene og i kombinasjon, ved 37 ° C i fuktig 5% CO
2. Ved slutten av inkubasjonen ble ikke-invaderende celler fjernes fra den øvre overflaten av filtrene. Invaderende celler i den nedre overflate ble deretter fiksert i 1 minutt i etanol 95% og farget i 10 minutter med 0,5% w /v toluidinblått. I migrasjonsanalysen, ble den samme prosedyren som invasjon assay fulgt, med unntagelse av at filtrene ble belagt med gelatin (Sigma-Aldrich). Bildene ble tatt med et Olympus CKX41 invertert mikroskop (Olympus Italia, Milano, Italia), som er utstyrt med en Olympus C5060-ADU kamera (Olympus Italia). For hver prøve ble fire tilfeldige optiske feltene ved x 200 forstørrelse av total analysert, og det midlere antall av invaderende celler ble beregnet som følger: a. Bety antall invaderende celler /betyr antallet av tilsvarende celler som migrerer
In vitro Angiogenese analyse~~POS=TRUNC
in vitro angiogenese ble vurdert av endothelial celledifferensiering i kapillær-lignende strukturer i Matrigel. I korthet, vekstfaktor-anriket Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, USA) ble plassert i et is-kald 24-brønners plate og til venstre for å polymerisere i en time ved 37 ° C. EA.hy926 endotelceller (1,2 × 10
5 /brønn) ble deretter belagt og inkubert i 24 timer med en lik mengde CACO-2, SW48, HT-29, Colo205, SW480, SW620, RKO, LS174T og HCT -116 kondisjonert medium, oppnådd som beskrevet ovenfor for Materiell og Metoder delen. Kreftcelle kondisjonert medium blir faktisk ofte brukt i in vitro-angiogenese-analyser for å etterligne det som skjer under in vivo tumor angiogenese [25]. Ved slutten av inkuberingen, ble en tre-dimensjonal organisasjon observeres gjennom en omvendt fasekontrast lysmikroskop. Fotografier av fire felt er representative for hver prøve ble erholdt ved x 200 total forstørrelse med et Olympus CKX41 invertert mikroskop (Olympus Italia), som er utstyrt med et Olympus C5060-ADU kamera (Olympus Italia). En semi-kvantitativ måling av kapillar-lignende strukturer (rør formasjon indeks) ble utført som tidligere beskrevet [26].
Statistical Analysis
Resultatene er uttrykt som prosentandel gjennomsnitt ± S.D. Data ble analysert ved ANOVA etterfulgt av Bonferroni innlegg hoc test, ved hjelp av PRISM 5,01 programvareversjon (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Takk
Forfatterne takke Senter for Applied Biomedical Research (CRBA, Sant’Orsola-Malpighi Hospital, University of Bologna, Bologna, Italia. ) for å gi anleggene for denne studien og Dr. Carla Bini (Institutt for medisin og folkehelse, Universitetet i Bologna, Bologna, Italia) for cellelinje godkjenning.
