Abstract
Denne studien undersøker rolle s-nitrosylation i veksten av kreft i eggstokkene ved hjelp av cellekulturbasert og
in vivo
tilnærminger. Ved hjelp av nitrosylating middel, S-nitrosoglutathione (GSNO), en fysiologisk nitrogenoksid molekylet, viser vi at GSNO behandling inhiberte proliferasjon av chemoresponsive og kjemoresistent ovarie cancer-cellelinjer (A2780, C200, SKVO3, ID8, OVCAR3, OVCAR4, OVCAR5, OVCAR7, OVCAR8, OVCAR10, PE01 og PE04) på en doseavhengig måte. GSNO behandling avskaffet vekstfaktor (HB-EGF) indusert signaltransduksjon inkludert fosforylering av Akt, p42 /44 og STAT3, som er kjent for å spille kritiske roller i eggstokkreft vekst og progresjon. For å undersøke den terapeutiske potensialet av GSNO
in vivo
, nakne mus som bærer intra-peritoneal-xenotransplantater av human ovariekarsinom A2780 cellelinje (2 x 10
6) ble administrert oralt GSNO ved en dose på 1 mg /kg kroppsvekt. Daglig oral administrering av GSNO vesentlig attenuert tumormasse (p 0,001) i det peritoneale hulrom i forhold til kjøretøyet (fosfatbufret saltløsning) ble behandlet gruppe på 4 uker. GSNO også forsterkes cisplatin mediert svulst toksisitet i en A2780 ovarialcancer naken mus modell. GSNO er nitrosylating evne ble reflektert i den induserte nitrosylation av ulike kjente proteiner inkludert NFkB p65, Akt og EGFR. Som et nytt funn, observerte vi at GSNO også indusert nitrosylation med inverse forholdet på tyrosin 705 fosforylering av STAT3, en etablert aktør i chemoresistance og celleproliferasjon i eggstokkreft og kreft generelt. Samlet vår studie understreker betydningen av S-nitrosylation av nøkkel kreft fremme proteiner i moduler eggstokkreft og foreslår terapeutiske potensialet i nitrosylating agenter (som GSNO) for behandling av eggstokkreft alene eller i kombinasjon med cellegifter.
Citation: Giri S, Rattan R, Deshpande M, Maguire JL, Johnson Z, Graham RP, et al. (2014) Preklinisk terapeutiske potensialet av en Nitrosylating Agent i behandling av eggstokkreft. PLoS ONE 9 (6): e97897. doi: 10,1371 /journal.pone.0097897
Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, Taiwan
mottatt: 07.01.2014; Godkjent: 24 april 2014; Publisert: 02.06.2014
Copyright: © 2014 Giri et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet støttes av Marsha Rivkin Scholar stipend og Department of Defense OCRP pris W81XWH-12-1-0270 til SG. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Eggstokkreft (OvCa) er den femte vanligste årsaken til død av alle krefttilfeller blant kvinner i USA og den ledende dødsårsaken fra gynekologiske kreftformer [1]. De høye dødelighet assosiert med OvCa skyldes de fleste pasientene (75%) som presenterer med utbredt (stadium III eller høyere) sykdom ved diagnosetidspunktet [2]. De fattige fem-års overlevelse (30%) skyldes det faktum at de fleste OvCa er er ubrukelige på diagnosetidspunktet. Dersom det oppdages tidlig, mer enn 90% av pasientene har en bedre prognose og svare på terapi sammenlignet med pasienter med et avansert stadium av sykdommen. Følgelig kan en bedre forståelse av viktige molekylære hendelser som spiller viktige roller i OvCa føre til bedre diagnose og behandling.
S-nitrosoglutathione (GSNO) er en nitrosylating middel som medierer den posttranslasjonelle prosessen med S-nitrosylation på proteiner resulterende i modulering av deres aktivitet. S-nitrosylation er en viktig biologisk omsetning av nitrogenoksid (NO) og refererer til omdannelse av tiolgrupper, inkludert cysteinrester i proteiner, for å danne S-nitrosothiols. Det er en mekanisme for dynamisk posttranslational regulering av de fleste eller alle hovedklasser av protein og er uavhengig av enzymkatalyse, labil modifikasjon, på /av-bryter lignende fotofosforylering [3]; imidlertid, denitrosylation kan være enzymatisk eller ikke-enzymatisk. Et økende antall proteiner har blitt funnet å gjennomgå S-nitrosylation
in vivo, etter kalt S-nitrosothiols, og de spiller en viktig rolle i ulike prosesser som spenner fra signaltransduksjon, DNA-reparasjon, vert forsvar, og blodtrykket kontrollen for å ionekanal regulering og neurotransmission [3]. Imidlertid har rollen som S-nitrosylation i OvCa vekst og progresjon ikke undersøkt.
Denne studien ble planlagt å undersøke den terapeutiske effekten av en nitrosylating middel (GSNO) i OvCa ved hjelp av
in vitro
og
in vivo
modeller og til å undersøke hvilken rolle nitrosylation i OvCa.
Metoder
Reagenser og antistoffer
GSNO ble kjøpt fra World presisjonsinstrumenter (Sarasota, FL) og dens renhet er 98%. Følgende antistoffer fosfor-Stat3 (Y705) (Cat # 9145, brukt på 1:1000), Pakt (Ser473) (Cat # 4060, brukt på 1:1000), p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) (Cat # 4370, brukt på 1:1000), STAT3 (Cat # 9139, brukt på 1:1000) Akt (Cat # 4685, brukt på 1:1000), p42 /44 (Cat # 9107, brukt på 1:1000) var fra Cell Signaling (Danvers, MA). Beta-aktin (b-aktin) ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, MO). Føtalt bovint serum ble kjøpt fra BioAbChem (Ladson, SC). Rekombinant STAT3 ble kjøpt fra SignalChem (Richmond, Canada).
Cell Culture
Menneskelig OvCa cellelinje SKOV3 og OVCARs var fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). A2780, C200 og OVCAR4 cellelinjer var en slags gave fra Dr. Tom Hamilton (Fox Chase Cancer Center) [4]. PE01 og PE04 var en slags gave fra Dr. Taniguchi (University of Washington, Seattle) [4]. Alle OvCa cellelinjer ble opprettholdt og dyrket i komplett Roswell Park Memorial Institute (RPMI)
media som inneholder 10% føtalt bovint serum og antibiotika.
Dyr
Etikk erklæringen.
Seks – til åtte ukers gamle kvinnelige nakne mus ble kjøpt fra National Cancer Institute-Fredrik Cancer Research and Development Center (Frederick, MD). Alle mus ble plassert og holdt under spesifikke forhold i anleggene på Mayo Clinic i Rochester, MN. Fasilitetene er godkjent og kontrollert av American Association for Akkreditering av Laboratory Animal Care (AAALAC Akkreditering # 000717) og i samsvar med gjeldende regelverk og standarder for det amerikanske Department of Agriculture, US Department of Health and Human Services, og National Institutes of Helse. Alle studier ble godkjent og overvåket av Mayo Clinic Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) under protokollnummer A13909.
Mus ble vedlikeholdt i henhold til Institutional IACUC godkjent protokoll. A2780 celler ble vasket to ganger og resuspendert i fosfatbufret saltvann (PBS) ved 2 x 10
6/100 pl og sprøytes inn i intraperitoneal hulrommet i nakne mus (dag 0). Behandling med GSNO (1 mg /kg kroppsvekt) ble startet 3 dager etter inokulering av cellene. GSNO ble administrert ved oral tvangsforing i 0,1 ml volum ved anvendelse av en 20 gauge foringsnål med kulediameter på 2,25 mm (Braintree Scientific, MA). Kontrollgruppen fikk PBS som en bærer. Musene ble overvåket daglig for en hvilken som helst ubehag og veies hver tredje dag for å kontrollere tumorvekst. For kombinasjonsstudier, cisplatinbehandling (4 mg /kg kroppsvekt) ved intraperitoneal injeksjon ble gitt på dagene 7, 14 og 21 sammen med GSNO behandling som beskrevet ovenfor (dag 0 ble tatt som dagen for inokulering av celler). Etter tumorfremkallelse, ble musene overvåket daglig for tegn på noen nød. Mus ble menneskelig drept med overdose av CO2 på 4 uker når tumorbelastning nådd mandatet vekt i ubehandlede mus [4], [5] og svulster ble skåret ut og fiksert i formalin for seksjonering.
immunoblotanalyse
Etter den fastsatte tiden for inkubasjon i nærvær eller fravær av angitte mengder GSNO, ble utført immunoblotanalyse med spesifikke antistoffer som tidligere beskrevet [6] – [9]. I korte trekk, behandlet og ubehandlet A2780 eller SKOV3-celler ble behandlet med HB-EGF (50 ng /ml) og /eller GSNO (2 h forbehandling før tilsetningen av HB-EGF på celler) ved forskjellige tidsperioder (5-20 min ) ble lysert i lyseringsbuffer [50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM DTT, 50 mM Na3VO4 og 0,5% Nonidet P-40] inneholdende en protease inhibitor cocktail ( Sigma, St. Louis, MO). Førti ug av proteiner ble oppløst ved SDS-PAGE og overført på nitrocellulosemembran. Membranen ble deretter blokkert i 1 time i 5% fettfri tørrmelk TTBS (20 mM Tris, 500 mM NaCl og 0,1% Tween 20, pH 7,5) og inkubert over natten i primære antisera mot fosfor-STAT3 (Y705), STAT3, p -p42 /44 (Thr202 /Y204), p42 /44, pakt (Ser473), Akt eller β-aktin inneholdende 5% fettfri tørrmelk eller 5% BSA i tilfelle av fosfo-antistoffer. Etter inkubasjon med HRP-konjugert sekundært Ab, ble blotter utviklet med en ECL deteksjonssystem (GE Healthcare, Piscataway, NJ).
proliferasjonsanalyser
Cells (2,5 til 5,0 × 10
4) ble sådd ut i 24-brønns plate in triplo og behandlet med indikerte konsentrasjoner av GSNO i 48 timer. Inaktive oksyderte GSNO ble anvendt som en kontroll. Inaktive oksyderte GSNO ble fremstilt ved å eksponere GSNO oppløsning (0,2 mM i DMSO) til lys i 7 dager. Oksidert GSNO er fargeløs og produserer ikke NEI når de tilsettes til celle media alene eller med celler i motsetning til ikke-eksponerte GSNO (figur S1A BD Biosciences). De nedre kammer inneholdt serum-fritt medium inneholdende forskjellige vekstfaktor inkludert HB-EGF og SDF1 ved en konsentrasjon på 25 ng /ml. Celler som invaderer den nedre overflate av filteret belagt med et tynt lag av Matrigel ble farget med 0,5% krystallfiolett (60% PBS, 40% EtOH) og tellet med et invertert mikroskop. Resultatene fra minst to uavhengige eksperimenter i triplicates presenteres.
Immunohistochemistry (IHC)
Svulstene skåret ut fra mus ble fiksert i 10% paraformaldehyde i 48 timer og parafin innebygd. Fire-mikrometer tykke seksjoner sammenhengende ble kuttet og behandlet for immunhistokjemi for CD31 (Cat # sc31045, brukt på 1:100) og Ki-67 (Cat # M7240, som brukes ved 1:100). Løsninger anskaffet fra Dako Cytomation (Glostrup, Danmark) ble brukt for å utføre farging. I korte trekk, ble vevssnitt deparaffinized, umaskert, blokkert med avidin-biotin og inkubert med primært antistoff over natten. Neste dag reaksjonen ble påvist ved hjelp av kromogen i henhold til produsentens instruksjoner (Dako, Glostrup, Danmark). De positive celler farget brunt. Glassene ble undersøkt under lysmikroskop og representative piktogrammer ble tatt fra et minimum på 5 eller 6 forskjellige lysbilder av hver gruppe. For CD31 flekker, ble FITC-merket sekundært antistoff brukt og visualiseres ved hjelp av fluorescerende mikroskop i 6 deler per gruppe.
Mitotisk telle og Live-tumormålinger
mitotisk tellingen ble tatt opp på hematoxylin og eosin farget seksjoner ved hjelp av Olympus BX-41 lysmikroskop ved høy effekt felt (HPF; × 400). Celler som gjennomgår mitose ble talt i svulstene, i den mest aktive området ( «hot spots») i minimum 5 påfølgende HPFS. Gjennomsnittlig antall celler som gjennomgår mitose per HPF ble nummerert. Maksimale diameter av levedyktige tumor ble beregnet ved å summere de største dimensjonal diameteren av hvert fragment av tumor ved bruk av Olympus BX-41 mikroskop og et mikrometer. På tilsvarende måte ble det nekrotiske områder målt og kompositt levende tumorstørrelse ble beregnet fra hvert lysbilde som publisert før [4], [5].
Statistical Analysis
Data er uttrykt som gjennomsnitt + SD og ble statistisk analysert ved hjelp av t-test (Prism). P 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant
Resultater
GSNO hemmer spredning av OvCa cellelinjer
For å vurdere effekten av GSNO behandling på OvCa vekst, ulike OvCa celle. linjer (A2780, C200, PE01, PE04, OV202 og SKOV3) ble behandlet med forskjellige konsentrasjoner av GSNO (0,1-1 mM). Proliferasjon ble bestemt ved MTT-analyse etter 24 timer. Behandling med GSNO inhiberte proliferasjonen av disse OvCa cellelinjer betydelig i en doseavhengig måte (fig. 1) omfattende cisplatin resistente C200 (Fig. 1B), taxol motstandsdyktig PE04 (fig. 1D) og aggressive SKOV3 cellelinjer (Fig. 1E ). Tilsetting av GSNO i media utgitt NO doseavhengig måte; men det gjorde oksidert GSNO ikke produsere NO (Fig. S1B-C). Vi målte også IC50 på GSNO på celleproliferasjon av forskjellige OVCA cellelinjer ved hjelp av CalcuSyn program. IC50 for GSNO var 0,162, 0,385, 0,337, 0,427, 0,196 og 0,235 mmol /L i A2780, C200, PE01, PE04, OV2O2 og SKOV3 henholdsvis (tabell S1). GSNO behandling også svekkede celle proliferasjon av andre cellelinjer, inkludert OvCa OVCAR-3, -4, 5, -7, -8 og -10 på en doseavhengig måte (fig. S2). IC50 for GSNO i disse cellelinjene ble funnet forskjellig og oppført i tabell S1. Den inaktive oksidert form av GSNO hadde ingen effekt på spredning av OvCa cellelinjer
Prosent levedyktighet av A2780, C200, PE01, PE04, SKOV3 og OV202 behandlet med angitte doser av S-nitrosoglutathione (GSNO;. 0.1- 1 mM) ble bestemt ved MTT-analyse. Inaktive GSNO (oksidert, siste bar) ble brukt som en kontroll. Dataene representerer 3 individuelle eksperimenter utført i tre eksemplarer. *** P 0,001; ** P 0,01; * P 0,05 og NS; ikke signifikant sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av t-test (Prism).
For å finne ut om dette hemming ble reflektert i klonogene overleve, kolonidannende evne A2780, C200, PE01 og PE04 celler ble utført . Som vist i figur 2, en enkelt behandling av GSNO vesentlig attenuert klonogene overlevelses av disse OvCa cellelinjer på en doseavhengig måte sammenlignet med ubehandlede celler (fig. 2). IC50 for GSNO ble funnet å være 0,122, 0,161, 0,356 og 0,352 mmol /l i i A2780, C200, og PE01 PE04, henholdsvis (tabell S2). Inaktiv oksidert form av GSNO ikke hadde noen virkning på kolonidannelse av OvCa cellelinjer. Disse resultatene tyder på at GSNO behandling kan resultere i en vedvarende inhibering av proliferasjon av ulike OvCa cellelinjer, inkludert cellelinjer kjemoresistent (C200 og PE04) (figur 2B, C . F).
Celler (2 x 10
3) /brønn (A2780, C200, PEO1 og PEO4) ble belagt i 6-brønners plater og behandlet med angitte konsentrasjoner av S-nitrosoglutathione (GSNO) en gang. Oksidert GSNO ble brukt som en negativ kontroll (siste bar). Etter 2 uker ble kolonier farget med MTT og telles. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. * P 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001 og NS; ikke signifikant sammenlignet med ubehandlede celler ved hjelp av t-test (Prism).
GSNO demper vekstfaktorer indusert celle migrasjon og invasjon
in vitro
Vi neste undersøkt virkningen av GSNO på vekstfaktor-mediert cellemigrering og invasjon. SKOV3-celler dyrket over natten i lavt serum (0,2%) inneholdende medium ble skrapet med en steril 200 mL pipettespissen, etter at de hadde nådd 90% sammenflyting. Forskjellige vekstfaktorer inkludert HB-EGF og (henholdsvis 50 ng og 25 ng /ml) SDF1 ble tilsatt hver for seg til det medium i nærvær eller fravær av GSNO (200 uM). Tjuefire timer senere ble satsen for sårheling beregnet. Som vist i figur 3A, GSNO inhiberte all HB-EGF og SDF1 mediert cellemigrering i SKOV3 cellelinje. Lignende resultater ble oppnådd for A2780 og C200 cellelinjer (data ikke vist). Neste vurderte vi effekten av GSNO ved modulering av vekstfaktor-mediert invasjon av SKOV3-celler ved anvendelse Boyden kammer migrasjonsanalysen (BD Bioscience, San Jose, CA) som tidligere beskrevet [11]. Figur 3B viser klart at GSNO behandling inhiberte signifikant vekstfaktor indusert invasjon av SKOV3-celler sammenlignet med ubehandlede celler. Disse resultatene indikerer at GSNO har evnen til å inhibere migrering og invasjon av OvCa celler.
A. Celler dyrket med HB-EGF og SDF1 i fravær eller nærvær av S-nitrosoglutathione (GSNO), og cellevandring ble målt ved sårheling analyse som beskrevet i materiale og metoder. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± SD av n = 7. B. For å undersøke effekten av GSNO på invasjon, 1 x 10
5 SKOV3-celler ble podet inn i de øvre brønner med 0,2 mM GSNO i det øvre kammer av transwell i 500 ul kulturmedium. Forskjellige vekstfaktorer (HB-EGF og SDF1) (25 ng /ml) ble tilsatt til de underliggende mediet. Tjuefire timer senere invasjonen ble bestemt etter produsentens anvisninger. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± SD av triplikater. $$$ P 0,001 vekstfaktor behandlet i forhold til kontroll. * P 0,05; *** P. 0,001 GSNO behandlet i forhold til vekstfaktor ved hjelp av t-test (Prism)
GSNO opphever vekstfaktor indusert signalisering i OvCa celler
For å undersøke effekten av GSNO på vekstfaktor indusert signalering, serum-sultet A2780 og SKOV3-celler ble behandlet med GSNO fulgt av HB-EGF behandling i forskjellige tidsperioder. Cellene ble høstet og immunoblottet for forskjellige signaliseringsmolekyler. Som vist i figur 4, behandling med GSNO hemmet HB-EGF-indusert aktivering av STAT3, Akt og p42 /44 som fremgår av de redusert eller manglende fosforylering detektert sammenlignet med HB-EGF behandlede prøver. GSNO behandling også redusert basalnivåer av fosforylert form av Akt, STAT3 og p42 /44 på A2780 og SKOV3 cellelinjer (Fig. 4). Ikke aktiv kontroll (oksidert GSNO) hadde ingen effekt på vekstfaktor-induserte signalering, noe som tyder på spesifisiteten av GSNO i dempende HB-EGF induserte signalering og en mulig mekanisme ved hvilken GSNO medierer demping av cellevekst, migrering og invasjon av OvCa celler
in vitro
A2780 (A) og (B) SKOV3-celler ble sådd ut, serum-sultet over natten og ble behandlet med S-nitrosoglutathione (GSNO; 0,5 mM). eller inaktive kontroll (oksydert GSNO; 0,5 mM) i nærvær eller fravær av HB-EGF (50 ng /ml) i forskjellige tidsperioder (5-20 min). Celler ble høstet ved angitte tidspunkter og behandlet for påvisning av forskjellige signaliseringsmolekyler inkludert pSTAT3 (Tyr705), pakt (Ser473) og p-p42 /44 (Thr202 /Tyr204) ved hjelp av sine spesifikke antistoffer fra Cell Signaling (Danvers, MA). Total STAT3, Akt, p42 /44 og β-aktin ble benyttet for lik belastning. Blot er representative for to uavhengig kjøre eksperimenter.
Oral administrasjon av GSNO demper tumorvekst og forbedrer cisplatin indusert cytotoksisitet
in vivo
For å finne ut om GSNO kunne svekke tumorvekst
in vivo
, A2780-celler (2 x 10
6) i PBS ble inokulert intraperitonealt i 6 uker gamle hunn nakne mus for etablering av tumorer. Mus ble plassert i to behandlingsgrupper. Den første gruppen (ubehandlet) ble gitt 100 ul PBS for eksempel bilen ved inntak. Den andre gruppen ble gitt oralt GSNO i PBS (100 ul) i en dose på 1 mg /kg kroppsvekt hver dag som beskrevet i materiale og metoder (Fig. 5A). På slutten av 4 uker ble musene avlivet, og den tumorbelastning var grovt undersøkt, skåret ut og veiet. Daglig administrering av GSNO betydelig redusert mage omkrets (p 0,01) (figur 5B.), En indikasjon på tumorbyrden blir gjennomført i peritoneum. GSNO også redusert tumorvekst (p 0,001) i bukhulen til A2780 bærende nakne mus sammenlignet med bærer (PBS) behandlede gruppen. De gjennomsnittlige vekter av det utskårede tumorene var omtrent 68% mindre i GSNO (3,35 ± 0,52 g) behandlede mus i forhold til ubehandlede mus (7,91 ± 0,412 g) (fig. 5C). Som tidligere rapportert av Shaw et al [12] og oss [4], injisert intraperitonealt A2780-celler hovedsakelig dannet solide svulster og presentert med ovarie-spesifikk metastaser (figur 5D, nedre panel). De eggstokk-assosiert tumormasser i GSNO behandlede mus var mye mindre enn i det ubehandlede mus (fig. 5D). For å vurdere levedyktigheten til tumoren ytterligere, ble nekrotisk og levedyktig tumorstørrelse bestemmes fra hematoksylin og eosin fargete snitt. Forholdet av levende tumorstørrelse til total tumorstørrelse ble beregnet på grunnlag av den største diameter dimensjonal som beskrevet i fremgangsmåtene. Som vist på figur 5E, xenotransplantater avledet fra GSNO behandlede mus hadde signifikant mindre levedyktige tumorstørrelser (p 0,001) og økte nekrotiske områder sammenlignet med xenotransplantater avledet fra ubehandlede mus. Selv om det var en nedadgående trenden i mitotiske og fartøy tellinger av de GSNO behandlede mus svulster, kunne vi ikke påvise en vesentlig endring (fig. 5F-G). Samlet sett antyder vår studie sterkt potensial nitrosylating middel i å dempe veksten av OvCa
in vivo plakater (Fig. 5).
A. Skjematisk diagram av eksperimentell design. I korte trekk, ble A2780 eggstokk-kreft cellelinje injisert intraperitonealt i nakne mus, og S-nitrosoglutathione (GSNO) ble gitt oralt daglig fra dag 3 i en dose på 1 mg /kg kroppsvekt til slutten av studien. Fosfatbufret saltvann (PBS) ble gitt som kjøretøy. B. Redusert abdominal omkrets GSNO behandlede mus sammenlignet med kjøretøy behandlet grupper målt i uke 4 (** p 0,01 behandlet i forhold til kjøretøyet). C. Redusert utskårende tumor vekter av GSNO behandlede mus sammenlignet med kjøretøy behandlet i uke 4 (*** p 0,001 behandlet i forhold til kjøretøyet). Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± SD av 10-14 individuelle dyr. D. Representant brutto morfologisk bilde av tumormasse og tumor assosiert med eggstokk av kjøretøy og GSNO behandlede mus. E. Målinger av levedyktige tumorstørrelse fra GSNO vs PBS-behandlede mus, som beskrevet i metodene (*** p 0,001 behandlede sammenlignet med vehikkel). F. Greve av mitotiske celler og G. telling av CD31 positive fartøy per HPF (x400) i GSNO vs PBS-behandlede mus, som beskrevet i fremgangsmåter), ble tellinger utført fra 5 felt av 3 forskjellige tumorer fra hver gruppe. NS; ikke-signifikant behandlet i forhold til bilen.
Vi videre undersøkt om en kombinasjon av GSNO med cisplatin kan forbedre den cytotoksiske effekt i svulster. Derfor, etter injeksjon av A2780-celler, 2 sett av mus ble behandlet daglig med oral administrering av GSNO (1 mg /kg kroppsvekt) og cisplatin (ukentlig intraperitoneal injeksjon av cisplatin på dag 7, 14 og 21), som monoterapi. For kombinasjonsbehandling, ble ett sett med mus behandlet med GSNO og cisplatin som vist i figur 6A. Både GSNO og cisplatin var signifikant mer effektiv i å redusere tumorvekst og masse som monoterapi A2780 bærende mus (Fig. 6B). Men kombinasjonsbehandling var mer effektive i å hemme tumorvekst sammenlignet med monoterapi med enten stoffet. Kombinasjon av cisplatin (4 mg /kg kroppsvekt) med GSNO (1 mg /kg kroppsvekt) (2,08 ± 0,18 g) (fig. 6B) reduseres betraktelig tumorveksten sammenlignet med enten GSNO (3,54 ± 0,35 g), eller cisplatin behandling alene (3,15 ± 0,34 g) eller den ubehandlede mus (6,9 ± 0,66 g). Tumorvolumet ble redusert med ~90% i de fleste mus behandlet med kombinasjonen. Sammen er disse resultatene tyder på at kombinere GSNO med cisplatin behandling er signifikant mer effektiv i å redusere tumorvekst i en OvCa musemodell.
A. Skjematisk diagram av eksperimentell design. B. Kumulativ spaltet tumorvekt fra individuelle mus ved 4 uker med S-nitrosoglutathione (GSNO, 1 mg /kg kroppsvekt) (panel 2), cisplatin (4 mg /kg kroppsvekt) (panel 3) og GSNO (1 mg /kg kroppsvekt) og cisplatin (4 mg /kg kroppsvekt) kombinasjon (felt 4). Cisplatin ble gitt 3 ganger ved intraperitoneal rute på dag 7, 14 og 21 etter tumorinjeksjoner. Resultatene blir vist som gjennomsnitt ± SD for 7 individuelle dyr. *** P 0,001 kombinasjon av GSNO + cisplatin behandlede gruppen sammenlignet med ubehandlet eller cisplatin alene behandlede gruppe; ** P 0,01 GSNO behandlede gruppe i forhold til ubehandlet gruppe; * P 0,05 cisplatin behandlede gruppe i forhold til ubehandlet gruppe; # P. 0,05 kombinasjon av GSNO + cisplatin gruppen sammenlignet med GSNO alene gruppen
GSNO behandling indusert nitrosylation av STAT3
Siden, GSNO er en nitrosylating agent og kjent for å formidle den posttranslational fremgangsmåte for S-nitrosylation på proteiner, noe som resulterer i modulering av deres aktivitet [13]. Vi undersøkte effekten av GSNO på nitrosylation på ulike endogene proteiner som er kjent for å være nitrosylated og sentrale aktører i OvCa inkludert Akt, p65 og EGFR [14] -. [17]
For å undersøke nitrosylation av ulike proteiner , ansatt vi en sofistikert biotin-bryteren analysen. Basalnivået av nitrosylated proteiner kunne detekteres i området 250 til 35 kd molekylvekt i OvCa celler (Fig. 7A, kolonne 1). GSNO behandling potensierte nitrosylation av endogene proteiner i behandlede celler med GSNO (0,5 mM) i 2 timer (fig. 7A, kolonne 2). Spesifisiteten til nitrosylation kan oppnås ved å utelate tilsetningen av HPDP-biotin i løpet av biotin-svitsj-analyse. Som vist i figur 7A, kolonne 3, utelatelse av HPDP-biotin trinn blokkeres fullstendig detektering av nitrosylation av endogene proteiner, noe som understreker spesifisiteten av nitrosylation Fremgangsmåte i vårt laboratorium. Vi ytterligere validert induksjon av nitrosylation av GSNO ved å observere for nitrosylation av allerede meldt signalanlegg proteiner assosiert med kreft progresjon, inkludert eggstokkene. GSNO behandling indusert nitrosylation av p65, Akt og EGFR som forventet (Fig. 7B). Vi har videre oppdaget at den unike observasjon av STAT3 gjennomgår nitrosylation ved GSNO behandling (fig. 7B, C). For å bekrefte at STAT3 er nitrosylated ble STAT3 immunopresipitert etter biotin-bryteren analyse ved hjelp av spesifikke antistoffer og immunoblottet med anti-biotin-HRP. En lignende observasjon av STAT3 gjennomgår nitrosylation ved GSNO behandling ble sett. Disse settene eksperimenter klart indikerer en roman regulering av STAT3 av s-nitrosylation. For ytterligere å undersøke om dette fenomen er ikke bare begrenset til en celletype, behandlet vi forskjellige OvCa cellelinjer inkludert A2780, C200 og SKOV3 med GSNO og oksydert GSNO som en kontroll. Etter 2 timers inkubasjon ble totalt cellelysat behandlet for påvisning av fosforylering status av STAT3. Som vist i figur 7D, GSNO behandling opphevet eller redusert tyrosinfosforylering i alle OvCa cellelinjer uten å påvirke STAT3 nivåer. Oksidert GSNO påvirket ikke pSTAT3 nivåene i noen cellelinjer. Under lignende eksperimentelle forhold, undersøkte vi nitrosylation av STAT3 bruker biotin bryter metoden. GSNO behandling økte de totale nitrosylation av flere proteiner med lave til høye molekylvekter, sammenlignet med ubehandlede og oksidert GSNO behandles prøver som fremgår av figur 7E. Et lignende mønster ble observert i nitrosylation av STAT3 som tyder på at GSNO mediert økning i nitrosylation av STAT3 er et generelt fenomen i alle OvCa cellelinjer.
A. Påvisning av biotinylerte proteiner etter biotin-bryter metode i nærvær eller fravær av S-nitrosoglutathione (GSNO; 0,5 mM). Utelatelse av biotin-HPRT indikerer spesifisiteten til S-nitrosylation av biotin-bryter metode. B. Påvisning av nitrosylation av ulike proteiner inkludert EGFR, p65, Akt og STAT3 i eggstokkreft celler ved GSNO behandling. C. STAT3 ble immunopresipitert fra nitrosylated protein lysatet etter biotin bryter analysen og dens biotinylering ble påvist ved hjelp av anti-biotin-HRP ved hjelp av western blot-analyse. D. A2780, C200 og SKOV3 cellelinjer ble behandlet med GSNO (0,5 mM) eller oksydert GSNO (0,5 mM) som kontroll i 2 timer, etterfulgt av immunblotanalyse for påvisning av tyrosinfosforylering av STAT3 ved 705 rester og total STAT3. E. Under lignende eksperimentelle forhold som «D», A2780, ble C200 og SKOV3 celler behandlet for biotin bryter metode for påvisning av STAT3. Prøve i kjørefelt fire ble behandlet med GSNO som lane 2, bortsett fra under behandling for biotin bryter analysen; tilsetning av HPDP ble utelatt. Øvre panel viser biotinylerte proteiner etter biotin-bryteren analysen. Nitrosylated STAT3 ble påvist ved å trekke ned biotinylerte proteiner ved streptavidin-agarose, etterfulgt av immunblotanalyse ved anvendelse av anti-STAT3 antistoff. Lavere band viser det samlede nivået av innspill STAT3 bearbeidet for biotin bryter analysen.
GSNO nitrosylates STAT3 og påvirker dens evne til å binde DNA
Når vi etablert at STAT3 gjennomgår nitrosylation i dyrkede celler vi videre undersøkt om STAT3 kunne nitrosylated
in vitro Hotell og hvis det kan påvirke dens DNA bindende evne. For dette tok vi to tilnærminger, først vi isolert kjerneekstrakt fra SKOV3, som oppviser høyere basalnivåer av den fosforylerte form av STAT3 og har evnen til å binde STAT3 DNA-bindingsmotiv uten stimulering. Vi inkubert 20 ug av kjerneekstrakt (NE) med GSNO eller oksydert GSNO i nærvær eller fravær av DTT i 4 timer. Etter inkubering ble DNA-bindende evne STAT3 undersøkt ved inkubering nitrosylated NE med STAT3 gel-skift-oligonukleotider konjugert med agarose. Som vist på figur 8A, er GSNO behandlede prøve viste nitrosylation av STAT3 som fremgår av biotin bryter-analyse, og kunne ikke bli trukket ned av STAT3 gel-skift-oligonukleotider konjugert med agarose. Inkludering av DTT i prøver opphevet GSNO mediert nitrosylation av STAT3, noe som resulterer i binding av STAT3 på sin DNA-bindende motiv. STAT3 har også vist seg å rekruttere coactivator inkludert P300. 0,01;
