Abstract
Innledning
Vi vurderte uttrykk for P85 og p110α PI3K underenheter i ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) prøver og foreningen med mTOR uttrykk, og studert effekter av målretting PI3K /AKT /mTOR sti i NSCLC cellelinjer.
Metoder
Ved hjelp av automatiserte kvantitative analyse vi kvantifisert uttrykk for PI3K subenheter i to årskull av 190 og 168 NSCLC prøver og korrelert det med mTOR uttrykk. Vi har studert effekten av to PI3K-inhibitorer, LY294002 og NVP-BKM120, alene og i kombinasjon med rapamycin i 6 NSCLC-cellelinjer. Vi vurderte aktiviteten til en dual PI3K /mTOR-hemmer, NVP-BEZ235 alene og sammen med en EGFR-hemmer
Resultater
P85 og p110α tendens til å være co-uttrykkes (p 0,001).; P85 uttrykk var høyere i adenokarsinomer enn plateepitelkarsinom. Høy P85 uttrykk var assosiert med avansert stadium og dårlig overlevelse. p110α uttrykk korrelert med mTOR (ρ = 0,276). I seks NSCLC-cellelinjer, tilsetting av rapamycin til LY294002 eller NVP-BKM120 var synergistisk. Selv svært lave rapamycin konsentrasjoner (1 nM) resulterte i sensibilisering å PI3K hemmere. NVP-BEZ235 var meget aktiv i NSCLC-cellelinjer med IC
50s i det nanomolare området og resulterende nedregulering av pakt og pP70S6K. Legge Erlotinib til NVP-BEZ235 resulterte i synergistisk veksthemming.
Konklusjoner
Sammenhengen mellom PI3K uttrykk, avansert stadium og overlevelse i NSCLC tyder på at det kan være et verdifullt stoff mål. Samtidig hemming av PI3K og mTOR er synergistisk
in vitro
, og en dobbel PI3K /mTOR-hemmer var svært aktiv. Legge EGFR hemming resulterte i ytterligere veksthemming. Målrette det PI3K /AKT /mTOR sti på flere nivåer bør testes i kliniske studier for NSCLC
Citation. Zito CR, Jilăveanu LB, Anagnostou V, Rimm D, Bepler G, Maira S-M, et al. (2012) Multi-Level Targeting av phosphatidylinositol-3-kinase Pathway i ikke-småcellet lungekreft celler. PLoS ONE 7 (2): e31331. doi: 10,1371 /journal.pone.0031331
Redaktør: John D. Minna, Univesity of Texas Southwestern Medical Center i Dallas, USA
mottatt: 28 juni 2011; Godkjent: 06.01.2012; Publisert: 15 februar 2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av en Career Development Award av American Association for Cancer Research til Dr. Chao. Dr. Kluger støttes av Yale SPORE i Skin Cancer, en P50 CA121974 (til R. Halaban). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har lest journalen politikk og har følgende konflikter: Drs. RIMM og Camp er co-grunnleggerne, aksjonærer og konsulenter for et firma som heter HistoRx som har lisensiert teknologi for automatisert vev analyse brukt i denne studien. Drs. Maira og Hackl er ansatte i Novartis Company. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Lungekreft er den ledende årsak til kreft dødsfall på verdensbasis. I USA alene, ble ca 222 520 nye tilfeller diagnostisert og ca 157 300 dødsfall oppstått på grunn av lungekreft i 2010 [1]. Ikke-småcellet lungekreft (NSCLC) utgjør ca. 80% av alt lungekreft. De vanligste histologier er adenokarsinom, plateepitelkarsinom, og stor celle karsinom. Flertallet av NSCLC pasienter er diagnostisert på avansert stadium hvor kjemoterapi kan bedre overlevelse og palliasjon av symptomer. Men gir konvensjonell kjemoterapi ingen kur for avansert NSCLC og har nådd et platå i effekt med en median overlevelse på 8-10 [2] måneder. Tillegg av nye og mer målrettede behandlinger som bevacizumab og cetuximab til konvensjonell kjemoterapi har forbedret median overlevelse til ca 12 måneder hos pasienter med god allmenntilstand [3], [4]. Nye terapeutiske tilnærminger er sterkt behov for dette vanlig sykdom.
phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) /AKT /mTOR signalveien påvirker mange aspekter av cellevekst og overlevelse [5]. Endringer av komponenter i PI3K /AKT /mTOR sti kan skje på mange nivåer og føre til konstitutiv aktivering av denne veien og malign transformasjon.
PI3Ks er en familie av enzymer som fosforylerer phosphatidylinositol hydrogenfosfat til phosphatidylinositol trifosfat. PI3Ks er oftest aktiveres av reseptor-tyrosinkinase (RTK) signalering, for eksempel gjennom EGFR, IGF1-R og HER2 /neu [6] – [9]. Det er tre klasser av PI3Ks [10], [11]. Klasse I
A PI3K er den mest implisert i kreft typen, og vil bli referert til som «PI3K» i resten av dette manuskriptet. PI3K er en heterodimer som består av en regulatorisk P85 og en p110 katalytisk subenhet.
fosfatidylinositol-trifosfat medierer aktivering av AKT [11]. AKT, i sin tur, aktiverer mange cellulære proteiner involvert i proteinsyntese, cellevekst og overlevelse blant mTOR [11] – [13]. mTOR regulerer oversettelse av fosforylering komponenter i proteinsyntesen maskiner, inkludert de ribosomale proteiner S6 kinaser (p70
S6K) og 4E-bindende protein (4E-BP). Fosforylering av 4E-BP fører til utgivelsen av oversettelsen innvielse faktor eIF4E som har vist seg å utvise trans og anti-apoptotiske aktiviteter
in vitro product: [13], [14]. PTEN reverserer PI3K signalering av dephosphorylating phosphatidylinositol trifosfat [15].
I NSCLC er PI3K /AKT /mTOR signal ofte deregulert skyldes mutasjoner som påvirker en av sine oppstrøms regulatorer, EGFR-reseptoren, og andre komponenter i veien [16]. mTOR pathway komponenter ble funnet å være mutert i 17 gener og i mer enn 30% av tumorer i lunge 188 adenokarsinomer i hvilken exome sekvensering ble utført [16]. Økninger i genkopitallet av
PIK3CA
, genet som koder for p110α, og forandringer i fosforylert AKT (pakt) ekspresjon er blitt beskrevet i premaligne bronkiale epitelceller og NSCLC [17] – [22]. Mens mutasjoner i
PIK3CA
er relativt sjeldne i lungekreft,
PIK3CA
kopiere antall gevinsten er rapportert hos 33,1% av plateepitelkreft lungekreft og hos 6,2% adeno lungekreft i en stor serie [ ,,,0],23]. PI3K signalering er blitt vist å mediere bronchioalveolar stamcelle-ekspansjon initiert ved oncogene
K-RAS
[24]. Tumorassosierte mutasjoner av p110α er onkogene
in vivo
i en musemodell for NSCLC [25]. Overekspresjon av P85 og P110 α har vist seg å korrelere med dårlig differensiering av primære lungekreft i en kohort som inkluderte 73 tilfeller av NSCLC [26]. Vår gruppe har tidligere studert uttrykket av mTOR i NSCLC kohorter og fant en sammenheng med bedre utfall [27].
Hemming av PI3K /AKT /mTOR signaliserer gjennom farmakologiske og genetiske metoder induserer antiproliferative effekter på visse NSCLC cellelinjer [17] – [21] og i lunge cancer musemodeller [25], [28]. En rekke av PI3K-inhibitorer er tilgjengelig for preklinisk forskning. Eldre forbindelser som LY294002 eller Wortmannin har anti-tumor aktivitet i prekliniske modeller, men deres dårlige oppløselighet, smal terapeutisk indeks og crossover hemming av andre kinaser har begrenset deres kliniske anvendelse. Nyere PI3K hemmere har inngått tidlig fase kliniske studier, og aktiviteten til disse midlene bør vurderes i sykdommer som krever nye tilnærminger, for eksempel NSCLC.
Formålet med vår studie var å karakterisere uttrykk for P85 og P110 a subenheter av klasse i
En PI3K i to store independents årskull av NSCLC prøver og å vurdere sammen med kliniske og patologiske variabler som tidligere utgitt mTOR uttrykk. For å få mer presise, objektive uttrykk tiltak, brukte vi en nyutviklet metode for automatisert, kvantitativ analyse (AQUA) av microarray [29]. Som redundante aktivatorer av PI3K /AKT signalveien og negative tilbakemeldinger looper [5] begrense effekten av monoterapi behandlingsformer, vårt neste mål var å studere effektene av å målrette den PI3K /AKT signalveien på flere nivåer i NSCLC cellelinjer. Vi fant at høyere uttrykk av P85 korrelert med dårlig overlevelse og avansert stadium. Uttrykk for p110α korrelert med at av mTOR. Samtidig hemming av PI3K og mTOR resulterte i synergistisk veksthemming. Legge EGFR hemming ytterligere forbedret veksthemmende effekter av en dual PI3K /mTOR-hemmer.
Materialer og metoder
Tissue microarray (TMA) Bygging
En NSCLC kohorten ble innhentet fra H. Lee Moffitt Cancer Center (Tampa, Florida). Den Moffitt kreftsenter kohort (MTMA) inneholder kjerner fra primær NSCLC svulster i pasienter diagnostisert mellom 1991 og 2001. Oppfølging tiden varierte mellom 0,8 måneder og 146,4 måneder, gjennomsnittlig oppfølgingstiden 52,3 måneder. Alder ved diagnose varierte 40,8 til 84,4 (gjennomsnittsalder 69 år). Kohorten inkluderte 54,5% menn og 45,5% kvinner.
Yale University kohort (YTMA) ble konstruert fra parafininnstøpte, formalinfiksert vevsblokker hentet fra Yale University Institutt for patologi Archives. Prøvene ble resected mellom 1995 og 2003, med en oppfølging varierer mellom 0,1 måneder og 182.25 måneder, og en gjennomsnittlig oppfølgingstid på 41 måneder. Alder ved diagnose varierte 21-90 (gjennomsnittsalder 65 år). Kohorten inkluderte 51% menn og 49% kvinner.
TMA ble bygget som tidligere beskrevet [27]. To 0,6 mm Kjerner ble oppnådd fra forskjellige, representative områder av hver primær NSCLC prøven og med avstand 0,8 mm fra hverandre på objektglass. Cellelinje pellets som består av SW480, HT29, A431, MB435, MCF7, BT474, og SKBR3 ble anvendt som kontroller og ble innleiret i matrisen, som tidligere beskrevet [30]. Kohortene for MTMA og YTMA ble samlet inn med godkjenning av de institusjonelle gjennomgang styrene og har vært brukt i tidligere publikasjoner [27], [31].
Immunofluorescent flekker
TMA lysbilder ble farget for hver av de to target markører, PI3K P85 og p110α subenheter. Farging ble utført for AQUA som tidligere beskrevet [29] – [31]. Glassene ble inkubert med det primære antistoff fortynnet i Tris-bufret saltvann inneholdende 0,3% bovint serumalbumin ved 4 ° C. Primære antistoffer som brukes for de respektive inkuberinger ble mus monoklonalt anti-human PI3K P85, klon 4 /PI3-kinase (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) eller kanin-anti-human PI3K p110α klon C73F8 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ved 1:200 eller 1:50 fortynninger, henholdsvis. Enten geite-anti-mus eller geite-anti-kanin-pepperrot peroksidase-dekorerte polymer-ryggraden (Envision, Dako Nord-Amerika, Carpinteria, CA) ble anvendt for å visualisere målproteinet. For å opprette en svulst maske, ble lysbilder samtidig inkubert med enten mus eller kanin anti-cytokeratin på 1:100. For visualisering av cytokeratin farging et geit anti-mus eller anti-kanin-IgG konjugert med Alexa 546 (Molecular Probes, Inc.) ved 1:200 ble anvendt. Målet markør ble visualisert med Cy5-tyramide (NED Life Science Products). Dekk ble montert med forlenge Gold reagens med 4 «, 6-diamidino-to-phenylindole (DAPI) (Invitrogen).
Automatisert Image Acquisition and Analysis (AQUA)
Bilder ble analysert ved hjelp av algoritmer som er blitt beskrevet [29]. Tumor ble skilles fra stromal elementer ved cytokeratin signal. Koalesens av cytokeratin på celleoverflaten ble brukt til å lokalisere cellemembranen /cytoplasma kammer inne i svulsten maske, og DAPI ble brukt til å identifisere den kjernefysiske kammer inne i svulsten masken. Målene ble visualisert med Cy5; denne bølgelengde blir brukt for target merking fordi den ligger utenfor området av vev autofluorescens. Multiple monokromatisk, høy oppløsning (1024 x 1024 piksler, 0,5-mikrometer) gråtonebilder ble oppnådd for hver histospot med 10 × målet med et Olympus AX-51 epifluorescence mikroskop med automatisert mikroskop scenen og digital bilde oppkjøpet drevet av et tilpasset program og macrobased grensesnitt med IPLabs programvare (Scanalytics, Inc.). Bilder for hver histospot ble individuelt vurdert. To bilder ble tatt for hver histospot og for hver fluorescerende kanal, DAPI, Alexa-546, og Cy5; ett bilde i flyet av fokus og en 8 IM under. Den compartmentalization og kvantifisering av målproteinet signal innenfor hver enkelt forhåndsdefinert kammer for hver histospot ble utført som følger. Først ble Alexa 546-signal som representerer cytokeratin farging anvendes for å generere en epitelcelle-maske som utelukker alle andre stromale elementer. Dette signalet blir binær gated for å identifisere om en piksel er innenfor tumormasken (på) eller ikke (av); alle hvite piksler er en del av det maske og alle svarte piksler er ikke en del av denne avdelingen. Tilsvarende er den kjernefysiske rommet definert som piksler som viser DAPI farging innenfor planet av fokus og innenfor området definert av tumor masken. DAPI bildet er også binærisert å generere en maske av alle kjerner i prøven ved å trekke ut overlappende bildepunkter med det cytoplasmatiske masken; alle hvite piksler er en del av denne masken mens alle svarte piksler er det ikke. For å sikre at bare den målsignal fra tumoren og ikke de omkringliggende elementer analyseres, ble RESA /sted algoritmer anvendes. Den RESA algoritme gir en adaptiv terskel system. Generelt kan formalinfiksert vev oppviser autofluorescens og noen ganger analyse kan gi flere bakgrunns topper. Den RESA algoritmen etablerer den dominerende topp og deretter setter en binær maske terskel på et litt høyere intensitetsnivå. RESA eliminerer alle ut av fokus informasjon ved å trekke en prosentandel av ut-av-fokus bilde fra i-fokus bilde, basert på en piksel-for-piksel analyse av de to bildene. Dette gir mer nøyaktig tildeling av piksler på tilstøtende avdelinger slutt. Til slutt, bruker vi stedet algoritme for å tilordne hver piksel i hvert bilde til et bestemt subcellulære rommet. Alle bildepunkter som ikke kan være nøyaktig tilordnet et kammer med en grad av tillit til 95%, er til syvende og sist utelukket. I tillegg har alle bildeelementer for hvilke intensiteter er også like i de nukleære og membran kamrene og kan derfor ikke bli nøyaktig tilordnes er også utelukket. PI3K ekspresjon ble automatisk bestemt fra Cy5 kanal bilder for å oppnå relativ piksel intensitet for signalet som kommer fra fokusplanet. Først blir hver piksel tilordnes en subcellulære rom eller er utelukket som beskrevet ovenfor. En AQUA poengsum for eventuelle under-mobilnettet avdelinger er vanligvis beregnet som gjennomsnittet AQUA score fra hver av de enkelte pikslene i den valgte rommet; målet signal (P85 eller P110α) fra pikslene i cytoplasma ble normalisert til området av svulsten maske og scoret på en skala fra 0-255 (AQUA score). Histospots ble ekskludert hvis tumor masken representerer mindre enn 5% av det totale histospot området.
Statistical Analysis
JMP versjon 5,0 software ble anvendt (SAS Institute, Cary, NC). Den prognostiske betydningen av parametrene ble vurdert ved hjelp av Cox-modell med progresjonsfri overlevelse og total overlevelse som et sluttpunkt. Univariate overlevelsesanalyser ble avbildet med Kaplan-Meier metoden. Sammenhengen mellom kontinuerlige AQUA-score og andre kliniske /patologiske parametre ble bestemt ved variansanalyse. Alle rapporterte p-verdier er basert på tosidig betydning testing. ANOVA og t-test ble brukt for å sammenligne kontinuerlige målinger.
Cellelinjer og Western avsetninger
plateepitel karsinom cellelinje H2170 og adenokarsinom cellelinjer H1650, HCC2935 og HCC827 var velvillig gitt av legene. John Minna og Michael Peyton (Southwestern University). Plateepitel carcinom cellelinjer SK-MES-1 og SW900 ble oppnådd fra American Type Tissue Culture. Egenskapene til hver cellelinje inkludert mutasjonsstatus av
PIK3CA
,
K-RAS Hotell og
EGFR
er vist i tabell S1. De adenokarsinom cellelinjer H1650, HCC2935 og HCC827 ha villtype
PIK3CA Hotell og
K-RAS
men mutant
EGFR
. Alle plateepitel carcinom cellelinjer SK-MES-1, H2170 og SW900 har villtype
EGFR Hotell og villtype
PIK3CA
. SK-MES-1 og H2170 har villtype
K-RAS
. SW900 har mutant
K-RAS
. Vi var interessert i å sammenligne effekten av PI3K hemming i adenokarsinom til squamous carcinoma cellelinjer og sammenligne med
EGFR
mutant til
EGFR
vill type cellelinjer. Alle humane lungekreft-cellelinjer ble dyrket under standardbetingelser (37 ° C i 5% CO
2 atmosfære) og dyrket i RPMI (Gibco ™, Invitrogen Corp., Grand Island, NY) supplert med 10% FBS. HBE135-E6E7 cellelinje, en ikke-transformert bronkioalveolær cellelinje, ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA) og dyrket i keratinocytt-serumfritt medium supplert med 5 ng /ml human rekombinant EGF, 0,05 mg /ml bovint hypofysen ekstrakt, 0,005 mg /ml insulin og 500 ng /ml hydrokortison.
Protein konsentrasjoner av cellelysater ble beregnet ved BCA (Bicinchoninic Acid) assay (Pierce Biotechnology, Rockford, IL). Proteiner (50 ug) ble fortynnet i en prøvebuffer [2,5% SDS, 10% glycerol, 5% β-merkapto-etanol, 50 mM Tris (pH = 6,8) og 0,1% bromfenolblått] og underkastet natriumdodecylsulfat-polyakrylamid- gelelektroforese (SDS-PAGE). Western blotting ble utført ved standardmetoder ved hjelp av følgende primære kanin anti-humane antistoffer: fosforylert AKT (Ser
473), fosforylert p70S6K (Thr
389), PI3K p110α, fosforylert S6 ribosomalt protein (Ser
235 /236), PARP (cellesignalisering Technologies, Danvers, MA) ved 1:1000 og mus monoklonalt anti-human PI3K P85 eller anti-caspase-2 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) ved 1:1000. Et monoklonalt muse β-Actin (A2066 eller A5441, Sigma, henholdsvis 1:200 eller 1:5000) ble brukt som en kontroll for å standardisere prøven lasting. Påvisning av proteiner ble gjort med peroksidase-konjugert anti-mus eller anti-kanin IgG sekundære antistoffer (1:5000, Jackson Immunoresearch Laboratories) og ECL (PerkinElmer).
antineoplastiske midler og Celleviabilitet Analyser
celleviabilitet analyser, 1 x 10
3-celler ble sådd ut i triplikat i en 96-brønners mikrotiterplate (BD Bioscience) og fikk vokse i 24 timer til en omtrentlig konfluens på 30%. For legemiddelhemming studier, NVP-BEZ235 og NVP-BKM120 (Novartis, Basel, Sveits) og LY294002 (LC Laboratories, Woburn MA) ble brukt til å behandle lungeceller ved forskjellige konsentrasjoner. For kombinasjons eksperimenter, den mTORC1 inhibitor, rapamycin og EGFR-hemmer erlotinib (LC Laboratories) ble benyttet.
Celleviabilitet ble evaluert etter 72 timer ved hjelp av CellTiter-Glo ™ Lysende celleviabilitet analysen, i henhold til produsentens instruksjoner ( Promega, USA); et like stort volum av den Cell Titer Glo-™ reagens ble tilsatt til brønnene, og etter en 10 minutters inkubasjon, ble luminescens registreres ved hjelp av en Victor ™ X multilabel plateleser (Perkin Eimer). IC
50 verdier ble bestemt av XLfit programvare (MathIQ versjon 2.2.2, IDBS).
Synergistic Drug Effect Analysis
Chou og Talalay kombinasjon indeksen analysemetode ble brukt til å analysere resultatene fra kombinatoriske legemiddelforsøk [32]. NVP-BKM120 og LY294002 ble anvendt i kombinasjon med mTOR inhibitor, rapamycin. NVP-BEZ235 ble kombinert med erlotinib, på deres respektive enkelt medikament IC
50 eller IC
25 konsentrasjoner. IC
50 og IC
25 verdiene for hvert medikament ble først innhentet fra enkelt narkotika levedyktighet analyser og deretter brukt til å designe legemiddelkombinasjonen eksperimenter. Nivået av Synergismen ble bestemt over et bredt område av medikamentkonsentrasjoner, med fokus på konsentrasjoner under eller på IC
50 for noen av medikamentene alene. Våre resultater ble analysert for synergistisk, tilsetningsstoff, eller antagonistiske effekter ved hjelp CalcuSyn programvare (Biosoft, Ferguson, Missouri, USA). Synergistisk effekt er angitt med en kombinasjon Index (CI) på mindre enn 0,9, additiv effekt av en CI mellom 0,9 og 1,1, og antagonistisk effekt ved CI større enn 1,1.
Resultater
Uttrykk for PI3K P85 og p110á subenheter i humane lungekreft prøver
for MTMA, 166 og 190 eksemplarer var fullt assessable med hensyn til PI3K P85 og p110α subenhet uttrykk, henholdsvis. PI3K viste ikke signifikant nukleær farging for enten subenhet, og vi analyserte derfor bare cytoplasma rommet. Fargemønstre innen svulsten maske innenfor en histospot var svært homogen for begge underenhetene. AQUA score varierte 7,12 til 127,04 (gjennomsnitt, 37.68, median, 33,47) for P85 subenheten, og 5,43 til 138,56 (mener, 24.35, median, 20,26) for p110α subenheten. Et eksempel på AQUA farging av histospots for P85 og p110α ekspresjon er vist i Figur 1 og Tabell S2. Histospots ble ansett som un-tolkbare hvis de hadde utilstrekkelige kreftceller, tap av vev i stedet, eller en overflod av nekrotisk vev. Prøver med mindre enn 5% tumorområdet per sted ble ikke inkludert i AQUA analyse.
Anti-PI3K konjugert til Cy5 brukes til å måle PI3K subenhet nivåer (nederst til venstre kvadranter, forstørrelse × 10). Anti-cytokeratin konjugert til Cy3 brukes til å identifisere tumorceller innenfor den histospot (øverst til høyre kvadranter). Hullene er fylt i å skape en svulst maske (høyre nedre kvadranter). DAPI brukes til å identifisere kjerner (øverst til venstre kvadranter). Den kjernefysiske kammer inne i svulsten masken blir så subtrahert fra masken for å skape et cytoplasmatisk kammer (ikke vist). De riktige paneler er 40 × forstørrelser av PI3K P85 og p110α subenhet positiv og negativ farging, henholdsvis.
Vi har vurdert sammenhengen mellom PI3K subenhet uttrykk og histologisk subtype, med uparede t-tester. Uttrykk for både P85 og p110α underenhetene var signifikant høyere i adenokarsinomer enn i plateepitelkarsinom (
P
0,0001 for P85 og
P
= 0,0356 for p110α), som vist i Figur 2, panel A B.
Betydelig høyere uttrykk av PI3K P85 subenheten er sett i adenokarsinom svulster, i Moffitt Cancer Cohort og Yale University Cohort henholdsvis (panel A C). Betydelig høyere uttrykk av PI3K p110α subenheten i adenokarsinom tumorer er sett i Moffitt Cancer Cohort og Yale University Cohort, henholdsvis (Panel B D). Kaplan Meier-kurver som viser en sammenheng mellom PI3K subenhet uttrykk og redusert overlevelse for P85 (panel E), men ikke for p110α (Panel F).
For å bekrefte tilknytningen mellom PI3K underenheter og adenokarsinom, den YTMA ble benyttet. I motsetning til den MTMA som var hovedsakelig stadium I (A og B) lungekreft (92%), det YTMA inkluderte 55% fase I, og 45% stadium II-IV (17%, 19% og 9% fase II, III , IV henholdsvis) lungekreft. For YTMA PI3K P85 og p110α subenhet uttrykk var tolke for 163 og 168 eksemplarer, henholdsvis. AQUA score for denne kohorten varierte 4,18 til 120,73 (gjennomsnitt, 35,31, median, 32,70) for P85 subenheten, og 9,17 til 86,91 (mener, 38.12, median, 35,17) for p110α subenheten. Uparet t-test bekreftet funnene fra MTMA; uttrykk for P85 subenheten og p110α subenheten var betydelig høyere i adenokarsinomer enn i plateepitelkarsinom (
P
0,0002 for P85 og
P
= 0.0266 for p110α), som vist i Figur 2, panel C D. Høy P85 og p110α subenhet uttrykk korrelert med avansert sykdom stadium av sykdommen (
P
= 0,0075,
P
= 0,0093, henholdsvis), men ikke med alder og kjønn (ikke vist).
etter Cox univariat overlevelse analyser av kontinuerlige AQUA score, fant vi at høy P85 uttrykk korrelert med redusert overlevelse (
P
= 0,0198). AQUA gir kontinuerlig produksjon score, snarere enn kategorier av «høy» eller «lav», som bestemmes av patologer tolke standard immunhistokjemi. Å visualisere sammenhengen mellom kontinuerlige PI3K score og overlevelse, ble AQUA score dikotomisert ved medianen, som gjenspeiler bruken av rutine statistiske divisjoner i fravær av underliggende begrunnelse for delingen av uttrykk. Kaplan-Meier overlevelseskurver ble generert for PI3K P85 subenhet uttrykk og overlevelse og
P
-verdier ble innhentet av Mantel-Cox log-rank-metoden. Som vist i figur 2, panel E Vi studerte NVP-BKM-120, et klinisk kvalitet PI3K-inhibitor som er utviklet av Novartis, og LY294002, en kommersielt tilgjengelig forbindelse som har blitt mye brukt til å studere PI3K hemming i prekliniske omgivelser. Celler ble behandlet med enten NVP-BKM120 i konsentrasjoner fra 0,01 nM til 8200 nM eller LY294002 i konsentrasjoner varierende fra 6,4 nM til 20 000 nM. Alle forsøk ble utført in triplo. Etter 72 timers inkubasjon ble cellelevedyktigheten evaluert, og IC
50 ble beregnet for hver cellelinje, og i gjennomsnitt for gjentatte forsøk. Som vist i tabell 1, IC
50 for NVP-BKM120 og LY294002 hemming varierte fra 716 nM til 1265 nM og 4123 nM til 11 925 nM.
For å teste om veksthemming påført av NVP-BKM120 og LY294002 er bestemt eller i det minste forbedret i ondartet forhold til normale celler, vi brukte en immortalisert, ikke-transformert bronchoaveolar cellelinje, HBE135-E6E7. Disse cellene ble hentet fra normal bronkialepitelet tatt fra en mann som gjennomgår lobektomi for plateepitelkarsinom [33]. NVP-BKM120 og LY294002 hadde liten effekt på normale bronchoaveolar cellene ved konsentrasjoner ca 10 og 5 ganger gjennomsnittlig IC
50 av disse to stoffene, henholdsvis i NSCLC celler. 13% veksthemming ble sett ved 10 mikrometer NVP-BKM120 men en IC
50 kunne ikke nås ved høyere konsentrasjoner, og kun 25% veksthemming ble oppnådd med 50 mikrometer LY294002 behandling.
Gitt at uttrykket nivåer av narkotika mål noen ganger forutsi narkotika følsomhet, vi studert sammenhengen mellom graden av følsomhet /resistens mot NVP-BKM120 og LY294002 og PI3K nivåer. Vi vurderte de to PI3K underenheter og totalt og fosforylert AKT av immunoblotting. Ingen klar sammenheng ble funnet mellom nivåene før behandling av PI3K (P85 eller p110α) eller total og fosforylert AKT og følsomhet /resistens mot NVP-BKM120 eller LY294002 (figur S1).
Synergi mellom PI3K og mTOR-hemmere
Motstand mot PI3K hemming har blitt bemerket i ulike sykdommer og henføres til en rekke mekanismer. Konstituerende PI3K veien aktivisering kan resultere fra AKT aktivering av mTOR-C2 eller mTOR aktivering av MAP kinase pathway medlemmer tross bestemt PI3K narkotika hemming. På grunn av co-uttrykk mellom p110α og mTOR sett i våre kliniske prøver, studerte vi synergi mellom mTOR inbitor rapamycin og NVP-BKM120 og rapamycin og LY294002. Konsentrasjoner på 1000 og 500 nM av NVP-BKM120 ble kombinert med en rekke konsentrasjoner av rapamycin (1, 10 og 100 nM) i seks NSCLC-cellelinjer. Synergisme ble observert i fem av de seks cellelinjer ved alle konsentrasjoner av NVP-BKM120 med alle tre konsentrasjoner av rapamycin, og i det sjette cellelinje (H1650), ble synergi observert ved høyere konsentrasjoner av NVP-BKM120 (figur 3 og tabell S3 og S4). Vi studerte deretter synergisme mellom LY294002 og rapamycin. Konsentrasjoner av 5000 og 2500 nM av LY294002, ble kombinert med en rekke konsentrasjoner av rapamycin (1, 10 og 100 nM) i seks lungecellelinjer. Synergisme ble observert i alle seks cellelinjer ved alle konsentrasjoner av LY294002 med alle tre konsentrasjoner av rapamycin som er vist i Tabell S3. Figur 3 viser synergismen grafisk, ved hjelp av H2170 og SW900 som et eksempel. Spesielt, er forskjellene vist på levedyktighet ved å tilsette 1 nM, 10 nM og 100 nM rapamcyin var ganske like.
Celler ble behandlet med synkende nanomolare konsentrasjoner av PI3K inhibitor NVP-BKM120 eller LY294002, alene eller i kombinasjon med ett nM, 10 nM eller 100 nM rapamycin i 72 timer og levedyktigheten ble målt med Cell Titer Glo assay. Søylene viser levedyktighet som en prosent av levedyktige celler i forhold til ubehandlede celler. Tre separate eksperimenter ble utført og hver tilstand ble målt i tre replikere brønnene.
Aktivitet av en dual PI3K /mTOR-hemmer hos NSCLC cellelinjer
Gitt synergi sett mellom PI3K hemmere og rapamycin i lungekreftcellelinjer, en dobbel PI3K /mTOR-hemmer som har blitt gitt til pasienter med svulster i fase i kliniske studier, NVP-BEZ235, ble undersøkt. I alle seks lunge kreft cellelinjer IC
50s for NVP-BEZ235 sammensatte var i nM hold mens ingen effekt ble sett i HBE135-E6E7 celler, selv ved konsentrasjoner så høye som 1000 nM eller tjue ganger gjennomsnittlig IC
50 observert i NSCLC-cellelinjer (tabell 1). Disse resultatene tyder på at NSCLC vekst og overlevelse mediert av et bredt område av molekyl faktorer er selektivt følsomme for hemming av PI3K av NVP-BEZ235. Mål av NVP-BEZ235 (Pakt, pP70S6K og PS6) ble bestemt ved immunoblot analyse i celler med opptil 24 timer legemiddeleksponering. Ethvert medikament eksponering utover 24 timer resulterte i betydelig mengde døde celler og rusk og ville ha begrenset interpretability.
