Abstract
Drug distribusjon i cellene er et fundamentalt viktig, men ofte oversett, variabel i legemidlets effekt. Mange svakt basisk cytostatika akkumulere mye i de sure lysosomer av normale celler gjennom ion fangst. Lysosomal fangst reduserer aktiviteten av kreftmedisiner, siden kreft narkotika mål er ofte lokalisert i celle cytosol eller kjernen. Noen kreftceller har defekt forsuring av lysosomer, noe som fører til en omfordeling av fanget narkotika fra lysosomene til cytosol. Vi har tidligere etablert at slike forskjeller i legemiddel lokalisering mellom normale og kreftceller kan bidra til den tilsynelatende selektivitet av svakt basiske medikamenter til kreftceller
in vitro
. I dette arbeidet har vi testet hvorvidt denne intracellulære fordeling basert medikament selektivitet kunne optimaliseres basert på syre dissosiasjonskonstanten (pKa) av stoffet, som er en av de faktorer som bestemmer lysosomal bindingskapasitet. Vi syntetiserte syv svakt basiske strukturelle analoger av HSP90-inhibitor geldanamycin (GDA) med pKa-verdier i området fra 5 til 12. Selektiviteten av hver analog ble uttrykt ved å ta forhold av anti-proliferativ IC
50 verdier av inhibitorene i normale fibroblaster til IC
50-verdier i humane leukemiske HL-60-celler. Liknende selektivitet vurderinger ble utført i et par av kreftcellelinjer som var forskjellige i lysosomal pH-verdi som følge av siRNA-mediert endring av vacuolar proton-ATPase-subenhet uttrykk. Optimal selektivitet ble observert for analoger med pKa verdier nær 8. Lignende tendenser ble observert med kommersielle cytostatika med varierende svakt basiske pKa verdier. Disse evalueringene fremme vår forståelse av hvordan svakt grunnleggende egenskaper kan optimaliseres for å oppnå maksimal kreft narkotika selektivitet mot kreftceller med defekt lysosomal forsuring
in vitro
. Andre
in vivo
studier for å undersøke nytten av denne tilnærmingen for å øke selektiviteten
Citation. Ndolo RA, Luan Y, Duan S, Forrest ML, Krise JP (2012) Lysosomotropic Properties av svakt basisk cytostatika fremme Cancer Cell Selektivitet
In vitro
. PLoS ONE 7 (11): e49366. doi: 10,1371 /journal.pone.0049366
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: 1 juni 2012; Akseptert: 10. oktober 2012; Publisert: 07.11.2012
Copyright: © 2012 Ndolo et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Denne studien ble finansiert av NIH RO1 tilskuddet CA106655 (https://grants.nih.gov/grants/oer.htm). Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Mange anti-kreft narkotika lider av dårlig selektivitet å målrette celler, noe som fører til en høy grad av toksisitet og potensielt livstruende bivirkninger; Derfor er kjemoterapi ofte tidlig stoppet, noe som reduserer sjansene for et medikament å oppnå sitt fulle potensial. Anti-kreft medikamenter typisk ha en viss grad av iboende selektivitet mot kreftceller på grunn av biokjemiske og /eller metabolske forskjeller mellom normale og transformerte celler [1] – [3]. Den iboende selektiviteten av et anticancermiddel kan ytterligere forbedres ved hjelp av en rekke medikament leveringsfremgangsmåter basert på Ehrlich foreslåtte «magic bullet» [4], [5]. Alle disse målrettingsstrategiene deler et felles krav, som er at det aktive cytotoksiske middel, må akkumuleres i større grad i eller rundt transformerte celler i forhold til normale celler. Selv om mange kreative strategier har blitt undersøkt, for eksempel prodrug strategier og antistoff-medikamentkonjugater, har deres terapeutiske nytten er noe begrenset [6].
Den intracellulære fordeling av et medikament er et fundamentalt viktig faktor for legemidlets effekt. Pattedyrceller er mye oppdelt, og både narkotika og deres mål kan ha spesifikke og diskrete intracellulære lokaliseringsmønster. Følgelig, for den tilsiktede terapeutiske effekt som oppstår, det intracellulære området av medikament lokalisering må være den samme, til en viss grad, som for stoffet målet. Vi og andre har tidligere vist at fysisk-kjemiske egenskaper av medikamenter kan forutsigbart påvirke deres intracellulære lokalisering mønster [7] – [10]. I tillegg har vi vist at en enkelt medikament kan ha vesentlig forskjellige intracellulære lokalisering og menneskehandel mønstre i ulike celletyper [11], [12].
målrettet målretting av kreftmedisiner til intracellulære i kreftceller representerer et voksende område for leting [13], [14]. For eksempel, mitokondrier ha en negativ membranpotensialet i forbindelse med deres indre membran, som har vist seg å drive opphopning av legemidler med delokaliserte kationisk ladning [15]. I denne forbindelse er derivater av HSP90-inhibitorer blitt utviklet for å utnytte dette funnet og derfor selektivt målrette en mitokondriell form av HSP90 [16].
Alternativt kan mange svakt basiske medikamenter med lokaliserte kationiske ladninger har vist seg å være i stor utstrekning sekvestrert i sure lysosomer i celler gjennom et ion overlapping mekanisme, og egenskapene til cellen og medikament som påvirker denne er gjennomgått [17]. I korthet pH i lysosomene, i forhold til pH i cytosol, er en av de viktigste fysiologiske parametere som bestemmer den forutsagte graden av lysosomal akkumulering [12], [17]. Jo større lysosomet-til-cytosol pH-gradient, jo større er graden av lysosomal lagring er. For mange aminer har lysosomal trapping har vist seg å være ganske omfattende, og er antatt å approksimere den totale cellulære opphopning [18]. Ettersom stoffet mål er sjelden lokalisert i lysosomer, kan den omfattende fangst av svake baser i dette kammer i stor grad redusere pulsvekselvirkninger, og dermed redusere medikamentaktivitet.
Interessant, vi og andre har vist at flere kreftcelletyper har en lysosomal surgjøring defekt [19] – [22]. I noen tilfeller har det lysosomale pH av kreftceller blitt rapportert å være 2 pH-enheter høyere enn den lysosomale pH på normale celler [22]. Denne høyden i lysosomal pH er spådd å ha en betydelig innflytelse på den intracellulære fordeling av svakt basiske aminer som er substrater for ion fangst i lysosomer (lysosomotropic agenter). Nærmere bestemt, vil konsentrasjonen av slike stoffer reduseres i lysosomene i slike celler og øker samtidig i cytosol, så vel som i andre extralysosomal avdelinger. Vi foreslår at denne forskjellen i stoffet distribusjon oppførsel vil legge til rette for en forbedring i narkotika aktivitet i kreftceller i forhold til normale celler.
Vi har tidligere etablert grunnlag for intracellulær distribusjon-basert medikament (IDB) rettet mot plattformen ved hjelp av både
in vitro Hotell og
in vivo
nærmer [12], [23], [24]. Ved hjelp av celler dyrket i kultur, vi målt kvantitativt de lysosome-til-cytosol konsentrasjonsforhold av legemidler i celler med lav eller forhøyet lysosomal pH. Svakt basisk kreft narkotika ble vist å omfordele fra lysosomene til cytosol når lysosomal pH ble forhøyet. Dette intracellulær omfordeling av narkotika resulterte i mer uttalt cytotoksisitet mot celler med forhøyet lysosomal pH. Viktigere, slike endringer i intracellulær distribusjon og toksisitet ble ikke observert for kreft narkotika uten lysosomotropic egenskaper. Mer nylig etablerte vi grunnlaget for IDB målretting plattformen i mus ved å evaluere graden av legemiddelindusert toksisitet hos mus med lav eller eksperimentelt forhøyet lysosomal pH [24].
I denne rapporten har vi spesifikt spørsmål ved om lysosomotropic potensialet av en kreft legemiddel korrelert med graden av IDB selektivitet. Dette er en svært viktig faktor som kan lede rasjonell design av nye kreftlegemidler med egenskaper som optimaliserer lysosomotropism og derfor IDB selektivitet, eller endring av eksisterende legemidler for å formidle disse egenskapene.
Resultater
utvalg og syntese av analoger av geldanamycin med en rekke svakt basiske pKa verdier
Vi har tidligere vist at svakt basiske legemidler mot kreft med lysosomotropic egenskaper viser større selektivitet mot kreftceller enn gjøre sine ikke-lysosomotropic kolleger [12]. I dette arbeidet har vi testet prediksjon at lysosomotropic potensialet i svakt basiske stoffer korrelerer med deres grad av differensial selektivitet mot kreftceller.
I ta opp dette spørsmålet, vi har vurdert at legemiddelassosiert faktorer som er kjent for å bidra til lysosomotropism. Alle underlag for ion fangst baserte lysosomotropism er svakt basisk, men ikke alle svakt basiske molekyler er lysosomotropic. I sin kommentar om emnet, de Duve foreslått at to uavhengige legemiddelassosiert egenskapene påvirker lysosomotropic potensialet i et gitt legemiddel. Den første parameteren kalles alfa og representerer lysosomal membran permeabilitet ratio for stoffet i sin ionisert versus organiserte former. Vi har tidligere eksperimentelt beregnet alfa for et antall forbindelser ved å måle oktanol /buffer-fordelingskoeffisienter som en funksjon av pH og korreleres disse verdiene med lysosomale deponering [7]. Den andre viktige parameteren legemiddel-assosiert er pKa til den konjugerte syren av basen. Vi har tidligere eksperimentelt etablert hvordan pKa av narkotika påvirke lysosomal lagring i dyrkede celler [8].
I dette arbeidet, valgte vi å evaluere påvirkning av pKa på selektivitet ved hjelp hemmere av 0 kD heat shock protein (HSP90 ) som systematisk variert i deres svak base pKa. Vi valgte å endre 17-posisjonen til HSP90 inhibitor GDA å lage derivater med variert pKa siden tidligere rapporter har vist at endringer i denne posisjonen ikke endre aktivitet [25].
For å hjelpe vårt utvalg av derivater med varierende pKa, vi betraktet som en tidligere beskrevet teoretisk forhold mellom svak base pKa og alfa på lysosomet-til-ekstracellulære konsentrasjonsforholdet [17], som er gitt ved det følgende uttrykk.
konjugerte syre av svak base dissosiasjonskonstant betegnes som K
a, betegner og [H
+] protonkonsentrasjonen (senket E representerer ekstracellulære og senket L står lysosomal). Uttrykket alfa (α) angir forholdet mellom lysosomale membran permeabiliteter for den ioniserte basen dividert med det av de un-ioniserte arter [26]. Ved hjelp av denne ligning, beregnet vi teoretisk lysosomet-til-ekstracellulære konsentrasjonsforhold på en rekke legemidler med pKa-verdier i området fra 4 til 14. For beregningene, vi brukte lysosomal og ekstracellulære pH-verdier på 4,4 og 7,4, respektivt, som er typisk verdier for normale celler [27], og en alfa-verdi på 0,01, som vi tidligere hadde, målt i 17-DMAG, en svakt basisk derivat av GDA [12]. For å demonstrere potensialet påvirkning av alfa på lysosomal lagring, har vi inkludert tomter som denne parameteren er variert. Plotting av de forutsagte lysosom-til-ekstracellulære konsentrasjonsforholdet mot pKa ga en klokkeformet kurve, hvorved den maksimale grad av lysosomale lagring og hvis pKa-verdi ved hvilken dette skjedde var følsomme for størrelsen av a-parameteren (se figur 1). Basert på disse simuleringene, postulerte vi at anticancermidler som varierer i pKa-verdi fra ca 5 til 12 vil tilstrekkelig karakter påvirkning av lysosomale binding på tumor selektivitet.
ligning anvendt for disse simuleringer kan bli funnet i teksten. PH i lysosomer og ekstracellulære rom ble innstilt på 4,4 og 7,4, respektivt. Alfa parameter ble variert som angitt.
Vi syntetisert derfor en rekke svakt basiske analoger av GDA i et forsøk på å utvikle for lite sett av derivater som hadde pKa-verdier som strekker seg over dette området. GDA derivatene ble syntetisert som beskrevet i Materialer og Metoder, og kjennetegnes ved
1H-NMR (se tekst S1). PKa-verdiene for analogene 1, 2, 3, 5 og 6 (se figur 2 for kjemiske strukturer) ble målt ved 37 ° C ved hjelp av
1 H NMR. For å bestemme pKa ved hjelp av denne fremgangsmåte ble de kjemiske skift av protoner alfa til aminet ioniserbare plottet mot pH-verdi, noe som ga sigmoidale kurver (figur S1) fra hvilken pKa ble avledet. For forbindelser 4 og 7, kunne pKa ikke måles ved
1H NMR enten på grunn av begrenset løselighet i D
2o og /eller dårlig løst protontopper. Derfor rapporterer vi en tidligere målt pKa verdien for forbindelsen 4 som ble anskaffet ved hjelp av en alternativ tilnærming [12], og vi rapporterer en beregnet verdi for sammensatte 7 (se Materialer og metoder). Forbindelse 5 hadde to pKa-verdier på 9,9 og 4,2. Bare den høyere pKa-verdien er rapportert i figur 2, fordi den andre er for lav for teoretisk å bidra til å ion overlapping i lysosomer. Kollektivt, er pKa-verdier for hvert av derivatene varierte 5,8 til 12,4 (figur 2).
De syv derivater med forskjellige svak Basemodifikasjoner ved 17-stillingen av GDA er vist. PKa-verdiene for derivater 1, 2, 3, 5 og 6 ble målt eksperimentelt ved hjelp av proton-NMR (n = 1). PKa for forbindelsen 4 ble målt eksperimentelt i en tidligere manuskript (se resultater). PKa for forbindelsen 7 ble beregnet ved hjelp av programvare (se Materialer og metoder). Bindingen affinitet for hver av hemmere med rHsp90 vises (n = 2), og var basert på en tidligere etablert fluorescens polarisering analysen (se Materialer og metoder).
For å riktig teste påvirkning av svak base pKa på selektivitet, alle derivater av GDA bør beholde en viss kapasitet til å binde HSP90 og virker som inhibitorer. For å vurdere dette, vurderte vi bindingsaffiniteten av hver av derivatene til rekombinant HSP90 og sammenlignet bindingsaffinitet med den til umodifisert GDA. Bindingsaffiniteter ble estimert ved anvendelse av en fluorescens-polarisasjon metode som måler evnen av testforbindelser til kompetitivt å fortrenge FITC-konjugert GDA fra HSP90. Polariseringen (MP) verdiene ble omregnet til prosent av kontroll (intet medikament) og plottet mot konsentrasjonen av testforbindelser, noe som ga sigmoidale kurver fra hvilke IC
50 verdien ble bestemt ved kurvetilpasning (fig S2). K
i-verdiene ble beregnet fra IC
50-verdier som tidligere beskrevet [28] ved hjelp av en elektronisk kalkulator (fritt tilgjengelig på https://sw16.im.med.umich.edu/software/calc_ki/). Den beregnede IC
50 for underivatized GDA var 230 nM, som er lik den tidligere rapporterte verdier ble oppnådd ved bruk av denne analyse [29]. En sammenligning av Ki-verdiene for GDA og dets derivater tyder på at de alle beholde en viss kapasitet til å binde HSP90, og er derfor egnet for de vurderinger som er beskrevet her (Figur 2).
Bestemmelse av intracellulær fordeling baserte selektivitet
For å kvantitativt uttrykke selektivitet, vi forhold evaluert antiproliferative IC
50 verdier i normale celler og kreftceller som hadde lav og forhøyet lysosomal pH, henholdsvis. For disse vurderingene, vi utnyttet HL60 human leukemicellelinje, som vi tidligere har vist seg å ha en forhøyet lysosomal pH [22]. For de ikke-transformerte celler, benyttet vi normale humane forhud-fibroblaster som tidligere hadde vist seg å ha en lysosomal pH-verdi på 4,4 [22]. Cytotoksisiteten kurver og IC
50-verdier oppnås fra disse er vist i fig S3. Ved å dele IC
50 bestemt i normale celler ved IC
50 i kreftceller, erholdt vi den totale selektivitet (figur 3). Den ikke-lysosomotropic inhibitor GDA hadde en total selektivitet nær to, noe som indikerer at GDA var nesten dobbelt så aktiv i leukemicellelinje som det var i den normale celler. Interessant, svakt basiske inhibitorer med pKa-verdier i nærheten av 8 hadde flere ganger større aktivitet i de leukemiske celler med forhøyet lysosomal pH sammenlignet med normale celler. Analoger av GDA som hadde pKa-verdier langt over eller under 8 hadde ingen tydelig økning i selektivitet mot kreftcellene i forhold til underivatized GDA. I det hele tatt, påvirkning av pKa på selektivitet tendens til å gi en klokkeformet fordeling som var lik den teoretiske plottet samkjøre pKa med lysosomotropism (figur 1).
Totalt selektivitet representerer IC
50 for et derivat i normale humane fibroblaster dividert med produktet oppnådd i HL60 humane leukemiceller verdi. Barer representerer gjennomsnitt ± s.d. (N = 3); *,
p
. 0,05 sammenlignet med GDA
Selektivitet er multifaktoriell, og noen vellykkede kreftmedisinen bør utvise større aktivitet mot kreftceller i forhold til normale celler gjennom mekanismer som ikke er relatert til endringer i intracellulær fordeling oppførsel som er evaluert i dette manuskriptet [2], [3]. For direkte å undersøke selektiviteten som kan spesifikt tilskrives endringer i intracellulær fordeling oppførsel mellom normale og transformerte celler, betraktet vi det nødvendig å sammenlikne den antiproliferative aktivitet av et gitt medikament i to cellelinjer som ellers er identiske, men har lav (normal) og forhøyet (kreft-aktig) lysosomal pH. Denne fremgangsmåten ville være mest ønskelig fordi noen inter-celle variasjon i faktorer som kan påvirke legemiddel-aktivitet (for eksempel ekspresjon av medikament efflux transportører) ville bli dempet.
Selv om mange cancercellelinjer som er blitt vist å ha defekt forsuring Lysosomers, fant vi at en rekke av dem å opprettholde normalt forsurede lysosomer. For eksempel, opprettholder bryst adenocarcinoma celle MDA-MB-231 linjen en lysosomal pH-verdi på 4,2, tilsvarende den lysosomale pH i de fleste normale celler [27]. Ved hjelp av denne cellelinje, utforsket vi en siRNA tilnærming til forbigående heve lysosomal pH. Lysosomal pH reguleres av vacuolar proton-ATPase (VH
+ – ATPase) [30], og Lu og medarbeidere har tidligere vist at å redusere ekspresjon av en subenhet av dette enzymet, ved hjelp av siRNA, ga celler med endrede v-ATPase proton pumpe aktivitet, med ingen virkning på celleformering [31]. Vi utnyttet en lignende teknikk for å lage MDA-MB-231 celler med forhøyet lysosomal pH. Spesielt rettet vi V1E1 subenheten av V-ATPase for knockdown hjelp lentiviral vektor shRNA. Den lentiviral-mediert overføring ble valgt fordi denne tilnærmingen åpner for effektiv, høy gjennomstrømming og stabil knockdown av target proteiner [30]. MDA-MB-231-celler som ble behandlet med lentiviral partikler inneholdende ikke-target (kryptert) sekvens shRNA beholdt lav lysosomale pH og tjente som en viktig kontroll for alle ikke-spesifikke virkninger av lentiviral infeksjon på cellenes levedyktighet. Knockdown av V1E1 ekspresjon i celler som mottar pulsviruspartiklene ble bekreftet ved hjelp av Western blot-analyse (figur 4A). Viktigere, knockdown av V1E1 subenheten førte til ingen merkbar effekt på veksten av cellene i løpet av tidsforløpet av IC
50 evalueringer (figur 4B). Eksperimentell evaluering av lysosomal pH etter banket ned V-H
+ – ATPase subenheten viste at lysosomal pH ble signifikant forhøyet fra pH 4,4 til pH 5,8 (Figur 4A)
A.. Western blot-analyse av den V1E1 subenheten uttrykket er vist sammen med aktin lasting kontroll. Eksperimentelt bestemte lysosomale pH-verdier i ubehandlet, egge shRNA- og V1E1 shRNA-behandlede celler er vist (verdiene representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3) B. V-ATPase subenheten knockdown endrer ikke veksten av MDA-MB 231 celler . De fylte sirklene representerer celler behandlet med egge shRNA vektor og de åpne sirkler representerer celler behandlet med V-ATPase V1E1 shRNA. Celler ble sådd ut i en tetthet på 3 x 10
5-celler /brønn på en 6-brønns plate og ble trypsinert, tellet og på ny sådd ut hver 24. time i 3 dager (datapunkter representerer gjennomsnitt ± SD, n = 3).
Vi har evaluert senere IC
50 av HSP90-hemmere i begge celletyper (figur S4) og beregnet selektivitet som IC
50 i MDA-MB-231 celler med lav lysosomal pH dividert med IC
50 i MDA-MB-231 celler med forhøyet lysosomal pH. I samsvar med våre forventninger, ble aktiviteten av ikke-lysosomotropic GDA ikke påvirket av lysosomal pH-status av cellen og derfor hadde ingen åpenbar IDB selektivitet (dvs. IDB selektivitet verdi i nærheten av en, se figur 5). Utviklingen i IDB selektivitet som en funksjon av HSP90-inhibitor pKa fulgt en lignende klokke-formet profil som gjorde total selektivitet resultater som er vist i figur 3. Videre er sammenligninger av størrelsen av den IDB med total selektivitet antyder at IDB selektivitet er en viktig medvirkende faktor for den samlede selektiviteten av disse midler.
IDB selektivitet er definert som IC
50 in MD-MB-231-celler behandlet med egge shRNA, som har lav lysosomal pH, dividert med den oppnådd fra verdien den samme cellelinje behandlet med shRNA mot V1E1 subenhet av vacuolar proton-ATPase, som har forhøyede lysosomal pH. Barer representerer gjennomsnitt ± s.d. (N = 3); *,
p
. 0,05 sammenlignet med GDA
Våre tidligere resultater er konsistente med den oppfatningen at HSP90-hemmere med optimale lysosomotropic egenskaper (dvs. pKa-verdier nær 8) vil ha størst grad av IDB selektivitet mot transformerte celler. For ytterligere å vurdere dette, vurderte vi IDB selektivitet av ekstra klasser av legemidler mot kreft som gjør eller ikke besitter lysosomotropic egenskaper.
Mitoxantrone og daunorubicin er svakt basiske legemidler mot kreft som har kjernefysiske mål og pKa verdier nær 8 [32 ], som skal fremme lysosomotropism og IDB selektivitet. Alternativt er det antimetabolitt 5-fluorouracil svakt syrlig, med en pKa av 8 [33], og er således ikke anses som et substrat for ion fangst i sure lysosomer. 5-Fluorouracil bør derfor heller ikke ha intracellulær fordeling eller aktivitet som er påvirket av den lysosomale pH-status av en celle. Tilsvarende anticancermidler som er zwitterioniske, sammen med både svakt sure og svakt basiske grupper, for eksempel klorambucil [34], er ikke lysosomotropic og bør ikke oppvise IDB selektivitet. I samsvar med vår argumentasjon, ikke-lysosomotropic cytostatika 5-fluorouracil og klorambucil hadde IDB selektivitet verdier nær en, i likhet med GDA (figur 6). Alternativt kan de lysosomotropic midler mitoksantron og daunorubicin begge viste signifikante men forskjellig grad av selektivitet IDB (figur 6). De cytotoksiske kurvene for disse vurderingene er vist i figur S5.
Mitoxantrone og daunorubicin er svakt basisk med pKa verdier nærheten 8 og har betydelig IDB selektivitet. Ikke-lysosomotropic anticancermidler 5-fluorouracil og klorambucil ha IDBs selektivitetsverdier i nærheten av en, noe som viser at deres aktivitet ikke påvirkes av lysosomal pH. Barer representerer gjennomsnitt ± s.d. (N = 3).
Diskusjoner
I denne studien har vi, for første gang, systematisk undersøkt hvordan pKa av svakt basiske midler mot kreft påvirker graden av IDB selektivitet mot kreftceller med forhøyet lysosomal pH. Vi foreslår at IDB legemiddelmålretting plattform presenterer et paradigmeskifte i tilnærmingen med å designe nye kreftlegemidler med forbedret og optimalisert selektivitet mot kreftceller. Tradisjonelle SAR tilnærminger for å øke selektiviteten fokuserer hovedsakelig på å utforme medikamenter med høyere potens mot kreftceller, med lite oppmerksomhet til aktiviteten av legemidlet i normale celler. De fleste medikamentleveringsbaserte tilnærminger som forsøker å øke selektiviteten stole på tumorspesifikt medikament akkumulering /levering, noe som har vist seg å være ganske krevende og vanskelig å oppnå. IDB legemiddelmålretting tilnærmingen som er beskrevet her gjør at stoffet skal fordele likt både for normale og transformerte celler; imidlertid stoffet terapeutisk indeks økte med målbevisst utforme stoffet for å ha ugunstige intracellulære distribusjons eiendommer i normale celler, og dermed redusere narkotika aktivitet i disse cellene.
Vår tidligere studie hadde etablert at lysosomotropic molekyler hadde målbar IDB selektivitet, men den forble uklart om graden av lysosomotropism korrelert med graden av IDB selektivitet. Vår hypotese som fører inn i denne studien var at cytostatika med optimale lysosomotropic egenskaper ville ha optimal IDB selektivitet. Vi først brukt ion fangst prinsipper for teoretisk å etablere relasjonene mellom svak base av legemidler, spesielt permeabilitet (alfa) og pKa, og lysosomal beslaglegging (se figur 1). Disse beregningene ble avslørende og foreslo at svakt basiske molekyler med lav alfa og pKa nær eller over nøytralitet ville ha optimale lysosomotropic egenskaper
Våre teoretiske forutsigelser viser at alfa permeabilitet parameter representerer en viktig prediktor for lysosomal lagring.; Det er imidlertid ikke en fysisk parameter som kan være rasjonelt og systematisk endret for å teste forholdet mellom lysosomotropism og IDB selektivitet. Vi har tidligere eksperimentelt anslått ved å måle a-oktanol /vann fordelingskoeffisienter som en funksjon av pH og funnet at molekyler som enten hadde en tendens til å ha alfa-parametere i nærheten av null eller i nærheten av en [7]. Selv om alfa kan variere fra null til en, våre teoretiske forutsigelser viste at forholdsvis små endringer i verdiene av alfa nær null hadde en dyp innvirkning på forholdet mellom svak base pKa-verdi og størrelsen av lysosomale beslaglegging (figur 1). Det er foreløpig uklart hva strukturelle egenskaper kan være ansvarlig for slike mindre forstyrrelser i alpha parameter (dvs. 0,01 versus 0,001).
I motsetning til alfa parameter, pKa representerer en fysisk egenskap som kan rasjonelt endret for å teste forholdet mellom lysosomotropism og selektivitet. Å systematisk undersøke innflytelsen av svak base pKa-verdi på IDB selektivitet, vi syntetisert et lite bibliotek av analoger av GDA som genereres ved å endre GDA ved 17-stillingen. Disse GDA analogene var spesielt godt egnet for en slik anvendelse, fordi tallrike analoger som er dannet av syntetiske modifikasjoner i denne posisjon har vist seg å beholde sin evne til å binde til og inhibere HSP90 [25]. I tillegg har GDA en cytosolisk målet, og derfor bør aktiviteten av GDA analoger være sensitive overfor endringer i lysosomal håndtering. Vi syntetiserte svakt basiske analoger av GDA med pKa-verdier som varierte 5,8 til 12,4, og vi har observert at de alt syntes å beholde en viss kapasitet til å binde rHsp90 som umodifisert GDA (figur 2). Det er viktig å merke seg at forskjeller i egen HSP90 bindingsaffinitet mellom de forskjellige derivater kan faktisk innvirke på styrken av et eksperimentelt observerte IC
50 verdi i en enkelt cellelinje; men disse forskjellene bør ikke teoretisk påvirke våre selektivitet sammenligninger som er presentert i figurene 3 og 5. Dette er fordi vi rapporterer forholdet mellom IC
50-verdier for en enkelt medikament i celler med lav eller forhøyet lysosomal pH-verdi, og dermed å faktorisere ut eventuelle forskjeller i indre aktivitet som kan være til stede.
bruk av shRNA å lage varianter av MDA-MB-231 cellelinjer som skilte seg i lysosomal pH representerer et verdifullt verktøy for å teste direkte IDB selektivitet. I vår tidligere publiserte evalueringer, benyttet vi sammen IC
50 evalueringer i to forskjellige cellelinjer med lav eller forhøyet lysosomal pH [12]. I tillegg, benyttet vi en farmakologisk modulator av lysosomal pH (dvs. ammoniumklorid) for å oppnå lysosomal pH høyde. Begge disse metoder har begrensninger fordi forskjellene i cytotoksisitet kunne tilskrives forskjeller i cellelinjer eller til tilsetningen av den pH-modifiserende middel og ikke spesifikt til forskjellene i lysosomal pH.
GDA analog med en følsom pKa-verdi på 8,1 ble funnet å ha en maksimal grad av IDB selektivitet. GDA analoger med pKa verdier godt over eller under 8 viste minimal selektivitet, som er konsistent med forestillingen om at lysosomotropic potensielle korrelerer med IDB selektivitet. For å vurdere den totale selektiviteten til GDA analogene sammenlignet vi forholdet mellom IC
50-verdier i normale fibroblaster versus i HL-60-leukemiske celler, som har vist seg å ha forhøyede lysosomal pH [22]. Interessant, utviklingen i den totale selektivitet av GDA analoger var lik i utseende og størrelse med IDB selektivitet resultater. Dette funnet tyder på at IDB selektivitet kan representere en viktig medvirkende faktor mot total selektivitet.
For å ytterligere evaluere påvirkning av lysosomotropism på IDB selektivitet, vi undersøkt sammenhengen ved hjelp av tilgjengelige legemidler mot kreft som hadde ulike strukturer, intracellulære mål og virkningsmekanismer fra de i de tidligere evaluerte HSP90-inhibitorer (figur 5). I samsvar med vår hypotese, gjorde den ikke-lysosomotropic cytostatika 5-fluorouracil og klorambucil ikke vise nevneverdig IDB selektivitet. I motsetning til dette ble svakt basiske anticancermidler med pKa-verdier i nærheten av 8 funnet å ha IDB selektivitet. Spesielt, den svakt basiske medikamenter mitoksantron og daunorubicin, som har pKa-verdier på 8,1 og 8,4, respektivt, ble begge funnet å ha betydelige grader av IDB selektivitet. Det er interessant å merke seg at daunorubicin hadde en betydelig høyere IDB selektivitet enn gjorde mitoxantrone. Dette kan tilskrives det faktum at pKa av daunorubicin er litt høyere enn pKa for mitoksantron, og at forholdsvis små endringer i pKa-verdi kan føre til ganske betydelige økninger i IDB selektivitet. Det er også sannsynlig at det kan være små variasjoner i alfa permeabilitet parameter for disse to forbindelser som kan føre til dramatiske endringer i lysosomotropism som ble teoretisk bestemt (figur 1). I tillegg til disse stoffene, kan tallrike andre klinisk godkjente anticancermidler bli klassifisert som svakt basisk molekyler. Så vidt vi vet, er det foreløpig ingen kliniske bevis som støtter tanken om at deres svakt grunnleggende egenskaper bidrar til deres observert selektivitet.
Det er viktig å understreke at IDB legemiddelmålretting plattform beskrevet her ikke vil være universelt gjeldende for alle krefttyper. En åpenbar forutsetning for vellykket bruk er at kreftcellene har en lysosomal forsuring defekt. Vi og andre har vist at mange forskjellige cancercelletyper har defekt lysosomal pH [19] – [22]; imidlertid, som vi har illustrert i dette manuskriptet, noen kreftceller, slik som MBA-MB-231-cellelinjen, har lysosomale pH-verdier som er lik de i normale celler.
