Abstract
fotoreseptoren celle-spesifikk reseptor (PNR /NR2E3 ) er en foreldreløs kjernefysisk reseptor som spiller en avgjørende rolle i retinal utvikling og fotoreseptoren vedlikehold. Sykdomsfremkallende mutasjoner i PNR har en pleiotropisk effekt resulterer i varierende netthinnesykdommer. Nylig, PNR har vært innblandet i kontrollen av cellefunksjoner i kreftceller. PNR ble rapportert å være en ny regulator av ERα ekspresjon i brystkreftceller, og høy ekspresjon PNR korrelerer med positiv respons til tamoxifen behandling. Videre PNR ble vist å øke p53 stabilitet i HeLa-celler, noe som tyder på at PNR kan være et terapeutisk mål i dette og andre krefttyper som beholder en vill-type p53-genet. For å lette ytterligere forståelse av PNR funksjoner i kreft, karakterisert vi forbindelse 11a, et syntetisk, antatt PNR agonist i en rekke cellebaserte analyser. Interessant, viste vi at 11a ikke klarte å aktivere PNR og dens cytotoksisitet var uavhengig av PNR uttrykk, med unntak av PNR som megler for 11a cytotoksisitet. Systematiske analyser av de cytotoksiske effektene av 11a i NCI-60-cellelinjer viste en sterk positiv korrelasjon av cytotoksisitet med p53 status, det vil si p53 villtype-cellelinjer var signifikant mer følsomme overfor 11a enn p53 mutert eller null-cellelinjer. Videre, ved hjelp HCT116 p53 + /+ og p53 – /- isogene cellelinjer avdekket vi at virkningsmekanismen av 11a-indusert cytotoksisitet forekom gjennom G
1 /S-fasen cellesyklus-stans i stedet for apoptose. I konklusjonen, observerte vi en korrelasjon på 11a følsomhet med p53 status, men ikke med PNR uttrykk, noe som tyder på at svulster som uttrykker villtype p53 kan være lydhør overfor denne forbindelsen
Citation. Zhao Z Wang L, Wen Z, Ayaz-Guner S, Wang Y, Ahlquist P, et al. (2013) Systematisk Analyser av den cytotoksiske effekten av Forbindelse 11a, en antatt Syntetisk Agonist av fotoreseptoren-Specific Nuclear Receptor (PNR), i Cancer Cell Lines. PLoS ONE 8 (9): e75198. doi: 10,1371 /journal.pone.0075198
Redaktør: Eric Xu, Van Andel Research Institute, USA
mottatt: May 14, 2013; Akseptert: 11. august 2013, Publisert: 16.09.2013
Copyright: © 2013 Zhao et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet er støttet av National Institutes of Health CA125387 til WX, NIH gi CA22443 til PA og DOD ERA av HOPE Scholar Award W81XWYH-11-1-0237 til WX. PA er en detektiv fra Howard Hughes Medical Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Nuclear hormonreseptorer regulere en rekke essensielle biologiske prosesser, inkludert utvikling, differensiering og celleoverlevelse [1-3]. Deres aktiviteter og uttrykk nivåer er strengt kontrollert, og feilregulering av kjernereseptorer (NRS) og deres coregulators er involvert i metabolske sykdommer og kreftutvikling [4-6]. NRS den nest største familien av proteiner som er rettet av legemidler [7]. Av de 48 nukleære reseptorer som er identifisert i mennesker, omtrent halvparten er godt karakterisert med kjente naturlige ligander. De resterende NRS såkalte foreldreløse kjernereseptorer fordi deres fysiologiske ligander forbli ukjent. Til tross for at ingen naturlige ligander kan foreldreløs kjernereseptorer være målrettet med syntetiske ligander for behandling av menneskelige sykdommer, f.eks syntetisk ROR og LRH-1 agonister ble brukt til å behandle metabolske og autoimmune sykdommer [8]. Fluorescent polarisering analyser, forsterket selvlysende nærhet homogen (ALPHAScreen) analyser, og tids løst fluorescens energioverføring (TR-Fert) analyser har blitt utviklet så høy gjennomstrømming screening (HTS) tilnærminger for å identifisere forbindelser som er rettet mot kjernereseptorer for terapeutiske formål [9- 12].
NR2E3 /PNR er en foreldreløs kjernefysisk reseptor som er sterkt uttrykt i netthinnens celler [13] og beskjedent uttrykt i prostata og livmor vev [14,15]. PNR aktiverer stang-spesifikk genekspresjon og undertrykker kjegle-spesifikk genekspresjon ved å nedregulere cyclin D1 og TBX2 [16-20]. Dette genet regulering mønster definerer den doble rollen PNR i formidling utvikling og vedlikehold av fotoreseptorene [21]. Mutasjoner i PNR har blitt funnet i forskjellige retinale sykdommer, innbefattet forbedret S-kjegle-syndrom, autosomal dominant og recessive former retinitis pigmentosa, Goldmann-Favre syndrom, og klumpet seg pigment retinal degenerasjon [22-27]. Emerging bevis tyder på at PNR kan ha viktige funksjoner i kreftcellene ved å regulere p53 stabilitet og østrogen reseptor alfa (ERα) uttrykk. I HeLa og HCT116 p53-positiv kreft-cellelinjer, stabiliserer PNR p53 ved acetylering og induserer apoptose [28]. I de ERα-positive brystkreftcellelinjer MCF7 og T47D, regulerer PNR ERα ved direkte binding til ERα promoter-regionen, for derved å øke ERα genekspresjon [29]. Uttrykket av PNR er også signifikant assosiert med tilbakefall overlevelse og gunstig tamoxifen respons i ERα-positive, node negative brystkreftpasienter [29]. Disse studiene antyder at PNR kan være et terapeutisk mål for netthinnesykdommer, kreft beholder en villtype p53-genet, og ERα-positive brystkreft.
PNR-spesifikke agonister, enten naturlige eller syntetiske, har blitt identifisert ved hjelp av høy gjennomstrømming screeningsanalyser. Fordi apo-PNR er blitt vist å interagere med co-repressorer N-COR, SMRT, og RetCoR [20,30], den syntetiske PNR agonist Forbindelse 11a ble identifisert ved hjelp av en GAL4 DNA-bindende domene-PNR ligandbindende domene fusjons β-laktamase trans analysen og NCOR utgivelsen analyse [30,31]. Selv 11a ble testet i cellebaserte assayer for agonistiske effekter på PNR og ble vist å ha lav toksisitet hos kontrollcellelinjer, og 11a ikke blitt vist å binde direkte PNR. Snarere tyder nyere bevis på at 11a er usannsynlig å være en direkte PNR agonist [32]. Vårt resultat er enig med dette senere konklusjonen. Som PNR ble nylig innblandet i ERα positiv brystkreft og vist å regulere p53 stabilitet, kan denne forbindelsen har terapeutisk anvendelse. Men systematisk evaluering av sammensatte cytotoksisitet manglet, og de cellulære målene for 11a ennå ikke er definert. I denne studien evaluerte vi systematisk de cytotoksiske effektene av 11a i NCI-60-cellelinjer [33] og funnet at 11a cytotoksisitet er uavhengig av PNR uttrykk men positivt korrelerer med p53 status, med høyere følsomhet i p53 villtype-cellelinjer enn p53 null /mutante cellelinjer. Bruke HCT116 p53 + /+ og p53 – /-. Isogene cellelinjer, demonstrerte vi at de cytotoksiske effektene av 11a i stor grad et resultat av p53-indusert G
1 /S fase cellesyklus arrest, med mindre bidrag fra apoptose
Materialer og metoder
Cell kultur og 11a behandling
LM2 cellelinjen var en slags gave fra Dr. Joan Massagué [34]. De HCT116 isogene cellelinjer var en slags gave fra Dr. B. Vogel [35]. Alle andre cellelinjer ble kjøpt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). Den HEK293T, MCF7, MDA-MB-231, LM2, MDA-MB-468, SKOV3, og HCT116 isogene cellelinjer ble opprettholdt i Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) (Gibco, Gaithersburg, MD) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Gibco) ved 37 ° C med 5% CO
2. A2780 og OVCAR3 eggstokkkreftcellelinjer ble holdt i RPMI-1640 (Gibco) supplementert med 10% FBS. Den T47D brystcancer-cellelinjen ble opprettholdt i DMEM /F12 (Gibco) supplementert med 10% FBS. Forbindelse 11a ble kjøpt fra Pharmabridge Inc. (Pennsylvania Bioteknologisenteret, Doylestown, PA). Den 11a pulver ble først oppløst i etanol og deretter i dimetylsulfoksyd (DMSO) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) til en sluttkonsentrasjon på 8 mm. Asynkrone celler ble sådd i 24 timer før behandling med 11a, slik at cellene var tilnærmet 50% -60% sammenflytende ved tilsetning 11a. Den endelige konsentrasjonen av 11a i nM – uM spekter ble oppnådd ved å fortynne 11a i friskt medium, og 0,1% DMSO ble anvendt som kontroll for hvert eksperiment. All-trans retinsyre, doksorubicin, etoposid, staurosporin og 3-aminobenzamid ble innkjøpt fra Sigma (St. Louis, MO).
For cellesyklusanalyse, ble cellene i serum-sultet i 24 timer for å oppnå G
0 synkronisering. Cellene ble deretter lov til å gå inn i cellesyklus ved å supplere med DMEM pluss 10% FBS som inneholder de angitte konsentrasjoner av 11a.
Retrovirus emballasje, infeksjon og stabil cellelinje generasjon
Emballasjen plasmider PME-VSVG, pHIT60 og pLNCX ble kjøpt fra OpenBiosystems (Huntsville, AL). Retrovirus ble pakket i HEK293T celler transfektert med 3,8 mikrogram PME-VSVG, 1,4 mikrogram pHIT60 og 3,8 mikrogram pLNCX-GFP eller pLNCX-PNR bruker transitt-LT1 reagens (Mirus Bio) i henhold til produsentens instruksjoner. Seks timer etter transfeksjon, ble mediet endret. Viruspartiklene ble deretter høstet 24 48 timer senere ved hjelp av et 0,45 um sprøytefilter (Thermo Scientific).
For å infisere cellene med retrovirus, virus ble blandet med et like stort volum friskt medium supplert med 10% FBS. Polybren ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml for å øke effektiviteten infeksjon. Mediet ble forandret 6 timer etter infeksjon. Celler ble valgt med G418 (800 mikrogram /ml) i en uke for å generere stabile cellelinjer som uttrykker GFP eller PNR.
CellTiter Glo lysende Celleviabilitet analyser
Ett tusen celler per brønn ble sådd i kvadruplikat i en 384-brønners plate og behandlet med de angitte konsentrasjoner av 11a for en uke. Celler ble deretter underkastet den CellTiter Glo luminescerende cellenes levedyktighet assay i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, Madison, WI). IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp av XLfit
TM-tillegget for Excel.
luciferaserapportørplasmid analyser
DR2-drevet luciferase reporter, TLX og COUP-TFI plasmider var snill gaver fra Dr. Ronald Evans. COUP-TFII plasmid var en slags gave fra Dr. Michael Gould. De andre plasmider ble kjøpt fra OpenBiosystems (Huntsville, AL). Luciferase analyser ble utført ved anvendelse av Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI). HEK293T celler ble sådd i en 96-brønns plate (2 x 10
3 /brønn). Etter 24 timer ble cellene transfektert ved hjelp av transitt-LT1 (Mirus Bio) med 20 ng DR2-drevet luciferase reporter, 10 ng β-galaktosidase reporter, og 20 ng CMV ekspresjonsvektor for kontroll, PNR, TLX, COUP-TFI eller COUP-TFII. Forbindelse 11a ble tilsatt 24 timer etter transfeksjon, og luciferase-aktiviteten ble bestemt etter inkubering i ytterligere 24 timer. β-galaktosidase-aktivitet ble brukt til å normalisere for transfeksjonseffektivitet.
Cell proliferasjonsanalyser
Celler (2 x 10
3 /brønn) ble sådd ut på en 96-brønns plate. Etter 24 timer, ble forskjellige konsentrasjoner av 11a tilsatt til platene. Cellene ble dyrket i 72 timer og deretter 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (Sigma-Aldrich) oppløsning (20 ul per brønn, 4 mg /ml i PBS) ble tilsatt. Cellene ble inkubert ved 37 ° C i 4 timer. Etter kassering av supernatanten, ble 200 ul DMSO tilsatt, og absorbansen ble målt med et 540 nm filter på en Victor X5 mikroplateleser (PerkinElmer, Waltham, MA). Omtrent IC
50 verdier ble beregnet ved hjelp av GraphPad Prism programvare (versjon 5.04, Graph-Pad Software Inc., San Diego, CA) og en tre parameter logg versus respons ikke-lineær regresjon.
Cell Cycle Analysis
Cellene ble høstet ved trypsinering, sentrifugert og fiksert i 80% iskald etanol dråpevis med kontinuerlig risting. Før analyse ble cellene sentrifugert, og etanolen ble fjernet. Cellepelletene ble resuspendert i 1 ml PI /RNase-oppløsning (50 ug /ml propidiumjodid, 50 pg /ml RNase A, 0,25% Triton X-100 i PBS). Flowcytometri analyse ble utført med en FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, California) med eksitasjon ved 488 nm. Integrerte røde fluorescerende histogrammer ble analysert med Modfit LT (Verity Hus Software, Topsham, ME).
Apoptose analysen måles ved Annexin V /PI farging
Celler ble farget med Alexa-488 Annexin V og PI, og evaluert for apoptose ved strømningscytometri i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen). I korthet, en x 10
6-celler ble vasket to ganger med PBS, og farget med 5 ul av Annexin V og 1 ul PI (100 ug /ml) i 1 x bindingsbuffer i 15 min ved romtemperatur i mørke. Flowcytometri analyse ble utført med FACSCalibur. Både tidlig apoptotisk (annexin V-positive, PI-negativ) og sen (annexin V-positive og PI-positive) apoptotiske celler ble inkludert i celledød bestemmelser analysert av FlowJo (Tre stjerners Inc., Ashland, Oregon).
Western blot analyse
Cellene ble høstet og lysert med RIPA-buffer (50 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoksykolat, 1% Triton X-100, 1 mM DTT, proteasehemmere og benzonase) . Etter sentrifugering ble totalt protein kvantifisert ved hjelp av BioRad proteinanalysen (BioRad), og 25 ug protein ble løst SDS-PAGE. Proteiner ble overført til en nitrocellulosemembran i 1,5 timer ved 0,35 A. Membranene ble blokkert med 5% fettfri melk og inkubert med primært antistoff ved romtemperatur i 2 timer eller over natten. Membranene ble deretter inkubert med sekundært antistoff i 1 time ved romtemperatur og visualisert ved anvendelse SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific, Waltham, MA) på autoradiografi film. Anti-PNR antistoff ble generert av Genemed Synthesis Inc., TX. To KLH-konjugerte peptider ble syntetisert ved Genemed Synthesis Inc.: PETRGLKDPEHVEALQD og LSQHSKAHHPSQP, tilsvarende menneskelige PNR aminosyrer 331-347 og 353-365, henholdsvis. Disse peptider ble anvendt for å immunisere kaniner. Antiserumet ble affinitetsrenset etter den siste lufte for å oppnå anti-PNR spesifikt antistoff. Anti-p53 og anti-p21-antistoffer ble erholdt fra Pierce (Rockford, IL); anti-Cyclin D1 og anti-HSP90 antistoffer ble oppnådd fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); anti-PARP antistoff ble hentet fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA).
Kvantitativ Real-Time PCR-analyse
Total RNA ble ekstrahert ved hjelp av HP Total RNA Kit (VWR Scientific, West Chester, PA) i henhold til produsentens instruksjoner. 1 pg RNA ble reverstranskribert ved hjelp av Superscript II RT i henhold til produsentens protokoll (Invitrogen, Carlsbad, CA) og kvantitativ PCR ble utført ved anvendelse av SYBR grønn farge (Roche Scientific, Basel, Sveits) og en CFX96 instrument (BioRad, Hercules, CA ). Grunning sekvenser (IDT, Coral, IA) som brukes i denne studien var som følger: COUP TFII: fremover, 5′-GCCATAGTCCTGTTCACCTC-3 «; omvendt, 5»-GGTACTGGCTCCTAACGTATTC-3 «; RARB2: fremover, 5»-GTGGAGTTTGCTAAACGTCTG-3 «; omvendt, 5»-TCATGGTGTCTTGTTCTGGG-3 «; NGFI-A: forover, 5»-CAGCACCTTCAACCCTCAG-3 «; omvendt, 5»- AGTCGAGTGGTTTGGCTG-3 «; 18S: forover, 5»-CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 «; omvendt, 5»-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3 «.
Statistisk analyse
Alle resultatene er representative for minst tre uavhengige eksperimenter. Statistisk signifikans av GI
50 verdier mellom villtypen, mutert, og null p53-cellelinjer ble beregnet ved bruk av en to-sidig uparede Wilcoxon Rank Sum test. Statistisk signifikans av genuttrykk i QRT-PCR analyse og apoptose analyser ble beregnet ved hjelp av en tosidig Student t-test.
Resultater
11a har ikke agonistiske effekter mot PNR i celle- baserte analyser
for å undersøke cellulære funksjoner av PNR, ansatt vi sammensatte 11a (struktur vist i figur 1A), en tidligere beskrevet antatt PNR agonist med en syklopropyl amid gruppe rapportert å gi en høy agonistisk aktivitet mot PNR (EF
50 200 nM) [31]. Forbindelse 11a ble syntetisert og
1H-NMR og massespektrometri data (fig S1 og S2) bekreftet den korrekte molekylære strukturen og molekylvekten av 11a. TLX, COUP-TFI og COUP-TFII er i samme nukleær reseptor-underfamilien som PNR [36], som binder seg til en direkte gjentagelse av den GGTCA motiv med en 2-bp mellomrom (DR2) [37]. For å vurdere spesifisiteten av 11a til PNR, ble aktiveringen av PNR og disse nært beslektede orphan-reseptorer ved 11a sammenlignet i en DR2-drevet luciferase reporter-analyse (figur 1B og 1C). HEK293T-celler ble transfektert med ekspresjonsvektorer for PNR [13], TLX [38], COUP-TFI [39] eller COUP-TFII [39] og en DR2-drevet luciferase reporter-gen, og cellene ble deretter behandlet med 11a ved hjelp av konsentrasjoner som varierer fra 15 nM til 150 nM for å minimalisere den cytotoksiske effekt. På 15 nM, gjorde 11a ikke aktivere noen av de nukleære reseptorer testet. Ettersom konsentrasjonen øker, 11a aktivert svakt TLX, COUP-TFI og COUP-TFII på en doseavhengig måte. Imidlertid ble PNR aktivering sett bare ved den høyeste konsentrasjonen testet (mer enn 150 nM) (figur 1B). Vi bemerket at konsentrasjonene av 11a som er større enn 150 nM var cytotoksisk og induserte alvorlig celledød, noe som begrenset nøyaktighet av luciferase reporter assay. Dette resultatet indikerer at 11a ikke har åpenbare agonistiske effekter mot PNR. Fordi PNR ble den minste aktivert blant de fire nukleære reseptorer som ble testet ved den angitte området 11a konsentrasjoner (figur 1C), våre resultater indikerer at det spesielle ved 11a mot PNR er lav og agonisme av 11a er sannsynligvis ikke en direkte effekt, slik det er vist i NCOR utgivelsen studie der 11a også hemmet TRβ-NCOR og RARα-NCOR interaksjoner [32].
(A) Kjemisk struktur av 11a. HEK293T celler transfektert med de angitte konstruksjonene ble behandlet i triplikat med 0,1% DMSO, 15 nM, 30 nM, 60 nM, 120 nM eller 150 nM 11a. Data er uttrykt som relative luciferase enheter normalisert til DMSO-kontroll ± SD. (B) Sammenligning mellom forskjellige nukleære reseptorer med økende konsentrasjoner 11a. (C) Sammenligning mellom ulike doser av 11a med ulike kjernereseptorer.
Fordi 11a aktivert PNR-relaterte kjernefysisk reseptorer COUP-TFI og COUP-TFII i DR2 luciferase assay ved relativt lav konsentrasjon av 30 nM (figur 1), og bare COUP-TFII kunne påvises i alle brystkreftcellelinjer [40] undersøkte vi om 11a kan endre uttrykket av COUP-TFII nedstrøms målgener i MCF7 og T47D, to ERα positiv brystkreft cellelinjer . COUP-TFII har vært innblandet i en rekke kreftformer for både onkogene og kreft undertrykkende effekter [41]. I brystkreftceller, RARB2 [42,43] og NGFI-A [44,45] er to godt karakterisert direkte mål oppregulert ved COUP-TFII. All-trans retinsyre (Atrå) ble tidligere vist seg å øke COUP-TFII mRNA nivå samt styrke COUP-TFII nedstrøms mål genuttrykk [46]. Faktisk ble 1fiM Atrå funnet å øke COUP-TFII mRNA nivå med ca 1,5- og 2,5 ganger i MCF7 og T47D celler, henholdsvis (figur S3). Interessant, selv om 11a ikke øke COUP-TFII mRNA-nivåer i de to cellelinjene, 11a behandlingen resulterte i opp-regulering av COUP-TFII målgener. I MCF7-cellelinjen, 0,1 uM 11a indusert NGFI-A-genekspresjon til et lignende nivå som 1 uM ATRA. 1fiM 11a indusert NGFI-A uttrykk ~ 5 ganger over at av en mikrometer Atrå (figur S3A). Fordi NGFI-A uttrykk er for lav til å bli oppdaget i T47D celler, målte vi en annen COUP-TFII target genet, RARB2. I T47D celler, Atrå robust økt RARB2 mRNA nivå ved 30-fold. Selv 11a også øket RARB2 ekspresjon i en doseavhengig måte, omfanget av aktivering var ikke sammenlignes med ATRA (Figur S3b). Disse resultatene indikerte at 11 a muligens regulerer COUP-TFII aktivitet i en gen- og celle-spesifikk måte.
Siden 11a-indusert celledød i HEK293T celler ved høyere konsentrasjoner og PNR ble vist å indusere apoptose i mange celletyper [ ,,,0],28], vi videre undersøkt om 11a-indusert cytotoksisitet ble PNR-mediert. Fordi PNR er undetectable av western blotting i brystkreftcellelinjer, flere stabile PNR overekspresjon brystkreft cellelinjer, MCF7-, MDA-MB-231, LM2 [34] og MDA-MB-468 celler, ble generert (Figur 2A). MTT-celle proliferasjonsanalyser ble deretter brukt til å bestemme den IC
50-verdier for 11a i GFP-uttrykkende kontrollcellelinjer og PNR-overuttrykkende cellelinjer. IC
50-verdier på cellene som overuttrykker PNR var lik de tilsvarende kontrollcellelinjer (figur 2B-E), med IC
50-verdier i området 0,05 til 0,7 uM. Fordi PNR overekspresjon ikke påvirke 11a cytotoksisitet i en hvilken som helst av cellene som ble testet, resultatene indikerer at 11a-indusert cytotoksisitet er sannsynlig uavhengig av PNR i disse cellene.
(A) brystkreftceller ble infisert med retrovirus som uttrykker GFP eller PNR. PNR ekspresjon ble påvist i Western blot og HSP90 ble brukt som kontroll lasting. (B) MCF7, (C) MDA-MB-231, (D) LM2 og (E) MDA-MB-468 brystcancerceller ble behandlet med 11a konsentrasjoner i området fra 10
-8-10
-3 M i 72 timer, og 11a IC
50 verdier ble oppnådd ved MTT celleproliferasjonsprosesser analyser.
11a cytotoksisitet er korrelert med p53 status i NCI-60 cellelinjer
å videre undersøke mekanismene for cytotoksisitet og de cellulære målene for 11a, vi brukte Developmental Therapeutics Program (DTP) NCI-60 cellelinje screening tjeneste, en offentlig tilgjengelig tjeneste som bistår i å bestemme sammensatte cytotoksisitet i et panel av 60 kreftcellelinjer, for å evaluere cytotoksisiteten til 11a i 60 cellelinjer [47]. Den 11a cytotoksiske data for 58 av NCI-60-cellelinjer ble mottatt fra DTP og GI
50 data er vist i figurene S4-S6. Denne studien besto av 60 cellelinjer fra 9 forskjellige krefttyper: leukemi, ikke-småcellet lungekreft, tykktarmskreft, CNS kreft, melanom, eggstokk kreft, nyrekreft, prostatakreft og brystkreft. Den sulphorhodamine-B (SRB) analyse ble benyttet for å oppnå den GI
50 (50% veksthemning) verdier av forskjellige kreftcellelinjer. Til tross for det store omfanget av cellelinjer som er involvert, GI
50 verdier av 11a falt i et smalt område (10
-6 til 10
-5 M). Siden vår forrige undersøkelse antydet at PNR stabiliserer p53 ved post-translasjonell modifikasjon i HeLa og HCT116 cellelinjer [28], neste undersøkte vi om 11a sensitivitet var korrelert med p53 uttrykk nivå eller mutasjonsstatus. Den p53 mutasjon status av NCI-60 cellelinjer ble bestemt tidligere [48]. De 58 cellelinjer vi fikk GI
50 data fra DTP kan deles inn i to kategorier: p53 villtype og p53 mutert /null (tabell 1). Ved å sammenligne GI
50 verdiene av de to gruppene (figur 3), har vi funnet at p53 villtype-cellelinjer var betydelig mer følsom enn p53 mutert eller null-cellelinjer, med gjennomsnittlig GI
50-verdier 12,0 uM og 19.9 uM (henholdsvis p = 0,039, tosidig). Disse resultatene implisere p53 som en antatt determinant av 11a-indusert cytotoksisitet.
P53 WT
p53 Mut /Null
cellelinje
kons. (Mm)
cellelinje
kons. (Mm)
cellelinje
kons. (Mm)
cellelinje
kons. (µM)
SR12.70HL-608.27KM1220.90OVCAR-551.50A54916.20K-5623.59SW-62030.50OVCAR-813.30NCI-H46018.20MOLT-47.36SF-26838.20ADR-RES3.16HCT-1165.39RPMI-82261.24SF-2955.27SKOV340.20LOX IMVI7.10EKVX2.84SF-53924.20786-021.10MALME-3M20.90HOP-6219.40SNB-1932.40RXF 39326.30SK-MEL-51.28HOP-9217.60SNB-7518.50SN12C27.50UACC-2573.46NCI-H22616.90U25121.40TK-1029.80UACC-6221.40NCI-H237.49M1416.80PC-312.10A49811.60NCI-H322M54.80MDA-MB-43514.50DU-14537.90ACHN13.70NCI-H52213.60SK-MEL-222.80MDA-MB-23116.50CAKI-114.20COLO 20512.40SK-MEL-2818.50HS578T53.40UO-3116.90HCC-299822.30IGROV124.20BT-5492.00MCF74.35HCT-1516.80OVCAR-315.70T-47D6.34average GI5011.96HT2915.90OVCAR-411.00average GI5019.92Table 1. 11a cytotoksisitetstester resultater for de 58 cellelinjer i NCI60 cellelinje screening
GI
50 verdier og p53 status (WT: villtype; Mut /Null.: mutert eller null) er vist for hver cellelinje. CSV Last ned CSV
11a GI
50 verdier (um) er plottet mot p53 WT og Mut /null grupper i boksen diagrammet. Minimums- og maksimumsverdier, medianverdier og gjennomsnittsverdier vises. Betydning testing ble utført av to-sidig uparet Wilcoxon rank sum test. *, P. 0,05
Apoptose er ikke den viktigste mekanismen regnskap for 11a-mediert cytotoksisitet
For å studere mekanismen av 11a indusert cytotoksisitet, valgte vi tre eggstokkreft cellelinjer med representant p53 mutasjon status: SKOV3 (p53 null), A2780 (p53 villtype) og OVCAR3 (p53 mutasjon, p.R248Q) [49]. Disse cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner av 11a (fra 0 til 1 uM), og forholdet mellom spaltet PARP til total PARP ble brukt som en indikator på apoptose [50]. Doxorubicin ble anvendt som en positiv kontroll for å indusere apoptose i SKOV3-celler (figur 4A). Selv ved de høyeste konsentrasjonene som ble testet, 11a bare beskjedent indusert PARP-spaltning i SKOV3-celler, men ikke i A2780 eller OVCAR3 celler (figur 4A). Men det basale nivået av spaltet PARP var også høyere i SKOV3-celler sammenlignet med de andre cellelinjer. For å kvantitativt undersøke apoptotisk effekt av 11a, ble Annexin V /PI dobbel farging utført. I samsvar med de spaltede-PARP-assays, 11a bare beskjedent indusert apoptose i SKOV3-celler, men ikke i A2780 eller OVCAR3 celler ved anvendelse av etoposid som den positive kontroll (figur 4B og figur S7). Lignende effekter ble observert i MCF7 brystcancercellelinje, hvor både doksorubicin og staurosporin induserte betydelig apoptose, mens 11a ikke induserer apoptose ved de testede konsentrasjoner (figur 4C og 4D). Sammen er disse dataene indikerer at apoptose er ikke den viktigste mekanismen regnskap for 11a-indusert cytotoksisitet.
SKOV3, A2780 og OVCAR3 eggstokkreft celler (A) og MCF7 brystkreftceller (C) ble behandlet med de angitte doser av 11a eller doksorubicin i 24 timer. Totalt cellelysater ble analysert for PARP spalting ved hjelp av anti-PARP antistoff i vestlige blotter. p-aktin ble benyttet som en kontroll lasting. De svarte pilene indikerer posisjonene ikke-spaltet og spaltet PARP proteiner. (B) og (D) Etter 24 timers behandling med 2 uM 11a, ble cellene samlet opp og farget med Annexin V /PI og underkastet flowcytometri. 50 uM etoposid (B) eller en staurosporin uM (STS) (D) tjente som positive kontroller for apoptose. Statistisk signifikans ble vist som ** p 0,01, *** p. 0.001 sammenlignet med DMSO kontroll
11a induserer G
1 /S cellesyklus arrest i en p53-avhengig måte
Siden 11a ikke klarte å indusere betydelig apoptose i noen av cellelinjene som ble testet, hypotese vi at 11a-indusert cytotoksisitet kan tilbakeføres til cellesyklusstans, noe som kan indusere vekst-inhibering som bestemt av sulforhodamin B (SRB) kolorimetrisk test som benyttes for NCI-60-cellelinjen cytotoksisitet screening. For ytterligere å skjelne om 11a cytotoksisitet korrelert med p53 status, tykktarmskreft isogen HCT116 p53 + /+ og HCT116 p53 – /- cellelinjer ble brukt [35]. Interessant, disse isogene cellelinjer utstilt differensial følsomhet for 11a. P53 villtype-cellelinje (IC
50 = 0,0337 uM) var omtrent 10 ganger mer sensitive enn p53 null-cellelinje (IC
50 = 0,3188 uM) i et pilotskjerm utført av Small Molecule Screening og Synthesis Facility (SMSSF) fra University of Wisconsin (figur 5A). Den differensielle følsomhet ble senere bekreftet ved hjelp av MTT-proliferasjonsassay hvor p53 villtypeceller (IC
50 = 0,36 uM) var mer følsomme enn p53 null-celler (IC
50 = 1,76 uM) (figur 5B). For ytterligere å undersøke mekanismen ved hvilken de to isogene cellelinjene viste differensial sensitiviteter til 11a, vurderte vi de apoptotiske virkninger av 11a i disse to cellelinjer. Cellene ble behandlet med økende konsentrasjoner av 11a i 24 timer, og apoptose ble målt ved anvendelse av et PARP-spaltning assay, hvor PARP-spaltning forholdet indikerer apoptotiske status. Figur 5C viser at bare beskjeden PARP-spaltning ble observert i noen av p53 + /+ og p53 – /- HCT116-celler. For å undersøke om PARP spilt en rolle i 11a mediert cytotoksisitet, vi co-behandlede celler med 11a og 3-aminobenzamid (3-AB), en bestemt PARP hemmer [51]. PARP-inhibering ikke påvirker cytotoksisiteten til 11a (figur 5D), noe som indikerer at 11a-mediert cytotoksisitet var uavhengig av PARP-aktivitet. Den apoptotiske effekt av 11a ble videre undersøkt av Annexin V /PI farging. Mens staurosporin forårsaket alvorlig apoptose, gjorde 11a fremkalte ikke noen apoptose i isogene cellelinjer sammenlignet med DMSO kontroll (figur 5E). Fordi PNR protein var udetekterbar i disse celler, har vi overuttrykt PNR, etterfulgt av behandling med 11a. Våre resultater forsterket at apoptotiske effekten var uavhengig av PNR (figur 5F)
(A) IC
50 verdier av 11a i p53 + /+ og p53 -. /- HCT116 cellelinjer. Cellene ble sådd ut i fire eksemplarer i 384-brønns plater og behandlet med de angitte konsentrasjoner av 11a i 7 dager. Veksten inhibering ble bestemt ved CellTiter Glo luminescerende celleviabilitet assay. (B) IC
50 verdier av 11a ble undersøkt i MTT celle levedyktighet analyser etter 72 timer inkubasjon med 11a. (C) De to cellelinjer ble behandlet med 0, 1, 10, 100 eller 1000 nM 11a i 24 timer og utsatt for Western blot ved anvendelse av anti-PARP-antistoff for å påvise PARP-spaltning. HSP90 ble anvendt som en kontroll lasting. (D) Cellene ble behandlet med indikerte konsentrasjoner av 11a i nærvær eller fravær av 2 mM 3-aminobenzamid (3-AB) i 72 timer og deretter utsatt for MTT-analyser. (E) Etter 24 timers behandling med 1 uM 11a, ble cellene samlet opp og farget med Annexin V /PI og underkastet flowcytometri. 1 uM staurosporin (STS) tjente som en positiv kontroll for apoptose. Statistisk signifikans ble vist som ** p 0,01, *** p 0,001 sammenlignet med DMSO kontroll. (F) De to celler ble transfektert med 1 ug GFP eller PNR i 24 timer etterfulgt av behandling med DMSO eller 1 uM 11a i ytterligere 24 timer. Western blot ble utført for å undersøke PARP cleavage.
Disse studiene tyder på at 11a kan ha mer dyptgripende virkninger på cellesyklus arrest enn apoptose. For å undersøke om 11a indusert cellesyklus arrest, ble cellene synkronisert på G
0 /G
en fase av serum sult i 24 timer. Figur 6 viser resultatene av cellesyklusen profilanalyse av synkrone HCT116-celler behandlet med DMSO eller 50 nM 11a umiddelbart etter frigjøring av serum sult. Når cellene ble behandlet med DMSO, de fleste av cellene var i S-fasen etter 12 timer (64% for p53 + /+ celler og 58% for p53 – /- celler), og cellene returnert til G
en fase 24 timer senere. Dette resultatet er i tråd med den normale cellesyklus på 24 timer for disse isogene cellelinjer. Når imidlertid synkronisert p53 villtype-celler ble behandlet med 50 nM 11a, en konsentrasjon nær den cytotoksisiteten IC
50 33,7 nM, en G
1 /S-fasen cellesyklus-stans forekom i opptil 24 timer ( Figur 6B). Etter behandling med 11a i 12 timer bare 10% av cellene returnert til S-fasen, sammenlignet med 64% ble behandlet med DMSO, og de fleste av 11a-behandlede celler ble arrestert i G
0 /G
en fase (87%).
