Abstract
Bakgrunn
MUC1 er en type jeg transmembrane glykoprotein abnormt overexpressed i ulike kreftceller, inkludert kreft i bukspyttkjertelen. Cytosoliske slutten av MUC1 (MUC1-c) er i stor grad involvert i en rekke signalveier. MUC1-c er rapportert å hemme apoptose i en rekke kreftceller, men mekanismen av inhibering er uklar.
Metode
Ekspresjon av MUC1-c ble studert i bukspyttkjertelkreft cellelinjen MIAPaCa -2 på RNA-nivå ved hjelp av qRTPCR og på proteinnivå ved Western blotting. MUC1-c-ekspresjon ble inhibert enten ved siRNA eller ved et spesifikt peptid-inhibitor, GO-201. Effekt av MUC1-c hemming på levedyktighet og spredning og lysosomal permeabilization ble studert. Association of MUC1-c med HSP70 ble oppdaget av co-immunoprecipitation av MUC1-c og HSP70. Lokalisering av MUC1-c i cellulære organeller ble overvåket av immunfluorescens og med immun- blotting av MUC1-c antistoff etter subcellulære fraksjonering.
Resultater
Hemming av MUC1-c av en inhibitor (go- 201) eller siRNA resulterte i redusert levedyktighet og redusert spredning av kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre GO-201, peptid hemmer av MUC1-c, var effektive i å redusere tumorbyrde i bukspyttkjertelkreft musemodell. MUC1-c ble også funnet å være assosiert med HSP70 i cytosol, selv om en betydelig mengde av MUC1 ble også sett for å være til stede i lysosomene. Inhibering av MUC1 ekspresjon eller aktivitet, viste en forbedret Cathepsin B-aktivitet i cytosol, noe som indikerer lysosomal permeabiliseringen. Derfor denne studien indikerer at MUC1-c samhandlet med HSP70 i cytosol av kreft i bukspyttkjertelen celler og lokalisert til lysosomene i disse cellene. Videre våre resultater viste at MUC1-c beskytter kreft i bukspyttkjertelen celler fra celledød ved å stabil lysosomer og hindre utslipp av Cathepsin B i cytosol
Citation. Banerjee S, Mujumdar N, Dudeja V, Mackenzie T, Krosch TK, Sangwan V, et al. (2012) MUC1c Regulerer Cell Survival i bukspyttkjertelkreft av Forhindrer lysosomale Permeabilization. PLoS ONE 7 (8): e43020. doi: 10,1371 /journal.pone.0043020
Redaktør: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, USA
mottatt: 14. april 2012; Godkjent: 16 juli 2012; Publisert: 13 august 2012
Copyright: © Banerjee et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette prosjektet ble finansiert av National Institutes of Health R21 5R21CA131663-02, R01 5R01CA124723-05 og Catherine og Robert Goodale fundament til AKS. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
kreft i bukspyttkjertelen er den fjerde største årsaken til kreftdød i både menn og kvinner i USA. De fleste bukspyttkjertel kreft er duktalt adenokarsinom. Den 5-års overlevelse for pasienter med lokalisert sykdom etter kirurgisk reseksjon er 20% og for de med metastatisk sykdom, er svært lav overlevelse. Selv om betydelige ressurser er forpliktet til å forbedre overlevelsen av pasienter med kreft i bukspyttkjertelen i de siste tiårene, har det ikke vært noen vesentlig forbedring i disse tallene [1]. Den dårlige overlevelsesraten er knyttet til sen påvisning av kreft i bukspyttkjertelen og den ekstreme motstand av tumorcellene til eventuelle kjemoterapeutiske strategier. Av denne grunn, belysning av mekanismen for motstanden av kreft i bukspyttkjertelen celler er et primtall forskning fokus, da det kan føre til utvikling av nye terapeutiske modaliteter.
slimstoffer er transmembran-glykoproteiner, til stede på overflaten av forskjellige slimhinne epitelial og hematopoietiske celler, og er rapportert å være overuttrykt i et antall adenocarcinomer [2]. MUC1 er en av de slimstoffer som er assosiert med dårlig prognose, ondartet transformasjon av tumorceller, og motstand mot genotoksiske anti-kreftmidler [3], [4]. MUC1 er også forbundet med invasjon [5] – [7], [8], som styrer flere cellulære signalveier [9] og tumorprogresjon [10]. Mangel på MUC1 har blitt korrelert med redusert spredning, invasjon, og mitotiske priser både
in vivo Hotell og
in vitro
i bukspyttkjertelkreft [11].
MUC1 syntetiseres som et enkelt peptid som undergår spalting i to subenheter, deretter dannelse av et stabilt ikke-kovalent heterodimer som består av et ekstracellulært domene og en cytoplasmatisk hale [12], [13]. Det ekstracellulære domene av MUC1 er sammensatt av variable antall tandemrepetisjoner (VNTR) modifisert ved omfattende O-glykaner, og virker som en fysisk barriere mot det ekstracellulære miljø. Den cytoplasmiske hale av MUC1 (MUC1-c) består av en 58 aminosyre ekstracellulært domene, et 28 aminosyre-transmembran domene og en 72 aminosyre cytoplasmatisk domene. Det cytoplasmatiske domene, (betegnet MUC1-c) interagerer med β-catenin, den store effektor av den kanoniske Wnt signalveien [14], [15], og induserer forankrings-uavhengig vekst og tumorigenisitet [16], [17]. Interaksjon med β-catenin fremmer lokalisering av MUC1 til kjernen, hvor MUC1-c interagerer med forskjellige transkripsjonsfaktorer og aktiverer en rekke vekst og overlevelsesreaksjonsveier [18] – [24], for derved å fortrenge flere celledødsveier [25] – [ ,,,0],29].
overekspresjon av MUC1, som finnes i humane svulster, er assosiert med lokalisering av MUC1-c til mitokondriene [3]. Den funksjonelle betydningen av mitokondriell MUC1-c lokalisering er støttet av den demonstrasjon at MUC1 demper DNA-skade-indusert frigjøring av mitokondrielle apoptogenic faktorer og apoptotisk respons [3]. Siden MUC1 ikke har den klassiske mitokondrie lokalisering signatur, blir den mitokondrielle målretting av MUC1-C mediert av dets interaksjon med cytosoliske anstand som HSP70 og HSP90 [30]. Som det nylig syntetiserte og -cleaved MUC1-c er i cytosolen med en eksponert hydrofobt transmembrandomene [31], [30], disse anstand er i stand til å binde seg til den og levere den til mitokondriene [32]. Association of MUC1-c med varmesjokkproteiner etter aktivering med heregulin og påfølgende målretting til mitokondrie ytre membran er blitt rapportert [33]. Som en komponent i den mitokondrielle ytre membran, MUC1-c demper tap av transmembranpotensialet i respons til genotoksiske spenning [34], [3], og gir resistens mot død i den cellulære respons til DNA-skade, reaktive oksygenforbindelser, hypoksi, eller aktivering av død reseptor superfamilien [34].
Selv om nedstrøms veier av celledød som følge av MUC1 inhibering har blitt studert i en rekke kreftformer, mekanismen for initiering av mitokondriell depolarisering (MUC1 følgende hemning ) som fører til aktivering av apoptotiske trasé er ikke klart i bukspyttkjertelkreft. Mitokondrie membran depolarisering kan være et resultat av en rekke hendelser. Skade av nukleært DNA eller endoplasmatiske retikulum begge indusere apoptotisk celledød som er avhengig av mitokondrie depolarisering og caspaseaktivering [35]. Lignende depolarisering og initiering av celledødsveier kan også bli utløst fra lysosomene. Lysosomal skade i respons til genotoksiske midler er rapportert å initiere celledød ved frigjøring av de hydrolytiske enzymer fra denne organeller inn i cytoplasma [36], [37]. Lysosomene inneholder mange forskjellige typer av hydrolytiske enzymer, inkludert proteaser, lipaser, nukleaser, glykosidaser, fosfolipaser, fosfataser og sulfatases som vanligvis utøver sin maksimale enzymatiske aktivitet ved lav pH. Lysosomale proteaser som er involvert i celledød er de Katepsiner som forblir aktiv ved en nøytral pH-verdi, slik som Cathepsin B, Cathepsin D og Cathepsin L. Disse proteaser aktivere apoptotiske effektorer som mitokondrier og /eller kaspaser, for derved å utløse apoptose [38] ., [39]
en av de proteintyper som fremmer overlevelsen av bukspyttkjertelen celler er familien av varmesjokkproteiner, spesielt HSP70 [37], [40] – [42]. Det har blitt rapportert at nedregulering av HSP70 resulterer i kreft i bukspyttkjertelen celledød ved å fremkalle lysosomal permeabilization, [37] men den eksakte mekanismen for beskyttelse er ikke undersøkt.
I denne studien, viser vi at HSP70 knytter den C-terminale ende av proteinet MUC1 (MUC1-c) og transporterer det til lysosomet, for derved å hindre lysosomal permeabiliseringen og fremmer celleoverlevelse i disse tumorceller. Vi viser videre at inhibitor peptid av MUC1 (GO-201) hemmer aktiviteten av MUC1-c og resulterer i redusert celleproliferasjon og levedyktighet av tumorceller både
in vivo Hotell og
in vitro.
Resultater
kreft i bukspyttkjertelen celler Vis økt uttrykk av MUC1 Sammenlignet med normal Pancreas
uttrykk for MUC1 ble studert i flere bukspyttkjertelkreft cellelinjer på både RNA og proteinnivå . Ekspresjon av MUC1 mRNA ble funnet å være signifikant høyere i alle bukspyttkjertelcancercellelinjer enn i de ikke-tumorigene humane pankreatiske ductal celler (HPDEC) (Fig. 1A). Lignende forhøyet ekspresjon av MUC1-c-protein ble observert i alle tumorcellelinjer sammenlignet med de ikke-tumorigene HPDECs. En korrelasjon ble funnet å eksistere mellom aggressivitet av cellelinje og ekspresjon av MUC1 i bukspyttkjertelkreft (Fig. 1B). Høyere uttrykk av MUC1 ble observert i mer invasive og metastatisk cellelinjer S2-013 og S2-VP10 eller AsPC1 (avledet fra ascites) enn i cellelinjer hentet fra primære tumorer (MIAPaCa-2, BXPC3 og Hs776T).
mRNA uttrykk nivåer av MUC1 i flere bukspyttkjertelkreft cellelinjer i forhold til ikke-tumorigent HPDEC (A). Data er uttrykt som gjennomsnitt +/- SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
0,05 (
t
test) sammenlignet med kontroller. Protein uttrykk nivåer av MUC1-c i forskjellige bukspyttkjertelkreft cellelinje og ikke-tumorigent HPDEC (B).
Hemming av MUC1 fører til redusert spredning og celledød
For å studere om MUC1 var et viktig protein kontrollerende celle overlevelse i kreft i bukspyttkjertelen, ble uttrykket hemmet ved hjelp av siRNA mot MUC1 i MIAPaCa-2 (fig. 2A-C) og AsPC1 (fig. 2G-i) celler. Parallelt har vi også brukt GO-201, et peptid fragment som hemmer aktiviteten av MUC1-c, og dermed føre til deregulering av nedstrøms signalaktivitet og utløser celledød i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer MIAPaCa-2 (Fig. 2D-F) og AsPC1 ( fig. 2J-L). Begge hemming av MUC1 uttrykk av siRNA (Fig. 2 A, G) samt hemming av MUC1-c aktivitet ved GO-201 førte til redusert spredning og økt celledød i kreft i bukspyttkjertelen celler. MIAPaCa-2-celler ble sett til å reagere mer hemming av MUC1 enten ved siRNA eller GO-201 (Fig. 2A-F) sammenlignet med AsPC1 celler (Fig. 2G-L). Som forventet, GO-201, peptidet inhibitor for MUC1-C, endret ikke ekspresjonsnivået av proteinet (fig. 2D, J). Celledød ble sett til å være caspase-formidlet (figur S1).
MUC1 ekspresjon ble inhibert med siRNA i MIAPaCa-2 (A) felt 1-3 viser kontroll MIAPaCa-2, MIAPaCa-2-transfektert med ikke- henholdsvis spesifikke siRNA og MUC1 siRNA. Både proliferasjon (B) og levedyktighet (C) ble redusert med redusert ekspresjon av MUC1 i MIAPaCa-2-celler. Ved behandling med MUC1-C-aktivitet-inhibitor GO-201, som hemmer signaleringsaktiviteten av dette protein ble det sett ingen endring i ekspresjonsnivåene av MUC1 i MIAPaCa-2-celler (D). Lane 1 var ubehandlede MIAPaCa-2 celler og spor 2 var MIAPaCa-2 behandles med GO-201. Proliferasjon (E) og levedyktighet (F) ble sett til å være redusert. Tilsvarende, i en annen cellelinje, ASPC-1, transfeksjon med siRNA viste redusert proteinnivå (G) hvor Bane 1 er kontrollere ASPC-1, felt 2: ikke-spesifikk siRNA transfektert ASPC-1 og Bane 3 er MUC1 siRNA-transfekterte AsPC1 . Både proliferasjon (H) og levedyktighet (I) ble redusert. På behandling med inhibitoren GO-201, var det ingen endring i proteinnivå (J): Felt 1 ble ubehandlede ASPC-1 celler og kjørefelt to var ASPC-en behandles med GO-201. Proliferasjon (K) og levedyktighet (L) ble sett til å bli redusert. Data er uttrykt som gjennomsnitt +/- SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
. 0,05 (
t
test) sammenlignet med kontroller
MUC1 Associates med HSP70 i cytosol og lokaliserer i lysosomene
Heat shock protein 70 (HSP70) er sterkt overuttrykt i kreft i bukspyttkjertelen og dens nedregulering av hemmere og siRNA har blitt sett å indusere kreft i bukspyttkjertelen celledød [37]. Imidlertid er den nøyaktige rollen spilt av HSP70 i overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen celler ukjent. På samme tid, er MUC1 kjent for å være overuttrykt i bukspyttkjertelkreft og spille en rolle i celleoverlevelse i en rekke kreftcellelinjer, men den nøyaktige mekanisme har vært unnvikende [11], [43], [44]. Siden HSP70 er en anstand, den har evnen til å binde seg til og beslaglegge cytosoliske MUC1-c dermed målretting det til forskjellige celleorganeller, hvor MUC1-c kunne regulere de forskjellige anti-apoptotiske veier å beskytte kreft i bukspyttkjertelen celler fra apoptotisk celledød. Det har vist seg tidligere at MUC1 binder seg til HSP70 og HSP90 og er rettet mot mitokondrie ytre membran [33]. For å se om MUC1-c er assosiert med HSP70 i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi testet for co-utfelling av MUC1 og HSP70 i kreft i bukspyttkjertelen celler. MUC1-c og HSP70 ble funnet å co-immunpresipitatet, onfirming at HSP70 og MUC1 faktisk samhandle på kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 3A).
Immunpresipitasjon med MUC1 og HSP70 viste de to proteiner for å bli assosiert (A) . Lanes 1, 2 og 3 viser totale proteinnivåer, HSP70 og MUC1 i gjennomstrømning og de to proteiner immunoutfelt av HSP70 antistoff hhv. Lanes 4 og 5 viser gjennomstrømning og immunpresipitatene av MUC1 antistoff. MUC1-c ble funnet å være lokalisert til lysosomene i MIAPaCa-2-celler, selv om nesten like mengder av MUC1-c ble også cytosoliske (B). Lamp2, bosatt lysosomal protein, og aktin, en overveiende cytosolprotein, ble brukt som fraksjone markører. Bane 1 er den cytosoliske fraksjon. Felt 2 er en rå lysosomal fraksjon, som er ytterligere anriket i kjørefelt 3. HSP70, men forbundet med MUC1, ble sett til å være til stede hovedsakelig i cytosol. Immunfluorescens bekreftet samlokalisering av MUC1-c og Lamp2 i lysosomer (C).
MUC1 utstrakt grad til stede på celleoverflaten av bukspyttkjertelen celler. Imidlertid er 72 aminosyre C-terminale ende av proteinet undergår auto-spaltning og lokaliserer til forskjellige cellulære organeller som reaksjon på et differensialsignaleringsmekanisme. For å se om MUC1-c faktisk ble fraktet med HSP70 til ulike cellulære avdelinger, utførte vi immunfluorescens med organelle spesifikke markører sammen med subcellulære fraksjonering etterfulgt av immunoblotting med anti-MUC1 antistoff for å lete etter sin lokalisering. Integriteten av de forskjellige fraksjoner og renheten av de organellar preparater ble bekreftet ved hjelp av forskjellige markører (Lamp2 for lysosomer og Actin for cytosol). Selv om HSP70 ble sett til co-utfelling med MUC1-c (fig. 3A), ble det sett for å være lokalisert i cytosol og ikke i lysosomene, mens MUC1-c ble funnet å være lokalisert i både cytosol og lysosomer (fig. 3B). Lokalisering av MUC1 i lysosomer ble ytterligere bekreftet ved co-farging kreft i bukspyttkjertelen celler med det lysosomale markør Lamp2 (Fig. 3C). Immunfluorescens viste at MUC1 og Lamp2 co-lokalisere med en Pearsons korrelasjon på 0,75 (Fig. 3C). Dette indikerte at MUC1-c forbundet med HSP70 i cytosol og lokalisert i lysosomene. Noen MUC1-c ble også sett for å lokalisere i mitokondriene, for derved bekrefter tidligere studie av Ren et al at MUC1-c er rettet til mitokondriene av HSP70 [3] (figur S2).
Inhibering av MUC1- c eller hSP70 Results in lysosomal permeabilization fører til celledød
lysosomal permeabiliseringen er ofte tenkt å gå forut for celledød som respons på en stimulus ved å slippe en del av hydrolytiske enzymer i cytosol, og dermed redusere pH i cytosol og forårsaker acidose [45]. Frigjøring av lysosomale enzymer som Cathepsin B og Cathepsin D i sin tur indusere mitokondriell depolarisering som resulterer i frigjøring av cytokrom C og aktivering av apoptotiske reaksjonsveier [45]. Siden en betydelig andel av MUC1 ble lokalisert i lysosomer, så vi for en effekt på lysosomale permeabilization ved å måle tap av Cathepsin B-Lamp2 samlokalisering i lysosomene etter hemming av MUC1. Vi ytterligere bekreftet dette fenomenet ved å måle cytosolic aktivitet Cathepsin B i cellene etter hemming av MUC1 av siRNA. Våre immunofluorescence studier viste en tydelig tap i samlokalisering av CathepsinB og Lamp2 co-farging i MUC1-forstummet celler (fig. 4A). Våre biokjemiske studier viste at inhibering av ekspresjon av MUC1 viste en økning i cytosol-Cathepsin B-aktivitet indikerer at det lysosomale membranintegritet ble kompromittert (Fig. 4B). Det ble observert en nesten lik størrelse på cytosoliske Cathepsin B aktivitet når HSP70 ble hemmet ved hjelp av siRNA (Figur S3). Dette var i likhet med en tidligere studie [37] i vårt laboratorium rapporterer at nedregulering av HSP70 i bukspyttkjertelkreft resulterte i celledød ved lysosomal permeabilization. Dette indikerte at inhibering av enten HSP70 eller MUC1 resulterte i lysosomal permeabiliseringen. For å bestemme hvorvidt dette permeabiliseringen var direkte relatert til celledød, anvendte vi en celle-permeabel Cathepsin B-hemmer (CA-074-Me) og målte levedyktigheten av cellene i nærvær av en inhibitor MUC1 (fig. 5C). Mens levedyktighet av cellene ble redusert til nesten 40% av ubehandlede celler i nærvær av GO-201, celler behandlet med CA-074Me sammen med GO-201 ble sett å komme seg og viste en levedyktigheten til nesten 98% av ubehandlede celler ( fig. 4C). Det ble observert at celler behandlet med kun GO-201, viste redusert vekst og proliferasjon etter 3 dager med behandling, mens de som var behandlet med den Cathepsin B-hemmer viste proliferasjon og vekst ligner de som kontroller. Lignende restaurering av levedyktigheten til MIAPaCa-2 celler ble også observert da MUC1 uttrykk ble hemmet av siRNA (figur S4). Dette viste at effekten av GO-201 på Cathepsin B frigivelse kan bli reversert ved anvendelse av en Cathepsin B-inhibitor (fig. 4D). Dette ble også bekreftet biokjemisk, der MUC1 siRNA og GO201 begge viste økt cytosolic Cathepsin B-aktivitet, men behandling med CA-074Me viste en reversering av denne aktiviteten. Dette indikerte at MUC1 inhibering faktisk førte til lysosomale permeabiliseringen, som i sin tur utløses starten av celledødsveier i disse cellene.
Inhibering av MUC1 ved siRNA resulterte i lysosomal permeabiliseringen som manifestert ved Cathepsin B frigivelse i cytosol ( EN). Tap av colocalization av Cathepsin B og Lamp2 i MUC1-forstummet celler ble observert sammenlignet med ikke-tie kontroll. Biokjemisk analyse for Cathepsin B-aktivitet i cytosol viste økt aktivitet både MUC1 forstummet celler og celler behandlet med GO-201 (B). Den celledød prosessen indusert av GO-201 ble arrestert på å bruke en Cathepsin B-hemmer CA-O74Me (C). Data er uttrykt som gjennomsnitt +/- SEM fra 3 uavhengige eksperimenter. *
P
. 0,05 (
t
test) sammenlignet med kontroller
ortotopiske musemodell for kreft i bukspyttkjertelen med ASPC-1 celler viste stor bukspyttkjertelen svulst i ubehandlet mus (A), mens GO-201 hadde svært lite ingen svulst i bukspyttkjertelen. Reduksjon av tumorvekt (C) og volum (D) ble observert etter behandling med GO-201. * Representerer p 0,05 sammenlignet med kontroller. Representative vevssnitt fra mus med bukspyttkjertelen tumor (orthotopic modell med AsPC1 celler) i kontrollgruppen farget med Ki-67 viste omfattende flekker indikerer aktivt prolifererende tumorceller (E), i forhold til mindre flekker i GO-201 lysbilder som viser tap i spredning (F). Det totale antall celler farget med Ki-67 ble regnet i minst 10 felt i både prøver og gjennomsnittlig antall prolifererende celler i begge settene ble plottet (G) *
P
0,05 (
t
test) sammenlignet med kontroller.
Hemming av MUC1 Expression i en
in vivo
Mouse Model av kreft i bukspyttkjertelen Reduserer tumorprogresjon
GO -201, et peptid inhibitor rapportert å inhibere aktiviteten av MUC1-c, er testet for tumorregresjon i en rekke kreftmodeller slik som prostatakreft, brystkreft og CML [46] – [48]. Imidlertid har sin effekt ikke testet på kreft i bukspyttkjertelen modeller. Vi brukte en orthotopic bukspyttkjertelkreft musemodell med aggressive cellelinje AsPC1 å teste effekten av GO-201. Tjue athymiske nu /nu mus ble gitt intra bukspyttkjertelen injeksjoner av 2 × 10
5 celler. Behandling med intraperitoneal GO-201 (30 mg /kg kroppsvekt) ble startet på 10 randomiserte mus, som begynner på dag 4 etter tumorcelle injeksjon. De gjenværende 10 mus ble injisert med saltvann. Forsøket ble avsluttet på dag 30 etter injeksjon av cellene. Musene ble avlivet og tumorbelastning i begge gruppene ble evaluert. På dag 30, alle salt dyrene hadde tumorer (n = 10) (fig. 5A), mens i den behandlede gruppe med n = 10 mus, bare 3 av 10 hadde tumorer (Fig. 5B). Den tumorvekt i den ubehandlede gruppe varierte 0,6 til 1,6 g, mens de behandlede gruppene hadde tumorer som veide 0,1 g 0,3 g-(fig. 5C). Den gjennomsnittlige tumorvolumet av musene i saltvann gruppen var 0,9 cm
3, mens de som ble behandlet med GO-201 hadde en gjennomsnittlig tumorvolum på 0,1 cm
3 (Fig. 5D). Den salt gruppen viste også omfattende metastatisk spredning av tumorer til en rekke organer (tabell 1). Vev fra svulstene ble farget med Ki-67 for å sammenligne spredning priser i de to gruppene. Den ubehandlede gruppen omfattende farget med Ki-67, som viser virke prolifererende celler (fig. 5E). Til sammenligning GO-201 behandlede celler farget meget svakt med Ki-67 (fig. 5F). Dette antydet at funksjonelle hemming av MUC1-c ved GO-201 resulterte i betydelig reduksjon av tumorbyrden hos mus.
Diskusjoner
Heat-sjokk (HSP) 70 proteiner fungere som ATP -avhengige anstand som regulerer folding av nyan syntetiserte proteiner, sammenstillingen av multiproteinkomplekser og transport av proteiner på tvers av cellemembraner [49]. HSP70 ofte overuttrykt i maligne tumorer, og dette overekspresjon er assosiert med en dårlig terapeutisk resultat i en rekke humane kreftformer, inkludert bryst og bukspyttkjertel [50], [37], [40], [41]. HSP70 har en markert cytobeskyttende virkning og hemmer apoptotisk signalering ved å hemme mitokondrielle permeabiliseringen, ved å redusere caspaseaktivering eller ved nøytralisering av apoptose-induserende faktorer [51]. HSP70 lokaliserer også til lysosomale membraner [52], [53], og kan beskytte lysosomale membraner mot LMP som induseres av ulike stimuli, slik som etoposid, TNF-α og oksidativt stress [54]. Vi har tidligere vist at HSP70 er overuttrykt i kreft i bukspyttkjertelen celler og at nedregulering av enten siRNA
in vitro
eller ved anvendelse av en inhibitor
in vivo
induserer caspaseaktivering og celledød ved apoptose [ ,,,0],37], [42], [55]. Dette tyder på at HSP70 er viktig for overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen celler. Mange sannsynlige mekanismer har blitt foreslått for pro-overlevelse funksjon av HSP70.
In vitro
studier har antydet at HSP70 kan forstyrre direkte med apoptose-signalering maskiner nedstrøms mitokondriene ved å hindre apoptosome dannelse og caspaseaktivering [56]. Nyere studier ved hjelp av celledøds modeller har pekt på at HSP70-mediert hemming av caspase-avhengig apoptose skjer oppstrøms av mitokondriell ytre membran permeabilization (MOMP) og cytokrom c meldingen [57], [58]. Tidligere studier fra vår gruppe foreslår også at hemming av HSP70 uttrykk ved ulike hemmere eller HSP70 siRNA fører til caspaseaktivering og apoptose, noe som tyder på at HSP70 hemmer caspase-avhengig apoptose i kreft i bukspyttkjertelen celler ved å påvirke cytosoliske kalsium reserver og forårsaker lysosomal permeabilization. Imidlertid har den molekylære mekanisme av dette fenomen vært unnvikende [37].
MUC1-c har vist seg å være et oncoprotein ansvarlig for transformasjon og tumorgenisitet i et antall kreftceller. MUC1-c spiller også en intensiv rolle i cellulær signalisering etter en rekke fosforylering arrangementer. Flere rapporter viser også en opphopning av MUC1-c i cytosol av kreftceller. Det har vist seg tidligere at MUC1-c forbinder med varmesjokkproteiner og er rettet mot mitokondrie ytre membran [33], [59]. Dermed foreligger en nær tilknytning til HSP70 og MUC1 i tumorceller.
I et forsøk på å forstå den molekylære mekanismen for celleoverlevelse og rollen til HSP70 og MUC1 i kreft i bukspyttkjertelen celler, vi så inn i foreningen av HSP70 og MUC1. Siden den dominerende funksjon av HSP70 i en hvilken som helst celle er dens anstand aktivitet, hypotese vi at HSP70 virker som en bærer av MUC1-c til forskjellige cellulære avdelinger som lysosomer og mitokondrier, noe som resulterer i beskyttelse av disse kamrene og hindrer celledød. Vår nåværende studie viste at HSP70 var assosiert med MUC1 og at det utfelles med MUC1-c (Fig. 3A). Det viste også at selv om MUC1-C ble hovedsakelig er lokalisert i cytoplasma, en betydelig mengde var også til stede i lysosomene og mitokondriene (figur 3 B, C;. Figur S2). Inhibering av MUC1-c ekspresjon av siRNA eller en inhibering av aktiviteten til ved hjelp av peptidet inhibitor GO-201 resulterte i redusert spredning og levedyktigheten av kreft i bukspyttkjertelen celler (fig. 2) og indusert caspase-aktivitet i disse celler, noe som indikerer en aktivering av apoptotiske reaksjonsveier (Figur S1). Denne hemmingen også forårsaket lysosomal permeabilization av kreft i bukspyttkjertelen celler fører til Cathepsin B utgivelse og en høy cytosolic Cathepsin B aktivitet (Fig. 4B, C). Cathepsin B-ekspresjon i celler transfektert med uspesifikk siRNA viser tydelig farging i lysosomale kamrene (figur 4 A). Denne distinkte fargemønsteret er sett til å bli spredt når cellene transfektert med Muc1 siRNA. Dette skyldes frigjøring av Cathepsin B protein i cytosol rommet som analysert biokjemisk (figur 4B). Ligner lysosomal permeabilization ble også observert da HSP70 uttrykk ble hemmet av siRNA (Figur S3). Virkningen av inhibering av MUC1 ekspresjon eller aktivitet ble sett å bli reversert når cellene ble ko-inkubert med Cathepsin B-hemmer CA-074Me. Dette indikerte at utgivelsen av Cathepsin B fra lysosomene av kreft i bukspyttkjertelen celler resulterte i å utløse celledødsveier. Tidligere rapporter fra vår gruppe viser at hemming av HSP70 av en inhibitor, enten triptolide eller quercetin, også resulterte i lignende lysosomale permeabilization og apoptotisk celledød [37]. I samme studie ble det også ses at en Cathepsin B-inhibitor var i stand til å reversere effekten av HSP70-inhibering på kreft i bukspyttkjertelen celler, noe som indikerer at lysosomal permeabiliseringen er en av de tidligere trinnene av apoptotisk død i disse cellene.
klassisk, lysosomal membran permeabilization (LMP) har vært antatt å være involvert i celledødsmekanismer, selv om den eksakte sekvensielle hendelser fra LMP til celledød ikke har blitt kartlagt. Avhengig av dødelig stimulus, omfanget av LMP, mengden og typen av Katepsiner frigjøres i cytoplasmaet, samt overflod av cathepsin-inhibitorer, kan LMP utløse en rekke dødsassosierte morfologier som strekker seg fra klassisk apoptose til nekrose. Således, LMP forbundet med Cathepsin translokasjon kan direkte aktivere calpainer og kaspaser, men LMP kan også utløse den klassiske MOMP-kaspase veien, så vel som MOMP- og caspase-uavhengig apoptose. Som dødelige trasé blir stimulert av LMP avhenger av celletype, immortalisering status og den genetiske bakgrunn av cellene.
I denne studien, foreslår en modell for celleoverlevelse i hvilken HSP70 virker som en bærer av MUC1-c ved å knytte med det fysisk og transportere den til lysosomene (og mitokondrier) i kreft i bukspyttkjertelen celler. Tilstedeværelsen av MUC1-c i lysosomene hindrer LMP og holder lysosomene intakt. Men når HSP70 eller MUC1 inhiberes enten ved siRNA eller av et peptid inhibitor av MUC1 (som hindrer aktiviteten av MUC1 og dermed dets assosiasjon med en hvilken som helst annen molekyl), beskyttelse av lysosomer er tapt, og det er utstrakt LMP, noe som fører til en frigjøring av Cathepsin B og trigging av celledød. Enten induksjon av LMP og frigjøring av Cathepsin B aktiverer flere apoptotiske veier som involverer mitokondriene må undersøkes nærmere.
Fra et klinisk perspektiv, en mer spesifikk tilnærming i å utnytte MUC1-c-mediert celle overlevelse er å utvikle terapeutiske agenter som kommuniserer direkte med MUC1-c og blokkerer dens funksjon. MUC1-c danner oligomerer gjennom CQC aminosyre motiv i sitt cytoplasmaområde, og aktivitet er nødvendig for MUC1-C atom transport [60], [61]. Peptid hemmer GO-201, som inneholder CQC motiv, har blitt utviklet og testet i en rekke kreftceller til å blokkere oligomerisering av MUC1 og dermed hemme av signalanlegget aktivitet og funksjon [18], [46] – [48]. I denne studien har vi brukt GO-201 på en orthotopic bukspyttkjertelkreft musemodell for å teste dens effekt på bukspyttkjertelen svulst. Den aggressive bukspyttkjertelkreft cellelinje AsPC1 ble brukt til å generere ortotopiske pankreatiske tumorer. GO-201 (30 mg /kg) ble injisert intraperitonealt hver dag i 26 dager, og eksperiment ble avsluttet på dag 30. Inhiberingen av MUC1 funksjon av GO-201 ble sett å forebygge tumorvekst og progresjon i behandlingsgruppen signifikant sammenlignet med den ubehandlede gruppen. I tidligere studier GO-201 har vist seg å være en spesifikk MUC1-inhibitor som ikke har noen virkning på noen annen måte enn MUC1 [47] protein. Våre tidligere studier hadde vist at ved å bruke hemmere av HSP70, kan pankreastumorer kapsles
in vivo product: [60]. I forlengelsen av disse undersøkelsene, denne studien viste også at hemming av MUC1
in vivo
kan redusere tumorbyrde i mus, og bekrefter dermed at MUC1-HSP70 foreningen er en viktig faktor i overlevelse av kreft i bukspyttkjertelen celler. Videre hemming av denne foreningen ved hemming av enten HSP70 uttrykk eller MUC1 aktivitet kan være av betydelig terapeutisk verdi i bukspyttkjertelkreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Alle prosedyrer
