Abstract
Identifisering og validering av biomarkører for kliniske applikasjoner er fortsatt en viktig sak for å bedre diagnostikk og terapi i mange sykdommer, inkludert prostata kreft. Genuttrykk profiler blir rutinemessig brukt til å identifisere diagnostiske og prediktive biomarkører eller nye mål for kreft. Men bare noen få prediktive markører identifisert
i silico
har også blitt godkjent for klinisk, funksjonell eller mekanistisk relevans i sykdomsprogresjon. I denne studien har vi brukt en bred, bioinformatikk-basert tilnærming til å identifisere slike biomarkører over et spekter av progresjon stadier, inkludert normale og tumor tilstøtende, premaligne, grunnskoler og sent stadium lesjoner. Bioinformatikk data mining kombinert med klinisk validering av biomarkører ved følsom, kvantitativ revers-transkripsjon PCR (QRT-PCR), etterfulgt av funksjonell evaluering av kandidatgener i sykdomsrelevante prosesser, for eksempel kreftcelle spredning, motilitet og invasjon. Fra 300 første kandidatene ble åtte gener valgt for validering av flere lag med data mining og filtrering. For klinisk validering, ble differensial mRNA uttrykk av utvalgte gener målt ved QRT-PCR i 197 kliniske prostata vevsprøver inkludert normal prostata, sammenlignet mot histologisk godartet og kreftvevet. Basert på QRT-PCR-resultater, var signifikant forskjellige mRNA-ekspresjon bekreftet i normal prostata versus ondartede PCA prøver (for alle åtte gener), men også hos kreft-tilstøtende vev, selv i fravær av påvisbare kreftceller, og dermed peker til muligheten av uttales feltvirkninger i prostata lesjoner. For validering av de funksjonelle egenskapene til disse genene, og for å vise sin antatte betydning for sykdomsrelevante prosesser, siRNA knock-down studiene ble utført i både 2D og 3D organotypic cellekultur modeller. Stanse av tre gener (
DLX1
,
PLA2G7 Hotell og
RHOU)
i prostata kreft cellelinjer PC3 og Vcap av siRNA resulterte i markant vekst arrest og cytotoksisitet, spesielt i 3D organotypic celledyrkningsforhold. I tillegg stanse av
PLA2G7
,
RHOU
,
ACSM1
,
LAMB1 Hotell og
CACNA1D
også medførte redusert tumorcelle invasjonen i PC3 organoid kulturer. For
PLA2G7 Hotell og
RHOU
, effekten av siRNA støydempere på spredning og celle-motilitet kan også bekreftes i 2D monolagkulturer. I konklusjonen, DLX1 og RHOU viste den sterkeste potensialet som nyttige kliniske biomarkører for PCa diagnose, videre validert av sine funksjonelle roller ved PCA progresjon. Disse kandidatene kan være nyttig for mer pålitelig identifisering av tilbakefall eller terapisvikt før de tilbakefall lokale eller fjernmetastaser
Citation. Alinezhad S, Väänänen RM, Mattsson J, Li Y, Tallgren T, Tong Ochoa N, et al. (2016) Validering av nye biomarkører for prostatakreft Progresjon ved kombinasjon av bioinformatikk, klinisk og funksjonelle studier. PLoS ONE 11 (5): e0155901. doi: 10,1371 /journal.pone.0155901
Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, USA
mottatt: 14 oktober 2015; Godkjent: 05.05.2016; Publisert: May 19, 2016
Copyright: © 2016 Alinezhad et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Marie Curie (FP-7) prostata Forskning Organisasjoner-Network of Early Stage Training (PRO-NEST, prosjekt referanse 238278) og The Academy of Finland (svulstens mikromiljø metastaser i Kastrering resistent prostatakreft, prosjektnummer 267326 til Matthias Nees og 267326 til Malin Åkerfelt). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft (PCA) er fortsatt et stort folkehelseproblem i alle vestlige land. PCa representerer den vanligste diagnosen svulst enhet etter hudkreft hos menn, og er den nest hyppigste årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA. I USA ble 233.000 nye tilfeller av PCa diagnostisert, og 29,480 mennesker døde av sykdommen i 2014 [1]. Én av syv menn kan utvikle invasiv prostatakreft i løpet av livet [1]. Målinger av serum prostata-spesifikt antigen (PSA) nivåer, etterfulgt av digital endetarms eksamen (DRE) og histologisk undersøkelse av prostata biopsi, er fortsatt de mest brukte rutinemessige diagnostiske metoder for PCa. I 1986 ble Petroleumstilsynet godkjent som en biomarkør for overvåking og oppfølging av PCA pasienter av US Food and Drug Administration [2]. Tidlige studier har rapportert en betydelig nedgang i dødeligheten av PCA pasienter [3] etter bred innføring av PSA tester for storskala befolkningen screening. Imidlertid har nyere studier vist at PSA screening kan føre til omfattende over-diagnose og kostbart overbehandling av pasienter med lat kreft [4]. Som PSA er en vev-spesifikk, men ikke cancer-spesifikk markør for prostata, forhøyede nivåer av PSA under og etter kjemoterapi eller radikal prostatektomi indikerer svikt i terapi, og tilsynelatende tilbakefall av sykdommen. Selv om en ubestridelig klinisk oppfølging markør, PSA nivåer bare stige etter PCa remisjon og når progresjon allerede har oppstått. Følgelig har PSA lite diagnostiske og praktisk talt ingen prediktiv verdi for sykdomsprogresjon for å lokal fremskreden kreft ( 10% av pasientene), eller til og med metastatisk PCa. Nylig har imidlertid et panel av fire kallikreins, i kombinasjon med PSA-hjulpet risiko lagdeling, ble vist å være nyttig for å identifisere menn i femtiårene med en sterkt øket risiko for sykdomsprogresjon og utvikling av fjernmetastaser. Dette tilveiebringer også et middel for å redusere over diagnose av sykdom lat [5]. Mer følsom, informativ, sykdoms- og kreftspesifikke biomarkører ville være nødvendig for å skille pasienter med høy risiko fra de med lat kreft eller selv premaligne forstadier. Dette kan også omfatte markører som indikerer kreft-assosiert «feltet effekter», som ble nylig beskrevet i prostatakreft [6], men har nå blitt et tilbakevendende observasjon som sannsynligvis vil bli viktig for diagnostiske formål. Vev-basert markeringspaneler kan ha potensial til å forbedre diagnostikk, noe som resulterer i mer presisjon og tidligere påvisning, eller de kan indikere hyppig observert multifokal sykdommens art [7]. Emerging anvendelser av ulike «omics «teknologier som genomikk, transcriptomics proteomikk og metabolomics har fremmet innen biomarkører betydelig. Markører som er funksjonelt involvert i ulike stadier av sykdomsprogresjon eller metastatisk spredning kanskje har høyest potensial til å kunne forutse feil av stråling og anti-hormon terapi, noe som fører til svært aggressive og metastatisk, kastrering resistent prostatakreft (CRPC). Slike mechanistically involverte markører kan ikke bare forbedre PCa ledelse i klinisk praksis; de kan også representere nye mål for terapeutisk intervensjon. I klinisk praksis, kan anvendelsen av flere prediktive, vev-baserte markører bli menings kombineres med andre høyrisiko parametere som positiv extracapsular eller sædvæske invasjon, avanserte kreft stadier ( T2C, T3 eller T4), høye Gleason karakterer ( 8), eller høy til svært høy PSA-nivå ( 20 ng /ml); og vil bli ytterligere støttet av avanserte bildeteknologier som MR.
I de senere årene har molekylære teknikker som microarray gene expression profilering og neste generasjons sekvensering (NGS) mye lettere genom-wide studier av svulst genekspresjon profiler. Følgelig microarray og NGS-baserte genuttrykk profilering har vært mye brukt for å identifisere paneler av prognostiske [8] og prediktive biomarkører, herunder slike som kan være en indikasjon for PCa tilbakefall [9,10], tidlig og sene stadier av kreft progresjon, eller feltet effekter. Identifisering av nye, informative biomarkører for lunge og tykktarmskreft ved systematisk utvinning av offentlig genuttrykk datasett som The Cancer Genome Atlas (TCGA) har blitt rapportert [11,12] andre steder. Den TCGA database inneholder mange store genuttrykkstudier basert på kliniske PCA biopsier [13,14,15], avledet fra offentlig finansiert forskning og åpent tilgjengelige datasett. Den cBio Cancer Genomics Portal [16] (https://www.cbioportal.org) er den viktigste åpen tilgang ressurs for gruvedrift TCGA kreft genomikk datasett, og arrangerer i dag mer enn 21.000 tumorprøver fra 20 forskjellige kreft enheter og 91 studier. Vi har valgt en av de største og mest omfattende av disse microarray expression studier på PCAs, utført hovedsakelig på kliniske biopsier, utført av Taylor et al. ved Memorial Sloan-Kettering Cancer Center (MSKCC) [13] i 2010. Denne studien omfatter 181 primær PCA prøver, 37 metastatisk PCA prøver, 12 PCA cellelinjer og transplantater, og 29 normale prostata vev som friske kontroller. Et stort antall av patologiske og kliniske parametere som Gleason karakterer, TNM etapper, positive kirurgiske marginer, status for lokal invasjon av kreftceller i lymfeknuter, sædblærene, eller extracapsular plass, eller fjernmetastaser er annotert. Disse parametrene er ansett mest viktig å vurdere PCa aggressivitet, og på en pålitelig måte å forutsi dårlig resultat av sykdommen. Våre konkrete mål for data mining var å utnytte en åpen, saklig tilnærming, adressering et bredt spekter av normalt vev, primære kreft, og sent stadium, avanserte lesjoner. Siden målet var ikke å forutsi klinisk utfall eller vurdere den enkeltes risiko for pasienter eller undergrupper av pasienter basert på mRNA uttrykk data, ble dataene ikke delt inn i opplæring og testsett for kryss-validering. Vi fikk heller ikke mål for evaluering av en «prediktiv markør signatur» som skal brukes på tvers av andre, uavhengige mRNA genuttrykkstudier. Kryssvalidering var derfor ikke nødvendig for å bekrefte hvordan statistisk nøyaktig et sett av prediktive biomarkører vil prestere i flere datasett. I kontrast, vårt mål var å identifisere tidligere urapporterte biomarkører og validere dem over hele spekteret av kliniske biopsier tilgjengelig fra PCa. Vår fremgangsmåte er basert på analyser av differensial mRNA-ekspresjon for identifisering av biomarkør kandidater, etterfulgt av deres eksperimentelle korrelasjon med de mest kritiske kliniske parametre i uavhengige prøvesamlinger, som var ofte av meget forskjellig opprinnelse i forhold til mikroarray data. Hovedfokus var på den funksjonelle validering av biomarkører i forhold til PCa initiering og progresjon, gjerne kombinert med å vurdere deres potensial diagnostisk verdi.
For uavhengig validering av de første funnene, utvunnet vi ekstra ressurser, for eksempel
i silico database [17]
transcriptomics (IST) (https://ist.medisapiens.com). Denne databasen inneholder mRNA genuttrykk data fra over 20.000 Affymetrix mikromatriser, som dekker 60 friske vev, 104 ondartet og 64 andre sykdomstyper. For data mining, har vi benyttet Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA), som gir genet forening og ontologi informasjon, og tillater filtrering av gener basert på funksjonelle aspekter. Sist ikke minst, vi brukte Pubmed litteratur informasjonssystem for å filtrere ut biomarkører som har gjentatte ganger blitt beskrevet før som i forbindelse med PCa. En batch-modus tekst gruvedrift verktøy (https://pmid.us) ble brukt, som tillot sca1nning gjennom hele litteraturen for mesh overskriften «prostatakreft», mot Samtidig forekomst av hundrevis av kandidatgener ført som «genet symboler». Med denne strategien, ble et sett av 300 mulige biomarkører kandidater prioritert trinnvis, ved hjelp av en kombinasjon av ulike data og tekst gruvedrift eller filtrering tilnærminger, opplyser markører som var sterkest korrelert med generelle sider ved PCa progresjon, terapi svikt, eller progresjon til metastatisk CRPC, men ikke tidligere er dekket av en stor mengde vitenskapelige rapporter. Åtte gener ble valgt for klinisk og funksjonell validering. For dette formål, kvantitativt, internt standardisert sanntid revers-transkripsjon PCR (RT-PCR) ble påført, ved hjelp av fire uavhengige vev prøvesamlinger fra radikal prostatektomi og cystoprostatectomy. Disse inneholdt normale cystoprostatectomy prøver, histologisk godartet vev fra cystoprostatectomy eksemplarer med tilfeldig prostatakreft, i tillegg til histologisk godartet vev og ondartet kreft fra radikal prostatektomi prøver.
Nylige fremskritt innen cellebiologi har tilrettelagt systema funksjonell valideringsstudier ( funksjonelle gener) av biomarkør kandidater, basert på effektive tilnærminger som små forstyrrelser RNA (siRNA eller RNAi), CRISPR /Cas9 og Talen teknologier. Av disse siRNA studier forbli de mest tilgjengelige, rimelige og raskeste teknologiene i eksperimentelle praksis, og representerer den primære tilnærmingen i funksjonelle mål validering. For å utforske funksjonelle effekter av utvalgte gener på vekst, spredning og invasive egenskapene til prostata kreft celler, ble siRNA knock-down studier for utvalgte gener utført i både 2D og organotypiske 3D-modeller (organotypiske cellekulturer) ved hjelp av dårlig invasiv Vcap og svært aggressive PC3 cellelinjene.
Materialer og metoder
analyse av genuttrykk profilering for å identifisere kandidat biomarkører
Et panel av ulike bioinformatikk for analyse og filtrering metoder ble brukt til min store -skala genuttrykk profilering datasett, og for å velge de mest informative, mulige biomarkører for prognose og /eller overvåking av sykdomsprogresjon (oppsummert i figur 1). Vi brukte Bioconductor /R-baserte data normalisering og RMA (Robust Multi-chip gjenomsnitt) pakke for behandling og normalisering av Affymetrix eksperimentsett hentet fra TCGA /cBio portal. Deretter gener ble rangert i henhold til differensial genuttrykk over de viktigste utvalgsgrupper (N, normal, T, primær PCA, og M, metastatisk PCA). For dette formålet, brukte vi flere statistiske tester for signifikans (ANOVA, t-test eller Z-score og Mann-Whitney U Test;. Og deretter filtrert kandidater ved flere testkorreksjoner (Bonferroni) Parallelt har vi brukt SAM eller » betydning analyser for Mikromatriser «program, bruk av falske Discovery Rate (FDR) kriterier for genet utvalg. Denne tilnærmingen resulterte i overlappende, tilsvar gensettene (data ikke vist). Vi begrenset vår analyse av det store MSKCC datasett (218 kreft profiler, inkludert 37 metastaser, 12 PCA-cellelinjer, og 29 normale prostata vev). Differensiell ekspresjon av hvert gen over 181 primære kreftprøvene ble sammenlignet med de 29 normale prøver (
T versus N sammenligning
). Tilsvarende, ekspresjon i 37 metastatiske prøver ble sammenlignet med de 181 primær PCA prøver (
M versus T
). Den gjennomsnittlige gangers skifte av mRNA-ekspresjon og statistisk signifikans på tvers av alle prøvene ble beregnet, og genene ble rangert i henhold til de sterkeste forskjeller i mRNA-gen uttrykk (endring, se S1 og S2-filer). Den øverste 300 treff i hver gruppe (T vs N og M vs. T) ble deretter underlagt ytterligere data filtrering: Bare de genene ble valgt for å følge opp at viste statistisk mest signifikante, robuste og reproduserbare forskjeller mellom normal, primær PCa og metastatisk PCA prøver (basert på FDR beregninger eller Bonferroni-filter). Vi har også brukt Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare verktøy for ytterligere filtrering av de opprinnelige genet lister, basert på både statistiske parametre samt funksjonell «gen ontologi» og mekanistiske pathway merknader. Vi utnyttet rangert liste over kandidater som genereres av IPA for ytterligere sammenheng med kliniske parametre (Kaplan-Meier plott), vurdering av vev-spesifikke uttrykk og litteratur tekst gruvedrift (neste avsnitt). For kreftspesifikke gener identifisert som differensielt uttrykt mellom N og T-grupper, vurdering var høyere dersom differensial mRNA genekspresjon ble også observert mellom T og M underkategorier.
For hver valgte gen, boks -plot uttrykk grafer ble generert ved hjelp av en in-house html-baserte data visualiseringsverktøy (R-kjørbar (REX)). Dette gjør at systematisk, brukerdrevet data mining av datasett i henhold til kliniske parametre (f.eks kreft undergrupper som primære vs. metastatisk kreft, lymfeknute og extracapsular invasjon, infiltrasjons av kirurgiske marginer, og fjernmetastaser). I tillegg forskjells uttrykk mellom lav (4-6), middels (7) og høy (8-10) Gleason score, eller mellom ulike stadier av sykdommen ( T2, T3 eller T4), og sykdomskategorier som primær vs. lymfeknutemetastase, ble systematisk vurdert (figur 2A). Deretter prioriteres vi gener som var spesielt, fortrinnsvis eller sterkt uttrykt i prostata sammenlignet med alle andre menneskelige vev, inkludert andre tumor enheter. For dette formål ble vevsspesifikke ekspresjon score gitt ved IST elektronisk database som brukes (fig 2C). Vevet spesifikke uttrykk score og box-plot uttrykk grafer for andre utvalgte gener er oppsummert i S3 fil.
A) Dot plottet graf som viser sammenhengen av mRNA genuttrykk av CACNA1D i normale og kreftprøver med et panel av de mest informative klinisk-patologisk parametere. B) Kaplan- Meier analyser, som viser korrelasjonen av høye nivåer av mRNA-ekspresjon av CACNA1D med redusert total overlevelse analyse for PCA pasienter. C) Relativ ekspresjon av CACNA1D på tvers av et panel av 60 + normale og kreftrelaterte humane typer vev og sykdommer.
Deretter adressert vi klinisk resultat, men benyttet andre datasett i tillegg til MSKCC microarray data. For hver valgte gen, en Kaplan-Meier pasient utfallet tomten basert på en uavhengig, storskala klinisk studie med offentlig tilgjengelige data [15] ble generert. For dette formålet, fokuserte vi på total overlevelse og sykdomsfrie intervaller, ved hjelp av ikke-parametrisk statistikk som diskriminerer pasientoverlevelsesfunksjoner fra kliniske levetidsdata (Fig 2B). Siden ca 85-90% av pasientene selv med lokalavansert PCa viser langsiktig overlevelse ( 5 eller 10 år) og for det meste god klinisk utfall, og bare 10-15% av disse pasientene videre til CRPC, har vi valgt tilsvarende tall også for Kaplan-Meier-analyser. Følgelig ble 85% av pasientene gruppert i «lav risiko /god klinisk utfall» kategori, sammenlignet med 15% av høyrisikopasienter som pågår til avansert PCa.
Til slutt, for å prioritere nye kandidat biomarkører for påfølgende funksjonell og klinisk validering, vår liste over biomarkør kandidater ble filtrert mot hele PubMed litteraturdatabase. Samtidig forekomst av kandidat genet navn og Hugo symboler med begrepet «prostatakreft» i PubMed database oppføringer ble screenet systematisk, ved hjelp av Pubmed batch-søkeverktøy (https://pmid.us). Gener som ble nevnt mer enn fem ganger i indekserte vitenskapelige publikasjoner ble automatisk ekskludert som «tidligere beskrevet i detalj» (Status for litteratursøk: September 2012). Disse siste filtrering skritt førte til åtte gener for eksperimentell validering. Genuttrykk plott fra IST database og prikkplotter fra MSKCC datasettet er oppsummert i S3 fil. Vi forsøkte å identifisere og bekrefte generelle PCA-spesifikke biomarkører (diagnostiske markører), inkludert biomarkører som kan tyde på tidlig og multifokale sykdomsstadier eller «felt effekter». I tillegg ønsket vi å validere potensielle PCA progresjon markører (prognostiske markører) som kan indikere utvikling av tilbakefall, CRPC og metastatiske lesjoner etter behandling fiasko.
Vevsprøver for klinisk biomarkør validering
etikkomiteen av Hospital District of Egentliga Finland godkjent studieprotokollen. Det var i samsvar med Helsinki-deklarasjonen av 1975, revidert i 1996, med skriftlig informert samtykke innhentes fra hver deltaker. To uavhengige sett med prostata-relaterte vevsprøver ble anvendt for klinisk validering. Det første settet besto av 180 prostata vevsprøver hentet fra totalt 90 primær PCA pasienter operert ved radikal prostatektomi (RP) i Åbo universitetssykehus (TYKS). Fra 90 pasienter, hadde bare to pasienter fikk HRH-analoger før operasjonen som preoperativ behandling. Fra hver prostata ble to vevsprøver tatt. En ble avledet fra den antatte kreft område, den andre fra det tilstøtende området, mistenkt for å være gunstige. Den histo-patologiske av halvparten av hver vevsprøve ble undersøkt ved TYKS patologer, mens den andre halvparten ble umiddelbart lagret i guanidin-isotiocyanat (GITC) buffer for RNA-ekstraksjon. Undersøkelse viste at for 30 av pasientene, begge prøver ble tatt fra godartet området; for 15 pasienter, ble begge prøver tatt fra kreft området; og for 45 pasienter, ble en prøve tatt fra godartede og den andre fra kreft-området (som opprinnelig var ment). Bare to prøvene som trengs for å bli ekskludert på grunn av tekniske problemer med RNA ekstraksjon. Til slutt ble 178 prøver (104 godartede prøver og 74 kreftprøver) igjen for analyse av genuttrykk ved QRT-PCR. De kliniske og patologiske trekk ved alle 90 PCA tilfeller er presentert i tabell 1.
Den andre kohorten inkluderte 19 prostata vevsprøver, hentet fra pasienter med blærekreft uten kliniske symptomer på PCa. Disse ble operert av cystoprostatectomy (CP) ved Skåne universitetssykehus i Malmö, Sverige. Erfarne patologer, ved hjelp av den samme protokoll som tidligere er beskrevet for de RP prøvene undersøkt alle prostata prøver. 12 av de 19 prostata prøvene i denne samlingen hadde tilfeldige PCa (IPCA), mens sju var fri for enhver påviselig carcinoma foci. I tilfelle av IPCA, ble vevsprøver for genekspresjon analyse tatt fra godartet området.
Ekstraksjon og revers transkripsjon av RNA
ekstraksjon av RNA fra vevsprøver er tidligere blitt beskrevet [18] . Kort fortalt ble RNeasy Mini Kit (Qiagen, Tyskland) brukes i henhold til produsentens instruksjoner. I løpet av RNA-ekstraksjon, og etter den innledende cellelysetrinn, en kjent mengde av RNA fra en kunstig mutert
KLK3
genet, betegnet mmPSA, ble tilsatt til prøven som en intern kontroll, og for absolutt mengdebestemmelse av ekspresjonsnivåer. Kvaliteten av mRNA som ble oppnådd ble bekreftet ved agarosegelelektroforese, og den endelige RNA-konsentrasjonen ble målt ved hjelp av et Nanodrop spektrofotometer N2000 (Nanodrop Technology, LTD Lab). Omvendt transkriberes cDNA ble generert ved hjelp av High Capacity cDNA Arkiv Kit (Applied Biosystems, USA), etter produsentens anvisninger.
kvantitativ real-time RT-PCR
Vår tidligere beskrevet protokollen [19] for hydrolyse med forbedret selvlysende chelat kjemi, basert på tids-oppløst fluorometri, ble brukt også her for kvantitativ sanntids RT-PCR. For hvert gen, et par spesifikke primere, og matchende reporter og drikk prober ble designet og kjøpt fra Thermo Fisher (Tyskland) (S1 tabell). For å markere reporter sonder effektivt med en nonadentate europium chelat, var en tidligere beskrevet prosedyre [20] brukt. Sanntids PCR ble utført i et totalvolum på 25 ul, inneholdende 2,5 ul templat cDNA med Hotmaster
™ Taq DNA-polymerase (5 Prime, Tyskland) eller AmpliTaq
® Gold-DNA-polymerase (Applied Biosystems, USA) . Prøvene ble kjørt i tre paralleller. For å korrigere for eventuell RNA-degradering og mengden av RNA tapt under ekstraksjon og revers transkripsjon, det oppnådde transkripsjon nivå data må være normalisert. Rengjøring gener (f.eks
GAPDH
) antas å bli transkribert på et konstant nivå i ulike vev og i alle forhold, og er mye brukt for normalisering av RT-PCR resultater i forhold kvantifisering metoder [21]. Imidlertid har påliteligheten av husholdningsgener for normalisering ofte blitt avhørt på grunn av ustabilitet deres under lagring og inkonsekvent uttrykk endringer i ulike sykdomstilstander [22,23]. Tilsetning av en fast mengde av en kunstig RNA, som ikke uttrykkes i prøvene iboende som intern referanse RNA i prøvene (før ekstraksjon) er ansett som mer pålitelig alternativ for å normalisere [24,25]. I denne studien har vi tatt fordelene ved å bruke kunstig RNA (mmPSA) for normalisering og fordelene ved å bruke prober merket med lantanidforbindelser -chelatene stedet for TaqMan prober, som gjør tids løst fluorometri for QRT-PCR-analyser.
Statistiske analyser
For QRT-PCR-analyser, ble prøvene positiv hvis alle tre gjentak var over den laveste analysen deteksjonsgrensen (LDL). Den absolutte, numeriske mengde av genekspresjon for hvilket som helst gen av interesse ble beregnet ved hjelp av intern standardverdier, normalisert av mengden av total RNA brukes i disse assays. For å teste forskjeller i transkripsjonsnivåer av kandidatgener mellom sak og kontrollprøver samt mellom ulike prøvekategorier, ikke-parametrisk Mann-Whitney
U
test ble brukt. For å evaluere ytelsen til hver kandidat-gen i en diagnostisk omgivelser, ble en mottaker-drift karakteristikk (ROC) kurve analyse utført og arealet under kurven (AUC) som brukes til å vurdere sensitivitet og spesifisitet av analysene. Å identifisere sammenslutning av mRNA transkripsjonsnivåer av en bestemt kandidat gen med tumorprogresjon (målt som PSA tilbakefall på klinikkene), den RP prøvene ble delt i to grupper, som gjenspeiler PSA tilbakefall og ingen tilbakefall, henholdsvis; i henhold til kliniske oppfølgingsdata. Noen sammenheng mellom kandidat genuttrykk nivåer og kliniske eller patologiske parametere som Gleason grad, Gleason score, andelen av kreft versus stromale celler i vev biopsi, og klinisk T kategori (T-stadium) ble adressert av ikke-parametrisk Mann-Whitney
U
test, for å identifisere statistisk signifikante forskjeller (p 0,05). Statistiske analyser ble utført med SPSS programvare, versjon 22 (IBM, USA).
Funksjonell genet knock-down studier med sirnas
PC-3 androgen-uavhengig menneskelige prostata kreft celler fra ben- metastasert prostata adenokarsinom ble anskaffet fra ATCC (USA) [18] og dyrket i RPMI-1640 medium ved 37 ° C i cellekulturbetingelser standard (95% luftfuktighet og 5% CO2). For siRNA knock-down studier, ble totalt 31 forskjellige siRNAs bestilles fra Qiagen (Tyskland) (tre forskjellige siRNAs for
ACSM1 Hotell og fire forskjellige sirnas for hver av de andre sju gener). Vi har benyttet flere PCA-cellelinjer, blant annet PC-3, VCap og LNCaP-celler, for disse funksjonelle valideringsforsøk. For å oppnå en mest mulig effektiv knock-down for hvert gen ble flere sirnas testet både enkeltvis så vel som i sammenslåtte blandinger inneholdende alle de tre eller fire sirnas ved like konsentrasjoner. Allstars Hs celledød kontroll siRNA (Qiagen, Tyskland) ble brukt som en positiv kontroll for å anslå effektiviteten av transfeksjon i hvert eksperiment. De sirnas ble forhåndslastet inn i brønner, Hiperfect transfeksjon middel (Qiagen, Tyskland) i Opti-MEM-medium (Invitrogen, USA) ble tilsatt, og inkubert i 15 minutter ved romtemperatur. Til slutt, 2.000 til 5.000 PC-3, LnCap eller VCap-celler ble tilsatt i hver brønn. De endelige konsentrasjoner av siRNA og Hiperfect i hver reaksjon ble 4 nM og 8 nM, respektivt. For å evaluere effektiviteten av RNA-interferens for hvert gen med de forskjellige sirnas, ble total RNA ekstrahert fra transfekterte celler fem dager etter transfeksjon siRNA og spesifikk mRNA ekspresjon av målgener ble målt ved QRT-PCR. Å velge disse siRNA-molekyler som resulterer i den mest effektive knock-down ble det normaliserte uttrykk verdier for hver behandlet prøve dividert med ekspresjonsnivået av kandidat-gen i ubehandlede kontrollceller ( «kryptert kontroll»). For å utelukke eventuelle effekter av denne prosedyren på mål genuttrykk ble mock-transfektert celler (med bare transfeksjon middel) inngår som en andre kontroll.
Fluorescent analyser for å måle apoptose og veksthemming av Vcap organoids etter siRNA transfeksjon
Vcap celler unnlatt å vokse i 3D-forhold, hvis direkte innebygd i Matrigel eller kollagen kulturer. Derfor ble VCap-celler transfektert med sirnas som beskrevet for PC3. Deretter ble transfektert VCap-celler dyrket i rundbunnede plater. Cellene ble tillatt å aggregere og danne sfæroider i syv dager etter transfeksjon. Et lite antall kuler (1-6) ble overført til 3D-kultur plate brønner. Slike Vcap organoids viste noen fenotypiske effekter, men vises endret organoid vekst og ulike nivåer av apoptotiske, døde eller døende celler i 3D kultur i respons til sirnas, og dermed ble ansett informativ. Celleviabilitet ble bestemt med CellTiter-Glo analysen i henhold til produsentens instruksjoner (Promega, USA). I korthet ble CellTiter-Glo buffer og frysetørket substrat kombinert, 100 ul av nevnte oppløsning ble tilsatt til hver prøve brønn og platen blir ristet i 30 minutter. Den luminescens som resulterer fra cellelyse, og som er proporsjonal med mengden av adenosintrifosfat (ATP), ble målt med en EnVision multilabel plateleser (Wallac, Finland). Videre har NucView caspase 3/7 analyse blitt benyttet som detekterer celler som gjennomgår aktivt programmert celledød (beskrevet i detalj i [26,27,28].
2D cellemigrering og invasjon assay
Den invasive eller vandrende potensialet i PCA celler ble undersøkt med en «scratch sår» eller sårhelende analysen utført i 96-brønners ImageLock plater (Essen Bioscience, USA). Begge Vcap og LNCaP cellene manglet invasive eller bevegelige egenskaper i 2D eller 3D-betingelser. Disse cellelinjene viste ikke lukking av sår egenskaper, og var ikke nyttige i bunnen av viklede analyser. av denne grunn, vi brukte PC3-celler, noe som også uttrykkes syv av de åtte kandidat gener ved betydelige nivåer, var lett å transfektere etter
