Abstract
Bakgrunn
Antall pasienter med livmorkreft (EmCa ) med avansert stadium eller høy histologisk grad er økende, og prognosen har ikke bedret for det siste tiåret. Det er et presserende behov for oppdagelsen av nye molekylære mål for diagnose, prognose og behandling av EmCa, som vil ha potensial til å forbedre den kliniske strategi og utfallet av denne sykdommen.
Metode og resultater
Vi brukte en «drill-down» proteomikk tilnærming for å lette identifisering av nye molekylære mål for diagnose, prognose og /eller terapeutisk intervensjon for EmCa. Basert på peptid ioner identifisert og deres oppholdstider i første LC-MS /MS-analyse, ble en utelukkelse liste generert for senere iterasjoner. Totalt 1529 proteiner har blitt identifisert under Proteinpilot® 5% grensen for feil fra de syv sett med iTRAQ eksperimenter utført. I gjennomsnitt, den andre iterasjon lagt 78% nye peptider til de som er identifisert etter første løp, mens den tredje iterasjon lagt 36% ekstra peptider. Av de 1529 proteiner identifisert, bare 40 tilfredsstilte kriteriene for betydelig differensial uttrykk i EmCa i forhold til normale proliferativ vev. Disse proteinene inkludert metabolske enzymer (pyruvat kinase M2 og laktat dehydrogenase A); kalsiumbindingsproteiner (S100A6, calcyphosine og calumenin), og proteiner som er involvert i regulering av inflammasjon, proliferasjon og invasjon (annexin A1, interleukin enhancer-bindende faktor 3, alfa-1-antitrypsin, makrofag capping protein og cathepsin B). Network analyser avslørte regulering av disse molekylære mål av c-myc, HER2 /neu og TNF-alfa, noe som tyder på intervensjon med disse banene kan være en lovende strategi for utvikling av nye molekylære målrettet terapi for EmCa.
Konklusjoner
Våre analyser viste betydningen av drill-down proteomikk tilnærming i kombinasjon med iTRAQ å overvinne noen av begrensningene i dagens proteomikk strategier. Denne studien førte til identifisering av en rekke nye molekylære mål som har terapeutisk potensiale for målrettet molekylære terapi for livmorkreft
Citation. Voisin SN, Krakovska O, Matta A, Desouza LV, Romaschin AD, Colgan TJ, et al. (2011) identifisering av nye molekylære mål for livmorkreft med drill-down LC-MS /MS Tilnærming med iTRAQ. PLoS ONE 6 (1): e16352. doi: 10,1371 /journal.pone.0016352
Redaktør: Yang Cai, The Research Institute for Children, USA
mottatt: 24 august 2010; Godkjent: 20 desember 2010; Publisert: 31 januar 2011
Copyright: © 2011 Voisin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Støtten av den kanadiske Cancer Society Research Institute (tidligere National Cancer Institute of Canada) er takknemlig anerkjent. AB SCIEX gitt infrastruktur og reagenser støtte av denne forskningen; Ajay Matta er mottaker av en MITACS Akselerer Fellowship, Ontario, Canada. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer. AB SCIEX gir infrastruktur og reagenser støtte av denne forskningen, men har ingen redaksjonell innspill til dette manuskriptet. Videre betyr dette ikke endre forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Livmor karsinom (EmCa) er den fjerde mest utbredte kreftform hos kvinner i nord-Amerika, med 42160 nye tilfeller og 7780 dødsfall ventet i år i USA alene [1]. Det er to hovedtyper av livmorkreft: Type I EmCa av endometrioid histologi og Type II EmCa som er serøs eller klart celle i morfologi, den sistnevnte typen vanligvis å være mer aggressive av de to. Type I EmCa er den vanligste formen for endometrial cancer, som utgjør omtrent 70-80% av det totale antallet tilfeller [2], [3]. Diagnosen er hovedsakelig basert på histologisk undersøkelse av vev som oppnås etter en biopsi, en invasiv prosedyre vanligvis utføres som en følge av undersøkende diagnose på unormal livmor blødning på presentasjonen. Endometrial carcinoma har primært vært behandlet ved hjelp av kirurgi med ekstra stråling og /eller kjemoterapi, og relativt gode resultater er oppnådd forutsatt at kreft oppdages tidlig. Imidlertid er antallet pasienter med EmCa i et avansert stadium eller høy histologiske grad, noe som er en indikasjon på en dårlig prognose, øker [2], [4]. Det er et presserende behov for oppdagelsen av nye molekylære mål for diagnose, prognose og behandling av EmCa, som vil ha potensial til å forbedre den kliniske strategi og utfallet av denne sykdommen.
Nylig har det vært intense interesse for studiet av global protein uttrykk, og proteomikk tilnærminger synes å presentere en ny strategi for kreftforskning og identifisering av nye biomarkører for klinisk anvendelse. Tallrike proteomikk studier foretatt de siste årene har forsøkt å oppdage potensielle kreft biomarkører gjennom differensial protein screening ved hjelp av kreft og ikke-kreft vev [5] – [9]. En av de mest anvendte teknologier for biomarkører er en bottom-up tilnærming som involverer kjemisk merking av peptider som følge av enzymatisk spalting av prøveproteiner, etterfulgt ved blanding av kontroll- og testprøver før væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC- MS /MS-analyse) for å sikre identisk behandling av prøvene [6], [7], [9]. Blant de vanligste av disse merke reagenser i bruk i dag er de isobariske koder for relativ og absolutt kvantifisering (iTRAQ) [10]. Merking gjør det mulig å skille fra ellers identiske peptider som stammer fra individuelle prøver i blandingen via rapportør ioner som dannes fra disse koder, som tillater relativ kvantifisering av den gitte peptidet i prøvene, og derved det tilsvarende protein. På grunn av kompleksiteten av vevsprøver, blir en pre-fraksjonering av prøvene ved bruk av sterk kationbytter (SCX) typisk utført, forut for analytisk separasjon på en nanoskala reversfase (RP) kolonne, som er koplet nettet med massespektrometer. Til tross for denne to-dimensjonale kromatografisk separasjon, er det fortsatt en tendens til at et stort antall peptider til co-elute under RP separasjonen på grunn av prøven kompleksitet. Som et resultat, er det massespektrometer vanligvis bare i stand til å undersøke en fraksjon av peptidene på grunn av tidsbegrensninger. I et automatisert datainnsamlings, tenderer MS programvare for å favorisere analyse av de mest tallrike peptider på bekostning av co-eluering peptider med lavere abundances. Som mange kreftrelevante proteiner, inkludert signalering og regulatoriske proteiner, vanligvis uttrykt i lave konsentrasjoner, dette nedenfra og opp, har en tendens hagle tilnærming å gå glipp av å anskaffe den mest verdifulle informasjonen [11]. En mulig løsning på dette problemet er en iterativ analyse av samme prøve, kombinert med en utelukkelse liste over identifiserte peptider som er generert etter hvert løp, og brukes til å informere om valg av ioner som er målrettet for MS /MS-analyse ved senere kjøringer. Denne strategien tvinger massespektrometer å målrette nye, mindre rike peptider for MS /MS analyse under hver påfølgende iterasjon. Varianter av denne tilnærmingen er rapportert for matrise-assistert laser desorpsjon /ionisering (MALDI) MS /MS og ESI-MS /MS [12], [13].
I studien brukte vi en iterativ analyse , omtalt heri som «bore ned approach», for å lette identifisering av nye molekylære mål for diagnose, prognose og /eller terapeutisk intervensjon for endometrial cancer. Hovedmålet med denne drill-down metoden er å grave opp flere peptider. Etter den første LC-MS /MS-analyse, ble de identifiserte peptid ioner og deres oppholdstid lagt for å generere en ekskluderingsliste for ytterligere gjentakelser i LC-MS /MS-analyse. Vår tilnærming er konseptuelt lik den «selektiv forløperion ekskludering» (sel-PIE) metoden beskrevet tidligere av Wang
et al.
[11]. Så vidt vi vet er dette første gang at en slik kombinasjon av protein kvantifisering ved hjelp iTRAQ merking og iterativ analyse tilnærming har vært brukt for oppdagelse av kreft biomarkører.
Resultater
Identifisering av proteiner ved hjelp av iterative analyse med iTRAQ
det er totalt 1529 proteiner har blitt identifisert av Proteinpilot® på et konfidensintervall på 95% fra de syv sett med iTRAQ eksperimenter utført i denne studien. Den første kjøring av alle fraksjoner identifisert i alt 1137 ikke-redundante proteiner, med den andre og tredje gjentagelser bidrar de gjenværende 392 ikke-redundante proteiner. I gjennomsnitt, den andre iterasjon tilsatt 78% nye peptider til de som er identifisert etter den første kjøring, mens den tredje iterasjonen tilsatt 36% flere peptider som vist i Figur 1 og Tabell 1. Innenfor et gitt sett, ca. 12% av peptidene var vanlige til eventuelle to etterfølgende iterasjoner; imidlertid ble bare 3 til 6% av peptidene identifisert i alle de tre iterasjoner. Som forventet, disse ytterligere peptider forbedret dekning av identifiserte proteiner. Faktisk er den andre iterasjon tilsatt 34% nye proteiner i gjennomsnitt, mens den tredje iterasjon tilsettes bare 14% til den kombinerte listen fra iterasjoner 1 og 2; dermed var det lite insentiv til å utføre ytterligere gjentakelser. 40% av proteinene som er identifisert i løpet av første løp ble også identifisert i løpet av de neste to iterasjoner (tabell 1). Av de 1529 proteinene, 623 ble identifisert ved et enkelt peptid; 423 av dem viste ≥99% konfidensielt. De resterende 906 proteinene ble identifisert i gjennomsnitt med seks peptider per protein, vurderer bare peptider med ≥95% tillit score. Av de 1529 proteiner identifisert i denne studien, 1260 proteiner (dvs. 82%) hadde iTRAQ forholdstall rapportert for EmCa vevsprøver. En fullstendig liste over de identifiserte proteiner og deres gjennomsnitts iTRAQ forholdstall er tilgjengelig i tabell S1. En kakediagram som viser fordelingen i cellulære funksjoner av disse proteinene er vist i figur 2.
I gjennomsnitt, den andre iterasjon lagt 78% nye peptider til de som er identifisert etter første løp, mens den tredje iterasjon lagt 36% flere peptider. Innenfor et gitt sett, ca. 12% av peptidene var felles for hvilke som helst to suksessive iterasjoner; men ble bare 3-6% av peptidene identifisert i alle tre iterasjoner.
Identifikasjon av forskjellig uttrykt proteiner i EmCa
For å kunne analysere ulikt uttrykte proteiner som kan tjene som potensielle molekylære mål for evaluering av diagnose og /eller prognose av EmCa, alle proteiner (n = 1529) identifisert i denne studien ble evaluert ved hjelp av kriteriene som er beskrevet i Materiell og amp; § metoder. En liste over 40 proteiner som kan tjene som potensielle biomarkører for EmCa er vist i tabell 2. Av disse 40 biomarkør kandidatene, 38 ble identifisert med et minimum av to peptider. De to unntak (S100 kalsium-bindende protein A6 og beta-2-glykoprotein 1) ble inkludert som de ble identifisert av et peptid med ≥99% i tillit, og manuell inspeksjon viste utmerket MS /MS spektral kvalitet (Tall S1 og S2) . Individuelle iTRAQ verdier for protein kvantifisering er oppført i Tabell S2A; en liste over alle identifiserte peptider med en Proteinpilot konfidensnivå ≥95% er tilgjengelig i Tabell S3. Tabell S4 viser gjentakelser i analysen hvor proteiner i tabell 2 ble kvantifisert. Som EmCa og normal proliferative vev ble oppnådd fra forskjellige individer, og ble derfor ikke identisk (dvs., ble analysene ikke replikerer), typisk konseptet med standardavvik i kvantitativ analyse, kan være misvisende som et mål for analysekvalitet. Vi har derfor valgt å uttrykke fordelinger av kombinert analytisk og individuell variasjon på følgende måte: i våre analyser, 28% av individuelle iTRAQ verdier avviker innenfor ± 10% av sine midler, 54% innenfor ± 20%, og 88% innenfor ± 50% (se tabell S2B for detaljer). Disse fordelingene er til støtte for vår hypotese om at en 50% endring i iTRAQ forholdstall er et tegn på differensial uttrykk. Faktisk, identifiserte vi en gruppe på 16 ekstra proteiner som bare tapte cutoff av våre kriterier for dette uttrykket, og som kan likevel kvalifisere etter inkludering av flere prøver (Tabell 3).
Evaluering av diagnostiske potensialet ulikt uttrykte proteiner i EmCa
Andre parametre som er relevante for diagnostiske potensialer ble også vurdert. Disse inkluderer positive prediktive verdier (PPVs) og områder under kurven (AUC) er tilgjengelig fra mottakeroperasjonelle egenskaper (ROC) analyse. Verdier for de enkelte biomarkør kandidatene er oppført i tabell 2.
Verifisering av differensial uttrykk av proteiner i EmCa vev
overekspresjon av utvalgte biomarkører kandidater: cathepsin B, calumenin, S100A6, laktat dehydrogenase A (LDHA), og HNRNPA1 i EmCa vev ble bekreftet ved Western blot analyser i et undersett av de samme vevsprøver som brukes for iTRAQ LC-MS /MS. Figur 3 viser en sammenligning av fire EmCa vev (T) med fire normal endometria (N) for de fem biomarkør kandidater med β-actin tjener som en lasting kontroll. Videre analyser immunohistokjemisk i et uavhengig sett av vevsprøver (n = 5 hver) viste intens cytoplasmiske og /eller nukleær farging av S100A6 proteinet i tumorceller endometrioid EmCa vevssnitt (typiske resultater er vist i figur 4), mens ingen signifikant immunofarging ble observert i epitelceller hos normale proliferative endometria.
Like mengder av proteiner (50 ug /spor) ble løst i 10% natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgel og deretter elektro-overført på polyvinyliden-difluorid (PVDF) membran. Etter blokkering, ble blottene inkubert med respektive mus monoklonalt antistoff med passende fortynninger ved 4 ° C O /N. Membranene ble inkubert i 2 timer ved romtemperatur med sekundært antistoff. Proteinbånd ble oppdaget av den forbedrede chemiluminescence metoden (GE Health Care) på Kodak Hyper. Western blot analyse viste at i løpet av ekspresjon av (i) S100A6, (ii) calumenin, (iii) cathepsin B, (iv) laktatdehydrogenase A (LDHA), og (v) heterogent protein A1 (HNRNPA1) i endometrial kreft vev (T1, T2, T3 og T4) i forhold til normal endometrium (N1, N2, N3 og N4). β-actin fungerte som en lasting kontroll viser like proteinmengder i hvert kjørefelt.
Immunhistokjemisk analyse av S100A6 protein ble utført i uavhengige parafininnstøpte vevssnitt av livmorkreft og normal endometrium (n = 5 hver) som beskrevet i Materialer og Metoder. Panel viser (a) ingen farging av S100A6 protein i normal endometrium; (B) livmorkreft viser cytoplasma uttrykk for S100A6 protein; og (c) negativ kontroll viser ingen uttrykk av S100A6 protein.
Nettverksanalyse
Vi utførte Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å generere nettverk viser direkte og indirekte forskrifter /interaksjoner mellom proteiner identifisert i denne studien. Disse nettverkene viser involvering av nøkkelspillere, inkludert TNF alfa, NFKB, c-myc, HER2 /Neu, β-catenin, og ERK1 /2 proteiner som regulerer betennelse, og overlevelse og proliferasjon av tumorceller (figur 5). De fleste av de molekylære mål som er identifisert i denne studien er regulert av c-myc, Her2 /neu, og TNF α, kan således antyder intervensjon av disse reaksjonsveier tilveiebringe et middel til utviklingen av molekylære målrettet terapi for endometrial cancer.
De potensielle nye molekylære mål identifisert i denne studien ble utsatt for pathway analyser med Oppfinnsomhet Pathways Analysis (IPA) programvare, versjon 7.5. Figuren viser direkte (dristige linjer) og indirekte (stiplede linjer) forskrifter (→) /interaksjoner (-) blant de biomarkører identifisert i denne studien og andre betydelig forbundet proteiner. Disse nettverkene avslører involvering av viktige proteiner inkludert TNFa, NFkB, c-myc, HER2 /Neu, β-catenin, JNK og ERK1 /2 proteiner som regulerer betennelse, overlevelse og spredning.
Diskusjoner
det har vært stor fersk interesse for identifisering av potensielle kreft markører for diagnose og prognose via differensial proteomikk analyse. De ulike problemstillinger, fallgruver og suksesser av disse proteomikk-baserte biomarkører studier har vært diskutert og gjennomgått [14] – [17]. Vår undersøkelse førte til identifisering av 40 proteiner som viser betydelig differensial-ekspresjon i EmCa i sammenligning med normale proliferative vev. Disse proteinene inkluderer metabolske enzymer [pyruvat kinase M2 (PKM2) og laktat dehydrogenase A (LDHA)]; kalsiumbindende proteiner (S100A6, calcyphosine og calumenin); og proteiner involvert i regulering av betennelse, spredning og invasjonen [annexin A1 (ANXA1), interleukin Enhancer bindende faktor 3 (ILF3), alfa-1-antitrypsin (AAT), makrofag capping protein (CAPG) og cathepsin B]. Flere rapporter har vist påvirkning av østrogenreseptor (ER) og p53 på ekspresjon av disse proteinene, noe som tilsier prøvinger av disse observasjoner i EmCa vev på en større skala. Blant de proteinene som er identifisert i denne studien, har vi tidligere rapportert endret uttrykk for AAT, CAPG, pyruvat kinase M1 /M2, og creatinase kinase B. To av disse proteinene (pyruvat kinase M2 og creatinase kinase B) er tatt med her for vurdering, som ekstra manuell undersøkelse av dataene viste at mens uttrykk ratio endringer for disse to proteinene var i underkant av 50% (pyruvat kinase M1 /M2, 1,43, og creatinase kinase B, 0,69), gjorde de møter de to andre kriteriene (se Materialer og metoder). Videre en uavhengig studie ved hjelp av immunhistokjemi på en vev microarray (n = 148 pasienter) båret av vår gruppe demonstrerte den bemerkelsesverdige potensialet i AAT og PKM2 som diagnostiske biomarkører for EmCa [18] – [20]. Det er bemerkelsesverdig at økt mengde av tumor PKM2 har også blitt rapportert i tumorceller og EDTA-plasma av pasienter med kreft i nyre, lunge, bryst, cervix og mage- og tarmkanalen, så vel som i avføringsprøver fra pasienter med kolorektal og magekreft [21]. Således kan PKM2 fungere som en generell indikator for maligne tilstander stedet for å være spesifikke for EmCa. Denne forening med tumorgenese generelt er kanskje forståelig i lys av PKM2 funksjon [21]. Bryteren til M2 isoform av pyruvat kinase i tumorceller er nødvendig for å indusere Warburg effekten. Øket ekspresjon av PKM2 bidrar til en metabolsk miljø som er mottagelig for celleformering i henhold til hypoksiske betingelser og fremmer tumorcellevekst [22], [23]. Således PKM2 fungerer som en metabolsk sensor, som tillater tumorcelle for å tilpasse dets metabolisme til variasjoner i tilførselen av næringsstoffer. Interessant, LDHA viste også overekspresjon i EmCa vev i denne studien, og PKM2 er kjent for å selektivt transporterer pyruvat til laktat dehydrogenase [24]. Tyrosinfosforylering av laktatdehydrogenase forenkler proteinbinding til PKM2, for derved å kanalisere produktet fra pyruvat kinase til laktat [25]. Dette hjelper på å generere nikotinamidadenindinukleotid (NAD
+) som kreves for å opprettholde høy glycolytic flux i tumorceller. Denne metabolske konvertering gjør glykolyse selvforsynt, så lenge forhøyet glukoseopptak er gjennomførbart. En høy glycolytic hastighet gir syntetiske mellom raskt voksende kreftceller, som kreves for å gjenskape celle biomasse og genom ved hver celledeling [24], [26].
En annen viktig gruppe proteiner funnet å bli deregulert i EmCa vev omfatter fire kalsiumbindende proteiner: S100A6, calcyphosine (CAPS), calumenin (Calu), og annexin A1 (tabell 2). S100A6 er hovedsakelig et cytoplasmisk protein, men i nærvær av Ca
2+, det kan assosiere med plasmamembranen og den nukleære konvolutten. Vår immunhistokjemisk analyse viste cytoplasma og /eller kjernefysiske farging av S100A6, hovedsakelig i tumorceller av endometrioid EmCa. Det er videre støttet av nærværet av S100A6 proteinet i cytoplasma og kjerner av lunge, hud, og bukspyttkjertel ductal adenokarsinom-celler [27] – [29]. S100A6 spiller en viktig rolle i cytoskeletal omorganisering, invasjon, overlevelse og spredning ved å regulere funksjoner av flere molekylære mål, inkludert p53, β-catenin, annexins, tropomyosin, calponin, calcyclin-bindende protein /Siah-en-samspill protein (CacyBP /SIP ), og HSP90 /Hsp70 organiserende protein (Hop) [30] – [33]. Overekspresjon av S100A6 har vært assosiert med dårlig prognose i lunge, mage og bukspyttkjertel [27], [31], [33]. Av de fire Ca
2 + regulatoriske proteiner som finnes å være uttrykt forskjellig i denne studien, bare calcyphosine har tidligere blitt rapportert å være assosiert med dårlig prognose i EmCa pasienter [34]. Annexin A1 (ANXA1), funnet å være overuttrykt i EmCa vev i denne studien, er en endogen anti-inflammatorisk protein. Annexins er en familie av Ca
2 + /lipid-bindende proteiner som er involvert i forskjellige cellulære funksjoner, for eksempel membran aggregering, inflammasjon, fagocytose, proliferasjon, apoptose og [35]. Sammen tyder disse resultater på at kalsium-fosfatidylinositol og cykliske AMP kaskader kan spille en viktig rolle i reguleringen av cellefunksjon, proliferasjon og differensiering i endometrial karsinogenese.
Spesielt, vår studie indikerer også en viktig rolle betennelse regulatoriske og RNA bindende proteiner i høyverdig EmCa. Oppregulering av de nevnte annexin A1 sammen med nedregulering av apolipoproteiner, fibrinogens og haptoglobin indikerer undertrykkelse av den inflammatoriske prosessen i vev som omgir tumoren. Interleukin enhancer-bindende faktor 3 (ILF3 eller NF90) og heterogen ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1) er RNA-bindende proteiner som regulerer ekspresjonen av flere proteiner involvert i overlevelse og proliferasjon av tumorceller [36] – [38]. Blant annet overekspresjon av Serpin H1, F-aktin capping protein subenhet beta (CAPZB), makrofag capping protein (CAPG), er villin 2 (Esr), og cathepsin B (CTSB) kjent for å fremme celle motilitet og invasjon i tumorvev [ ,,,0],39] – [42]. Blant de potensielle molekylære markører som kan hjelpe i diagnose eller prognose av EmCa, noe som PKM2, LDHA og cathepsin B har allerede blitt utforsket for deres terapeutiske potensial i andre kreftformer. Hemming av PKM2 og LDHA, som benytter interfering RNA (siRNA) eller hemmere, viste redusert celledeling på grunn av induksjon av oksidativt stress fører til apoptose [43] – [47]. Videre siRNA-mediert nedregulering av PKM2 sensibiliserte lungekreftceller til cisplatin og doksorubicin. Potensialet av disse proteinene for å tjene som mål for nye molekylære mål-baserte terapier derfor må bestemmes i sammenheng med endometrial kreft i tillegg.
I denne studien ble boret ned tilnærming forbedret antall av proteiner identifisert, selv om en kjerne sett av peptider ble påvist i alle forsøkene i en gitt prøve. Disse tilfeller av gjentatt testing kan tilskrives endringer i oppholdstid, peak tailing, flere avgifter, og modifikasjoner (f.eks de-amidering og metionin oksidasjon). Etter analyse av den første iTRAQ settet, vi forbedret presisjon av fraksjon injeksjon og utvidet eksklusjonsvinduer for både tid og
m /z
, fra ± 5 til ± 7 min, og fra 100 til 120 ppm mDa , henholdsvis for å redusere noen av disse utfordringene. Vi valgte å ikke utelukke ioner basert på forskjeller i kostnad eller endringer, da dette ville ha økt ekskluderingslisten utover en praktisk størrelse, og i tillegg vi tenkte at noen redundans basert på forskjeller i kostnad eller modifikasjon kan bidra til å øke tilliten til identifikasjon. Dermed iterativ analyserer vi ansatt avveide dybden av analyse og tractability. Men denne identifikasjonen via flere peptider førte til at antall identifiserte proteiner trolig økt langsommere enn det som ville vært mulig hadde vi implementert utelukkelse av forskjellige ladetilstander og modifikasjoner. Interessant, det totale antall proteiner som er identifisert i denne studien var sammenlignbare med de som er angitt i vårt tidligere studie (1529 versus 1388 proteiner, henholdsvis), til tross for arbeider her med bare halvparten av mengden av utgangsmaterialet (100 versus 200 ug /prøve benyttet tidligere ) [18].
i konklusjonen, vår analyse tydelig viser betydningen av drill-down proteomikk tilnærming i kombinasjon med iTRAQ i å identifisere biomarkører kandidater for livmorkreft. Denne studien viser vellykket ny differensielt uttrykte proteiner som kan tjene som molekylære mål i diagnose og /eller prognose av endometrioid EmCa vev. Noen av disse proteinene utstillingen potensialene som molekylære mål for terapi.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Endometrial vev ble hentet fra en in-house, dedikert forskning endometrial vev bank som tidligere beskrevet [18]. Innsamling og bruk av disse materialene ble godkjent av Forskningsetiske Styrene i York University, Mount Sinai Hospital, University Health Network, og North York General Hospital. Prøvene stammer fra pasienter som gjennomgår hysterectomies eller andre kliniske prosedyrer som involverer biopsier. Alle disse prøvene ble innhentet etter skriftlig informert samtykke fra alle deltakere som er involvert i denne studien.
Prøver og reagenser
Med mindre annet er oppgitt, er alle reagenser var tilgjengelig fra Sigma-Aldrich (St-Louis, MO ). For denne studien, endometrioid kreft tilfeller (Type I EmCa, n = 10) og normal proliferativ endometrium (n = 10) ble valgt. Fem av vevsprøver Type I EmCa var fra biopsier som hadde blitt undersøkt i vår forrige undersøkelse. For proteomikk analyse, ble vevsprøver hentet fra speilet ansiktet av rest blokken brukes til histopatologisk evaluering av patologen. Vevsprøver ble vasket tre ganger i ~ 1 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) med en blanding av protease-inhibitorer (1 mM 4- (2-aminoetyl) benzensulfonyl fluor, 10 uM leupeptin, 1 ug /ml aprotinin og 1 pM pepstatin) som beskrevet tidligere [18]. Den vaskede prøven ble deretter homogenisert i 0,5 ml PBS med protease-inhibitorer ved anvendelse av en håndholdt homogenisator, flash-frosset i flytende nitrogen, og lagret ved -80 ° C frem til anvendelse [18]. Etter opphenting fra lagring ved -80 ° C, ble prøvene tint, klaret ved sentrifugering, og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved anvendelse av Bradford-analyse (Bio-Rad, CA). For alle iTRAQ sett, ble en referanseprøve bestående av et basseng av de ti normale proliferative prøver (100 ug lysat fra hvert vev) anvendt. For hvert forsøk ble 100 ug av proteiner fordøyet med trypsin og merket individuelt med passende iTRAQ tag. Oppgavene til de kodene til de prøvetypene ble randomisert til å minimalisere eventuelle skjevheter i merking effektivitet mellom de enkelte versjoner av iTRAQ koder. I alt syv iTRAQ settene ble undersøkt, hver omfattende tre av totalt 20 individuelle prøver – ti EmCa og ti friske endometria – og referanse bassenget. Muse monoklonale antistoffer mot calumenin og HNRNPA1 var tilgjengelig fra Abcam, cathepsin B fra Calbiochem, og S100A6 fra Santa Cruz Biotech. Kanin polyklonale laktatdehydrogenase A (LDHA) ble også hentet fra Santa Cruz Biotech.
Sterk kationerbytter (SCX) Separasjons
Hver iTRAQ settet ble separert ved SCX hjelp av en HP1050 HPLC instrument (Agilent, Palo Alto, CA) med en 2,1 mm indre diameter x 100 mm lengde PolyLC Polysulfoethyl en kolonne pakket med 5 um-perler med 300-Å porer (The Nest Group, Southborough, MA) som tidligere beskrevet [18]. I korte trekk ble det iTRAQ settet fortynnet med ladningsbuffer (identisk i sammensetning til Buffer A: 15 mM KH
2PO
4 i 25% acetonitril, pH 3,0) til et totalvolum på 1,8 ml, og pH ble justert til 3,0 med fosforsyre. Oppløsningen ble deretter filtrert under anvendelse av et 0,45-um sprøytefilter (Millipore, Cambridge, ON, Canada) før lasting på kolonnen. Separasjon ble utført ved anvendelse av en lineær binær gradient i løpet av 1 time, pluss 30 min på kolonne re-ekvilibrering (tabell 4). Som beskrevet tidligere, Buffer A var identisk i sammensetning til den ladningsbuffer; Buffer B var buffer A inneholdende 350 mM kaliumklorid; og buffer C ble Buffer A inneholdende 1 M kaliumklorid. Fraksjoner ble samlet inn hver 2 min ved hjelp av en SF-2120 Super Fraction Collector (Advantec MFS, Dublin, CA) etter en innledende vente i 2 min for å imøtekomme tomrommet volum. Dette resulterte i totalt 30 SCX fraksjoner per iTRAQ sett. Disse fraksjonene ble tørket ved anvendelse av speed-vac (Thermo Savant SC110 A, Holbrook, New York) og re-oppløst i et minimalt volum av 5% acetonitril i 0,1% maursyre: typisk 8 ul for hver fraksjon No. 6-9, 12 ul for No. 10-13, 16 mL for No. 14-16, 20 mL for No. 17-19, 25 mL for No. 20-21, og 30 mL for de siste fraksjoner, nr 22-30. Større volumer i de senere fraksjoner ble nødvendiggjort av behovet for fullstendig å oppløse de store salt pellets som følge av deres tilsvarende høyere saltinnhold. Fraksjoner No. 1-5 ble ikke analysert så tidlig fraksjoner stort sett inneholdt iTRAQ biprodukter.
omvendt fase (RP) LC-MS /MS
SCX fraksjoner No. 6-30 av hver iTRAQ sett ble analysert ved hjelp av elektroniske nano LC-MS /MS ved å bruke LC Substrat Ultimate instrument (Amsterdam, Nederland) utstyrt med en 10 pl prøvesløyfe. Den autosampler ble anvendt i den mikroliter pick-up-modus. For hver prøve ble en ul løsning påsatt på en 5 mm reversfase (RP) C18 forkolonne (LC Substrat) ved 25 mL /min og ble vasket i 4 minutter før den bytter forkolonne i linje med separasjonskolonnen. Separasjonskolonnen som ble brukt var en 75-mikrometer-indre diameter x 150 mm lengde kapillær kolonne (Integrafrit kapillær fra New Objective, Woburn, MA) pakket i huset med 3,5-mikrometer C18 perler med 100-en porene fra Kromasil (Akzo Nobel /EKA Chemicals Inc, New York). Strømningshastigheten anvendes for separasjon på RP-kolonne ble 200 nL /min. Oppløsningsmiddel A var 5% acetonitril i 0,1% maursyre; Løsningsmiddel B var 95% acetonitril i 0,1% maursyre. Løsemiddelet gradient er beskrevet i tabell 5. En ny kolonne ble benyttet for hver iTRAQ sett.
Online MS /MS ble utført på en QSTAR Pulsar hybrid kvadrupol /time-of-flight (QqTOF) tandem massespektrometer (Applied Biosystems /MDS SCIEX, Foster City, California) i informasjon avhengig oppkjøpet modus med skanne sykluser satt opp til å utføre en 1-s MS skanne etterfulgt av fem MS /MS-skanninger av de fem mest tallrike topper for to
