Abstract
caffeic syre phenethyl ester (CAPE) behandling trykt spredning, kolonidannelse og cellesyklusprogresjon i PC-3 menneskelige prostata kreft celler. CAPE redusert protein ekspresjon av cyclin D1, cyklin E, SKP2, c-Myc, akt1, akt2, akt3, total Akt, mTOR, Bcl-2, Rb, samt fosforylering av Rb, ERK1 /2, Akt, mTOR, GSK3α , GSK3p, PDK1; men økt protein uttrykk for KLF6 og p21
Cip1. Microarray analyse indikerte at veier som er involvert i cellulær bevegelse, celledød, spredning, og cellesyklus ble påvirket av CAPE. Samtidig behandling av CAPE med cellegifter vinblastin, paclitaxol, og estramustin indikert synergistisk undertrykkelse effekt. CAPE administrasjon kan tjene som en potensiell adjuvant behandling for prostatakreft
Citation. Lin HP, Jiang SS, Chuu CP (2012) caffeic syre Phenethyl Ester Årsaker p21
Cip1 Induksjon, Akt signale reduksjon, og vekst hemming i PC-3 Menneskelig prostata kreft celler. PLoS ONE 7 (2): e31286. doi: 10,1371 /journal.pone.0031286
Redaktør: Irina Agoulnik, Florida International University, USA
mottatt: 26 august 2011; Godkjent: 05.01.2012; Publisert: 07.02.2012
Copyright: © 2012 Lin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av CS-100-PP-12 (National Health Research Institutes) og NSC 99-2320-B-400-015-My3 (National Science Council, NSC) i Taiwan for CPC, samt DOH100-TD-C- 111-014 (Department of Health) for SSJ og CPC. Vi takker støtte fra Protein Chemistry Kjerne Facility av Kjerne Instrument Center i NHRI og Taiwan Bioinformatikk Institute Kjerne Facility av National Kjerne Facility Program for bioteknologi ved NSC (NSC100-2319-B-400-001). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Prostatakreft er en av de vanligste ikke-kutan carcinoma av menn i vestlige land. Mer enn 80% av pasienter som døde av prostatakreft utviklede benmetastaser [1] – [3]. I 1941 Charles Huggins oppdaget at deprivasjon av androgen forårsaket regresjon av hormon-responsive metastatisk prostatakreft [4]. Siden den gang har androgen ablasjon terapi blitt den primære behandling for metastatisk prostatakreft. Men de fleste prostatakreftpasienter androgen ablasjon terapi til slutt utvikle tilbakevendende, kastrering-resistente svulster innen 12-33 måneder etter behandling. Median total overlevelse tid er 1-2 år etter svulst tilbakefall [5], [6]. Kjemoterapi er vanligvis brukes til behandling av metastatisk hormon-refraktær prostatakreft [7].
Ofte brukte cytostatika ved metastatisk prostatakreft omfatter eoposide, paclitaxol, vinblastin, mitoxantrone, og estramustin. Etoposid og mitoxantron er type II topoisomerase-inhibitor [7], [8]. Estramustin er et derivat av østrogen med en nitrogensennep-karbamat esterdel [7]. Vinblastine binder tubulin og hemmer dannelsen av mikrotubuli [7]. Paclitaxel forstyrrer mitotisk spindelenheten, kromosom segregering, og celledeling. Paclitaxel stabiliserer også mikrotubul polymeren og derved beskytter den mot demontering [7]. Behandling med disse cytostatika redusert prostataspesifikt antigen (PSA) og radiografisk respons samt bedre smerte og urin symptomer i en undergruppe av pasienter. Imidlertid viste de liten effekt på å forlenge overlevelse. Uønskede bivirkninger av disse kjemoterapeutika inkludere giftige dødsfall, slag, trombose, nøytropeni, ødem, dyspné, sykdomsfølelse og tretthet [7]. Co-behandling kjemoterapi narkotika med naturlige forbindelser med anticancer aktivitet kan redusere dosen av kjemoterapi narkotika trengs.
caffeic syre phenethyl ester (CAPE), et bioaktivt komponent hentet fra bikube propolis, er en sterk antioksidant [9] , [10]. CAPE behandling i bryst, prostata, og leukemiske kreftceller fører til inhibisjon av NF-kB aktivitet [11], [12], induksjon av Bax [11], [13], aktivering av c-Jun N-terminal kinase (JNK) [ ,,,0],11] og p38-mitogen-aktivert proteinkinase (p38 MAPK) [11]. CAPE induserer apoptose via aktivering av kaspase-aktivitet [11], [13] og nedregulering av Bcl-2, CIAP-1, CIAP-2, og XIAP [12], [13] i bryst, prostata, og leukemiske kreftceller . I tillegg induserer CAPE cellesyklus-stans ved undertrykkelse av cyclin D1 [14], [15], cyklin E [14], og c-Myc uttrykk [15], så vel som øker ekspresjon av cyklinavhengig kinase inhibitorer p21
cip1 [14], p27
Kip1 [14], og p16
INK4A [14] i tykktarm og glioma kreftceller. Disse observasjoner tyder på at CAPE er en potensiell terapeutisk middel for kreft.
PC-3 er en av de mest brukte prostatakreftcellelinjer etablert fra benavledet metastaser. PC-3 celler uttrykker ikke androgen reseptor (AR) [16]. Mitoksantron, estramustin, vinblastin, etoposid, og paclitaxel har blitt vist å indusere proliferasjon inhibering, apoptose og cellesyklusarrest i PC-3-celler
in vitro product: [17] – [21], så vel som for å retardere PC-3-xenografter vekst i atymiske nakne mus [8], [21], [22]. Behandling med 88-176 uM av CAPE indusert apoptose i PC-3-celler via inhibisjon av NF-kB, CIAP-1, CIAP-2, og XIAP [12]. Men oppnåelig konsentrasjon av CAPE i humant serum er rundt 5,0 mikrogram /ml (17 mm) [23]. Vi derfor undersøkt om lav konsentrasjon (0-20 mm) av CAPE kan undertrykke spredning av PC-3 celler. Vi har også funnet ut om co-behandling av kjemoterapi narkotika med CAPE vise synergistisk hemming effekt på spredning av PC-3 celler.
Resultater
CAPE behandling undertrykker spredning og kolonidannelse av PC-3 celler
trypanblått flekker indikerte at CAPE doseavhengig hemmet spredning av PC-3 celler med et EF
50 rundt 20,4 mikrometer (fig. 1a). Hoescht fargestoffbasert 96-brønns proliferasjonsanalyse viste at den veksthemmende virkning av CAPE skjedde i løpet av 24 timer etter CAPE behandling ved en konsentrasjon så lav som 2,5 uM (fig. 1B). EC
50 for vekst inhibering av PC-3-celler var 51,4 uM, 30,7 uM, og 23,1 pM for 24, 48 og 72 timer CAPE behandling, henholdsvis, noe som indikerer at den undertrykkende virkning av CAPE kan akkumuleres. Kolonidannelse analysen viste at behandling av 10 mikrometer og 20 mikrometer CAPE effektivt hemmet dannelsen av PC-3 kolonier i soft agar (Fig. 1C).
Spredning av PC-3 cellers behandlet med økende konsentrasjon av CAPE ble bestemt ved Trypan blå farving etter 72 timers behandling (A) eller ved å måle det totale DNA-innhold pr brønn ved bruk av Hoechst 33258 fluorescens av 96-brønn assay spredning etter 24, 48 og 72 timer behandling (B). Relative celleantall ble normalisert til den gjennomsnittlige celletallet i kontrollen (ingen behandling CAPE) for hver cellelinje i hvert enkelt eksperiment. Kolonner representerer bety for 18 gjentak; søylene representerer standardavvik. Stjerne (*) representerer celletallet er statistisk signifikant forskjellig (
p
0,05) sammenlignet med kontrollen. Kolonner representerer bety for 5 biologiske replikat; søylene representerer standardavvik. (C) Anticancer virkning av CAPE ble bestemt ved kolonidannelsesbestemmelsen av PC-3-celler behandlet med 0, 10, 20 uM i 14 dager. Bildet er et representativt resultat av tre biologiske replikater.
Siden CAPE ble tidligere rapportert som en NF-kB inhibitor [10], bestemt vi enten lav dasage av CAPE kan hemme NF-kB aktivitet ved hjelp av et plasmid -basert luciferase reporter analysen. Selv om CAPE behandling ved 40 uM inhiberte NF-kB aktivitet, behandling med CAPE ved en konsentrasjon lavere enn 40 uM hadde ingen virkning på NF-kB aktivitet (Fig. 2A). Denne observasjon antydet at andre mekanismer er ansvarlige for CAPE inhiberende effekt ved lav dosering.
(A) PC-3-celler transfektert med en 4X NF-kB luciferase reporter-plasmid i 24 timer ble behandlet med økende konsentrasjoner av CAPE for ytterligere 24 timer. Relativ luciferase aktivitet ble bestemt å sammenligne effekten av CAPE på NF-kB transkripsjonen aktivitet. (B) PC-3-celler ble behandlet med CAPE i 24, 48 eller 72 timer, høstet, og farget med propidiumjodid fargestoff for flowcytometrisk analyse for cellesyklusfordeling. (*) Representerer statistisk signifikant forskjell (
p
0,05). Mellom de to cellegruppe blir sammenlignet
CAPE behandling forstyrrer cellecyklusprogresjonen
Propidium jodid (PI) farging strømningscytometri-analyse viste at behandling med 10-20 uM CAPE redusert cellepopulasjonen i G1 fase og øket cellepopulasjonen i sub-G1 fase i løpet av 24 timer i PC-3-celler. Denne effekten var mer dramatisk ved 72 timer etter CAPE behandling (fig. 2B-2D). Imidlertid annexin V-farging strømningscytometri-analyse indikerte at 10-20 uM CAPE induserte ikke apoptose i PC-3-celler (data ikke vist). Behandling med 20 mikrometer CAPE i 72 timer resulterte i økning av cellesyklus hemmende proteiner p21
Cip1 og reduksjon av S-fase kinase-assosiert protein 2 (SKP2), fosforylering av serin 807/811 på retinoblastom (RB), cycin D1 , cyklin E, c-Myc, og fosforylering av treonin 202 /tyrosin-204 av ekstracellulære signalregulerte kinase 1/2 (ERK1 /2) (fig. 3). Ingen endring i p27
Kip1, total ERK1 /2, eller β-tubulin ble observert. Sammenlignet med 24 timer og 48 timer behandling, 72 h behandling generelt forårsaket mer forandring av proteinekspresjon nivå med unntak av cyklin D1. Dette kan forklare den større veksthemming forårsaket av CAPE ved 72 timer. Cyclin D1 økt etter 24 timer og 48 timer behandling, men reduseres etter 72 timer behandling.
Protein uttrykk for c-myc, cyclin D1, cyclin E, SKP2, phosho-Rb (S807 /811), p27
Kip1, p21
Cip1, ERK1 /2, pErk1 /2-Thr202 /Tyr204, β-tubulin, og β-aktin i PC-3-celler behandlet med 20 uM CAPE for 24, 48 og 5, 10, 20 pM CAPE i 72 timer ble analysert ved Western blotting.
CAPE behandling hemmer overflod og aktivitet av proteiner i AKT-signalveien
Akt spiller viktig rolle i overlevelse og spredning av prostatakreft celler [24]. Vi bestemte derfor om CAPE behandling undertrykker Akt signalveien. 72 timer etter 20 mikrometer CAPE behandling redusert overflod av total Akt, akt1, akt2, og akt3 (figur 4). CAPE behandling av 24-72 h betydelig redusert fosforylering av Akt på serin 473 og treonin 308 ,. CAPE endret ikke den totale mengde av phosphoinositide avhengig kinase 1 (PDK1) (fig. 4), men fosforylering av serin 241 på PDK1 ble redusert med CAPE behandling. CAPE behandling også forårsaket reduksjon av total mammalian target of rapamycin (mTOR) og svak reduksjon av fosforylering på serin 2448 og 2481 av mTOR. CAPE behandling endret ikke total overflod av GSK3α og GSK3p (Fig. 4). Imidlertid phosphosphorylation av GSK3α S21 og S9 GSK3P ble øket etter 24 timer og 48 timer av 20 uM CAPE behandling, men ble redusert ved 72 timer og 20 uM CAPE behandling (fig. 4). Bcl-2 er en anti-apoptose faktor på nedstrømssiden av Akt signalering. Overekspresjon av Bcl-2 er tidligere blitt rapportert å gi legemiddelresistens av prostata-kreft [5]. CAPE litt redusert uttrykk av Bcl-2.
Protein uttrykk for Akt, akt1, akt2, akt3, total Akt, fosfor-Akt S473, fosfor-Akt T308, mTOR, fosfor-mTOR Ser2448 og Ser2481, GSK3α, GSK3P, phopho-GSK3α S21, fosfo-GSK3P S9, PDK1, fosfo-PDK1 Ser241, Bcl-2, KLF6, β-tubulin, og β-aktin i PC-3-celler behandlet med 20 uM CAPE for 24, 48, og 5 , 10, 20 mikrometer CAPE i 72 timer ble analysert ved Western blotting.
CAPE behandling påvirker gener som regulerer spredning, overlevelse og død av PC-3 celler
Vi videre studerte omfattende endring av genuttrykk i PC-3 celler behandlet med 20 mikrometer CAPE i 24 timer eller 72 timer ved mikromatriser. Gener med uttrykket ganger endring 1,5 og
P
0,05 ble betraktet som gener betydelig påvirket av CAPE behandling. CAPE påvirket ekspresjon av 69 unike gener etter 24 timers behandling (tabell S1). 53 gener ble oppregulert og 16 gener ble nedregulert. Behandling med CAPE i 72 timer endret uttrykk av 147 unike gener (Tabell S2). 122 gener ble oppregulert, mens 25 gener ble nedregulert. 25 gener ble ofte endret i både 24 timer og 72 timer behandling (Figur 5, Tabell S3). Blant de 25 genene, 3 genene var nedregulert (CYP1B1, SCG5, PADI4) og 22 gener ble oppregulert (LY96, LOC728285, TM4SF19, RGS2, PI3, AKR1C2, GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KRT34, HIST2H2AA3, AKR1C4, KLF4, DUSP5, november, GK, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, og HIST1H4H) (fig. 5). Analyse av alle de 191 genprober som påvirkes av CAPE behandling enten 24 timer eller 72 timer ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway analyse (IPA) viste at CAPE behandling påvirkes gener som er involvert i reguleringen av celledød, proliferasjon og overlevelse. Blant de genene blir påvirket av CAPE behandling, 52 gener involvert i regulering celleproliferasjon (
p-verdi
= 9,82 × 10
-11), 41 gener som er involvert i cellevekst regulering (
p-verdi
= 1,40 × 10
-10), 68 gener involvert i celledød regulering (
p-verdi
= 1,40 × 10
-12), og 27 gener som er involvert i celleoverlevelse regulering (
p
= 3.43 × 10
-6). En oversikt over gener prober som er involvert i disse signalveier er vist i tabell S4.
Gener som vanligvis påvirkes ved begge tidspunkter er i rød farge, mens de som er spesielt påvirket ved enten tidspunkt er i sort. IPA analyse av de unike gener (n = 191) gener endret enten i 24 timer eller 72 timer CAPE behandling indikert at gruppen av gener som regulerer flere cellefunksjoner, inkludert celle proliferasjon (p-verdi på 9,82 x 10
-11, 52-gener ), cellevekst (p-verdi 1,40 × 10
-10, 41 gener), celledød (p-verdi 1,40 × 10
-12, 68 gener) og celle overlevelse (p-verdi 1,40 × 10
-6, 27 gener).
Vi validert noen av de genene som er berørt av CAPE behandling med kvantitativ real-time PCR (QRT-PCR). 17 av 18 gener (GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KLF4, DUSP5, november, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, og GADD45A) testet av QRT-PCR viste lignende endring mønster følgende 24 timer eller 72 timer CAPE behandling i forhold til genet microarray. Det eneste unntaket er TUBA1A. Vi observerte ikke noen endring av TUBA1A genet under CAPE behandling av QRT-PCR (Fig. 6). Western blotting-analyse indikerte at proteinnivået KLF6 ble økt med CAPE behandling (Fig. 4).
Gene uttrykk nivå GDF15, HIST1H2BD, CCL20, CXCL5, RND3, KLF4, DUSP5, november, CDKN1A, CXCL2, DUSP1, KLF6, TOP2A, PPP1R15A, CAV2, S100P, GADD45A, og TUBA1A i PC behandles med 0 eller 20 mikrometer CAPE i 24 timer eller 72 timer ble bestemt ved QRT-PCR.
Co-behandling av CAPE med cellegifter trykt spredning av PC-3 celler
til slutt, vi undersøkt om co-behandling av CAPE på serum tilgjengelig dosering (0-20 mm) med vanlig brukte kjemoterapi narkotika (etoposid, paclitaxol, vinblastin , mitoxantrone, og estramustin) kan undertrykke vekst av PC-3 celler mer effektivt enn behandling med kjemoterapi narkotika alene. EF
50 av CAPE, etoposid, paclitaxol, vinblastin, mitoxantrone, og estramustin for å hemme spredning av PC-3 celler var 18,3 um, 1,7 um, 3,0 nM, 2,1 nM, 5,9 nM, og 13,0 mikrometer. Behandling av 20 uM CAPE undertrykket vekst av PC-3-celler mer effektivt enn behandling med 1,0 uM etoposid, 2,5 nM paclitaxol, 5 nM mitoksantron, 2 nM vinblastin eller 10 uM estramustin (figur 7). Når ko-behandling med 20 uM CAPE, 0,5 uM etoposid, 1 nM paclitaxol, 1 nM vinblastin, 2,5 nM mitoksantron, og 8 pM extramustine forårsaket veksthemning i likhet med den høyeste dosen vi testet (figur 7). Synergistisk effekt betyr suppressive virkning av to medikamenter som blir behandlet sammen er større enn summen av deres separate undertrykkende virkning ved de samme doser, mens antagonistiske effekter betyr den undertrykkende virkning av to stoffene er mindre enn summen av virkningen av de to kjemikalier tatt hver for seg. Ifølge definisjonen, co-behandling av CAPE viste synergistisk effekt med vinblastin, estramustin, eller paclitaxol, og antagonistisk effekt med etoposid eller mitoxantrone (figur 7).
Spredning av PC-3 celler behandlet med økende dose ( 0, 5, 10, 20 uM) av CAPE i kombinasjon med økende konsentrasjon av etoposid (A), paclitaxol (B), vinblastin (C), mitoxantron (D), og estramustin (E) i 72 timer ble bestemt ved 96- vel analysen spredning. Høyre del av figuren viser forholdet mellom forventet celle nummer /observert celle nummer. For eksempel, behandling av 5 uM av CAPE eller 1 nM vinblastin reduserer celletall på PC-3 til 80.9% og 88,7%, respektivt, sammenlignet med kontrollen (ingen behandling). Forventet celle nummer av behandling som kombinerer fem mikrometer fra CAPE og 1 nM vinblastin er 0,809 * 0,887 = 71,8%. Den observerte celleantall er 48,8% sammenlignet med kontrollen. Slik at forholdet er 0,718 /0,488 = 1,5. Ratio større enn en representerer synergi av veksthemming, mens forholdet er mindre enn én representerer antagonistisk effekt.
Ifølge vår observasjon, p21
Cip1 spiller viktig rolle i reguleringen av veksthemming indusert av CAPE behandling . For å bekrefte dette, vi slått ned p21
Cip1 i PC-3 og funnet ut om disse PC-3 celler blir mer motstandsdyktig mot CAPE behandling. Som forventet, etter 24 h CAPE behandling, PC-3-celler med mindre p21
Cip1 protein ekspresjon var mer resistente overfor veksthemming forårsaket av CAPE behandling (Fig. 8).
Protein nivåer av villtype PC-3, PC-3 celler transfektere med krafse kontroll (20 nM), og PC-3 celler transfektert med p21
Cip1 siRNA (20 nM) ble bestemt ved Western blotting-analyse. Spredning av disse PC-3 celler behandlet med 20 mikrometer CAPE i 24 timer ble bestemt av 96-brønn analyseplate spredning som beskrevet i Materiale og metode.
Diskusjoner
Vår observasjon foreslo at koffeinsyre phenethyl ester (CAPE) kan hemme spredning og kolonidannelse av PC-3 menneskelige prostata kreft celler i konsentrasjon 10-20 mikrometer. Disse observasjonene antydet at oppnåelig konsentrasjon av CAPE i humant serum, (17 mm) [23], er muligens for å gi veksthemming i prostatakreft hos pasienter.
cyclin-avhengig kinase inhibitor p21
Cip1 binder og hemmer kinase-aktiviteter CDK2 /cyklin A, Cdk2 /cyklin E, Cdk4 /cyklin D, og CDK6 /cyklin D-komplekser [25]. p21
Cip1 kan samhandle med prolifererende cell nuclear antigen (PCNA), en DNA polymerase tilbehør faktor, og spiller en regulerende rolle i S-fasen DNA replikasjon og DNA-skade reparasjon [26]. SKP2 er medlem av F-box protein familien. SKP2 utgjør en av de fire subenheter av ubiquitin protein ligase kompleks kalt SCF (SKP, Cullin, F-boks som inneholder komplekse), som fungerer i fosforylering avhengige ubiquitinering. SKP2 er et vesentlig element av cyklin A-Cdk2 S-fase-kinase [27]. Reduksjon i fosforylering av Rb begrenser celleproliferasjon ved å inhibere E2F aktivitet [28]. ERK1 og ERK2 er involvert i kontrollen av mange grunnleggende cellulære prosesser, inkludert celleproliferasjon, overlevelse, differensiering, apoptose, motilitet og metabolisme. ERK1 /2 spiller viktige roller i kanonisk MAPK (Mitogen-Aktivert Protein Kinase) signalveien og er kritiske regulatorer av vekst og overlevelse [29]. CAPE indusert p21
Cip1 og redusert cyklin D, cyklin E, SKP2, og fosforylering av Rb og ERK1 /2 (Fig. 3). CAPE kan dermed undertrykke veksten av PC-3 celler via disse proteinene [30].
Akt er en serin /treonin protein kinase som regulerer hemming av apoptose og stimulering av celledeling. Oppregulering av PI3K /Akt-aktivitet er assosiert med dårlig klinisk resultat av prostatakreft [31]. Det er tre pattedyr-isoformer av dette enzymet, akt1, akt2, og akt3 [32], [33]. Protein overflod og aktivitet av akt3 har tidligere vært foreslått å bidra til en mer aggressiv kliniske fenotype av androgen som ikke-respondere prostata og bryst kreft [34]. Akt3 enzymatisk aktivitet var ca 20-60 ganger høyere hos AR-negative PC-3 og DU-145 celler i forhold til AR-positive LNCaP prostatakreftceller [34], [35]. Vi observerte at CAPE trykt Akt signalrelaterte proteiner, inkludert akt1, akt2, akt3, total Akt, mTOR, BCL-2, Pakt Ser 473, Pakt Thr 308, pmTOR Ser 2448/2481, pGSK3α Ser21, pGSK3β Ser9, og pPDK1 Ser241 . CAPE ble nylig rapportert å undertrykke fosforylering av Akt i andre humane celler, så som CD4 + T-celler [36], koronar glattmuskelcellet [37], og A549 lungekreftceller [38]. Fosfatase og tensin homolog (PTEN) protein fungerer som en fosfatase å dephosphorylate phosphatidylinositol (3,4,5) -trisphosphate. PTEN styrer negativt phosphoinositide 3-kinase /Akt signalveien [39]. PC-3 celler skaffe en homozygot delesjon av PTEN, og dermed Akt er aktiv hele tiden. Det er to fosforyleringsseter på Akt, treonin 308 og 473. serin fosforylering av Thr308 på Akt aktiveres av PDK1 [40]. Fosforylering av serin 473 aktiveres av mTOR-kinase, dens tilhørende protein rektor, og SIN1 /MIP1 [41], [42]. CAPE fosforylering av serin 241 på PDK1 og dempet fosforyleringen av serin 2448 og 2481 på mTOR (fig. 4). Reduksjon av PDK1 og mTOR aktiviteten kan derfor bidra til reduksjon av phsphorylation på Akt. Aktivitetene til glykogen syntase kinase-3-alfa (GSK3α og GSK3P er kjent for å bli inhibert av Akt-mediert fosforylering ved Ser21 og Ser9 henholdsvis, noe som begrenser deres evne til å fosforylere cellesyklusregulerende proteiner, slik som cyklin D1 og p21
Cip1 [43 ], [44]. Phosphosphorylation av GSK3α S21 og GSK3P S9 ble øket etter 24 timer og 48 timer av 20 uM CAPE behandling, men ble redusert ved 72 timer og 20 uM CAPE behandling (fig. 4). økt fosforylering av GSK3α S21 og GSK3p S9 kan bidra til økningen av p21
Cip1 ved 24 timer og 48 timer etter CAPE behandling. GSK3p-avhengig fosforylering av cyclin D1 mediert atom eksport og rask nedbrytning i cytoplasma av cyclin D1 [45]. Reduksjon av GSK3βactivity på grunn av økning av fosforylering (fig. 4) resulterte i mindre fosforylering av cyclin D1 og dermed akkumulering av cyclin D1 ved 24 timer og 48 timer (fig. 3). Økning av GSK3βactivity på grunn av reduksjon av fosforylering (fig. 4) vil derfor redusere overflod av cyclin D1 etter 72 h (fig. 3). Redusert fosforylering av GSK3P GSK3α og etter 72 timer var i overensstemmelse med redusert fosforylering av Akt. Undertrykkelse av Akt signal av CAPE kan bidra til hemming av overlevelse og vekst i PC-3 celler.
Vi har merket at gener påvirkes av CAPE på 24 timer og 72 timer etter behandling var moderat korrelert (
r =
0.56, fig. 5). Det var bare 25 vesentlig påvirket genene til felles mellom disse to tidspunktene. Siden veksthemming og cellesyklus forstyrrelse forårsaket av CAPE behandling startet innen 24 timer og undertrykkende effekt akkumulert over tid, vi en hypotese om at det viktigste målet gener for anticancer aktivitet av CAPE var disse 25 vanlige gener. Krüppel-lignende faktor 4 (KLF4) transaktiverer den p21
Cip1 promoter og hemmer spredning gjennom aktivering av p21
Cip1 samt direkte undertrykkelse av cyclin D1 og cyclin B1 genuttrykk [46] – [48]. November genet koder for protein CCN3 (nov) som hemmer celledeling via Notch /p21
Cip1 vei [49]. Heving av KLF4 og nov gener kan undertrykke PC-tre vekst via p21
Cip1. Vekst /differensieringsfaktor-15 (GDF-15) er et divergerende TGFp familiemedlem som har vært implisert i hemming av tumorvekst og øket tumor invasivitet [50]. Noen gener er cytokiner involvert i betennelse reaksjon, slik som CCL20 [51], CXCL2 [52], CXCL5 [53]. De ble funnet oppregulert, noe som tyder på at CAPE induserer betennelse respons i PC-3 celler. I tillegg øker CAPE behandling RhoE /Rnd3. Oppregulering av den lille G-protein RhoE /Rnd3 /Rho8 hemmer proliferasjonen av prostatacancerceller ved å fremme apoptose og inhibering av cellesyklusprogresjon [54].
I tillegg til de 25 som vanligvis endrede gener, noe differensielt uttrykte gener spesielt etter 24 timer eller 72 timer behandling også regulere celleoverlevelse, proliferasjon eller celledød. CAPE behandling økt KLF6, S100P, GADD45A, PPP1R15A, S100P, men redusert TOP2A og CAV2. Kruppel-lignende faktor 6 (KLF6) er en sink finger transkripsjonsfaktor og fungerer som tumor suppressor genet i menneskets prostatakreft [55]. KLF6 opp-regulerer p21
Cip1 i et p53-uavhengig måte og reduserer celleproliferasjon [55] betraktelig. S100P protein regulerer kalsium signaltransduksjon, cytoskeletal interaksjon, protein-fosforylering, transkripsjonen kontroll, cellesyklusprogresjon, og differensiering. Heving av S100P i PC3 cellene fremmet cellevekst, økte andelen av S-fase celler, redusert basal apoptose rate, fremmet forankringsuavhengig vekst i myk agar, og gir resistens mot kjemoterapi [56]. GADD45A protein reagerer på miljømessige påkjenninger ved å formidle aktivering av p38 /JNK-reaksjonsveien. Den Gadd45 proteinet har blitt beskrevet for å danne et kompleks med p21
Cip1. Den p21
Cip1-bindende domene av GADD45A koder også Cdc2-bindende aktivitet. GADD45A samhandler med Cdc2 dissosierer Cdc2-cyclin B1 kompleks, endrer cyklin B1 nukleære lokaliserings, og således inhiberer aktiviteten av Cdc2 /cyklin B1 kinase [57] – [59]. PPP1R15A (Protein fosfatase en regulatorisk subenhet 15A, også kjent som GADD34) har vist seg å indusere vekst og apoptose. PPP1R15A oppregulering forbedrer p21
Cip1 protein uttrykk og induserer p21
Cip1 promoter aktivitet [60].
Vinblastine, paclitaxol, og CAPE påvirke genuttrykket av α-tubulin og β-tubulin (figur S1, S2), mens etoposid, mitoksantron, og CAPE påvirker genekspresjon av type II topoisomerase (figur S3). Imidlertid induserer etoposid p21
Cip1 via p53 og nedregulering av c-myc i kreftceller [61], [62]. Mitoxantrone induserer p21
Cip1 [63]. Vinblastine induserer apoptose via reduksjon av p21
Cip1 [64]. Paclitaxol induserer en Akt-avhengig fosforylering på p21
Cip1 fører til en sammenslutning av p21
Cip1 med 14-3-3 og dermed opphopning av fosforylert form av p21
Cip1 i cytoplasma som hindrer den hemmende effekten av p21
Cip1 [65]. Ingen studie rapporterer forholdet mellom p21
Cip1 og estramustin. Siden CAPE behandling øker både mRNA og protein nivå av p21
Cip1 (Fig. 3) og knockdown av p21
Cip1 i PC-3 celler gjort cellene mer motstandsdyktige mot CAPE behandling (Fig. 8), kan CAPE undertrykke vekst og overlevelse av PC-3 celler mer lik etoposid og mitoxantrone, men mindre lik vinblastin, paclitaxol, og estramustin. Foruten CDKN1A (p21
Cip1 genet), CAPE behandling også økt genekspresjon av KLF4, KLF6, november, GADD45A, PPP1R15A. Disse genene alle undertrykke spredning via p21
Cip1. Derfor, selv om ko-behandling med CAPE trykt flere PC-3-celler enn behandling med kjemoterapi medikament alene, CAPE viste bare synergistisk undertrykkende effekt med vinblastin, paclitaxol, og estramustin (fig. 7). CAPE behandling også undertrykkes overflod og fosforylering av Akt, samt oppstrøms og nedstrøms signaliseringsproteiner i Akt signalering. Vi mener derfor at p21
Cip1 induksjon og undertrykkelse av Akt signaliserer både spille viktig rolle i veksthemming forårsaket av CAPE behandling i PC-3 celler. Vi oppsummerer Akt /p21
Cip1 signalveien nettverk blir påvirket av CAPE behandling i PC-3 i figur 9.
Protein overflod eller aktivitet blir stimulert av CAPE behandling er merket med røde oppover piler, mens de blir undertrykt av CAPE behandling er merket med blå nedadgående piler.
i konklusjonen, våre observasjoner gitt innsikt i den molekylære mekanismen for CAPE anti-proliferativ effekt i PC-3 prostatakreftceller. Våre data antydet at CAPE administrasjon kan være nyttig som en potensiell adjuvant behandling i kombinasjon med kjemoterapi for metastatisk prostatakreft.
Materialer og metoder
Kjemi
koffein AICD phenethyl ester, etoposid, paclitaxol, vinblastin, estramustin, og mitoxantrone ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA).
Cell Kultur
PC-3 celler var sjenerøs gave fra Dr. Shutsung Liao s lab (The University of Chicago) og ble holdt i DMEM (Gibco /Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) supplert med 10% føtalt bovint serum (FBS; Atlas Biologicals, Fort Collins, CO, USA), penicillin (100 U /ml ), og streptomycin (100 ug /ml).
Cell Proliferation Assay
Relativt celleantall ble analysert ved å måle DNA-innhold av cellelysater med den fluorescerende fargestoff Hoechst 33258 (Sigma) som beskrevet tidligere [66] – [69]. EF
50 (konsentrasjon av stoffet for å forårsake 50% veksthemming) av legemidler på PC-3 celler ble bestemt av en Excel-tillegg program ED50V10.
Soft Agar Colony Forming analyse
8000 celler ble suspendert i 0,3% lavtsmeltende agarose (Lonza, Allendale, NJ, USA) med 10% føtalt bovint serum i DMEM-medium og deretter lagvis på toppen av 3 ml 0,5% lavtsmeltende agarose pluss 10% føtalt bovint serum i DMEM medium i 6 cm retter. Celler ble tillatt å vokse ved 37 ° C med 5% CO
2 i 14 dager. Platene ble farget med 0,005% krystallfiolett i 30% etanol i 6 timer.
Luciferase Assay-reporter
PC-3-celler ble sådd ut på 1,9 x 10
5-celler /brønn i en 12-brønners plate i DMEM inneholdende 10% FBS. 24 timer etter plating, PC-3 celler ble transfektert med PRL-TK-Renilla luciferase plasmid (normalisering vektor, 8 ng /brønn), 4X NF-kB (reporter genvektor; 800 ng /brønn) med PolyJet ™ in vitro DNA transfeksjon reagens (SignaGen Laboratories, Rockville, MD). 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av CAPE. Etter ytterligere 24 timer ble cellene lysert i 100 ul passiv lyseringsbuffer (Promega, Madison, WI, USA) og luciferaseaktivitet ble målt ved bruk av en dual-Luciferase-kit (Promega) i et 20/20
n luminometer Turner Biosystems .
flowcytometrisk analyse
Celler ble sådd i 6 cm retter i 4,5 ml media og CAPE ble lagt inn 24 timer etter plating. Etter den angitte tid (24, 48, 72 timer) med kultur i nærvær av forskjellige konsentrasjoner av CAPE ble cellene fjernet med trypsin og fiksert i 70% etanol i PBS over natten ved -20 ° C. Fikserte celler ble vasket med PBS, ble behandlet med 0,1 mg /ml RNase A i PBS i 30 minutter, og deretter suspendert i 50 ug /ml propidiumjodid i PBS.
