Abstract
målretting av onkogene Kras til bukspyttkjertelen nestin-uttrykke embryonale stamceller og deretter til voksen acinar rommet og nestin-uttrykke celler er tilstrekkelig for utvikling av lav grad av pankreas intraepitelial neoplasi (Panin) mellom 2 og 4 måneder. Musene dør rundt seks måneder gammel urelaterte årsaker, og det er derfor ikke mulig å vurdere om lesjoner vil utvikle seg til kreft. Vi rapporterer nå at to korte episoder av caerulein-indusert akutt pankreatitt i to måneder gamle mus forårsaker rask Panin progresjon og bukspyttkjertelen duktalt adenokarsinom (PDAC) utvikling av 4 måneders alder. Disse hendelsene inntreffer med samme frekvens som observert i dyr der onkogen er rettet under embryogenese til alle bukspyttkjertelen celletyper. Dermed disse dataene viser at onkogene Kras-drevet Panin opprinnelse i en ikke-ductal rommet kan raskt utvikle seg til PDAC når det utsettes for en kort inflammatorisk fornærmelse
Citation. Carrière C, Young AL, Gunn JR, Longnecker DS , Korc M (2011) Akutt pankreatitt Akselererer Innvielse og progresjon til kreft i bukspyttkjertelen i mus som uttrykker onkogen Kras i nestin Cell Lineage. PLoS ONE 6 (11): e27725. doi: 10,1371 /journal.pone.0027725
Redaktør: Wafik S. El-Deiry, Penn State Hershey Cancer Institute, USA
mottatt: 07.06.2011; Godkjent: 23 oktober 2011; Publisert: 28.11.2011
Copyright: © 2011 Carrière et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra: The National Cancer Institute: CA- R37-075059 til Murray Korc og CA-127 095 til Catherine Carrière; Den Lustgarten Foundation for kreft i bukspyttkjertelen forskning til Catherine Carrière. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Bukspyttkjertel duktalt adenokarsinom (PDAC) står for over 95% av alle eksokrine pankreas maligniteter og er den fjerde største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i USA, med en median overlevelse på 6 måneder [1]. I de siste 30 årene, har pasientens overlevelse ikke bedret seg betydelig, og PDAC fortsatt vanskelige i sin sene stadier. Det er derfor et stort behov for å utvikle nye metoder for tidlig påvisning av PDAC samt nye behandlingsformer rettet mot tidlige kreft stadier. Musemodeller av PDAC som rekapitulere kreft hos mennesker har potensial til å fremme vår forståelse av de tidlige hendelsene i kreftutvikling.
PDAC er nå anerkjent å oppstå hovedsakelig gjennom utviklingen av pankreas intraepitelial neoplasi (Panin), som strekker seg fra lav- (Panin-1A, -1B) til høye karakterer (Panin-2, -3), Panin-3 representerer carcinoma
in situ Hotell og umiddelbar forløper til duktalt adenokarsinom [2]. Dette histologisk progresjon er korrelert med opphopning av genetiske avvik hvorav mutasjoner fører til konstitutiv aktivering av KRAS er den tidligste og mest vanlige (95%) [3]. De første relevante musemodeller av PDAC ble generert ved å målrette en betinget mutert
Kras
allel (
Kras
G12D
) til tidlig bukspyttkjertelen stamfedre (ved hjelp Pdx1 og Ptf1a arrangører) og senere til alle pankreatiske celletyper [4], [5]. Disse modellene rekapitulert trofast hele spekteret av menneskelig Panin progresjon og kreft i bukspyttkjertelen utvikling, som viser at onkogene Kras uttrykk er tilstrekkelig for PDAC innvielse. For å avgrense cellene opprinnelse PDAC ble flere modeller som senere utviklet der mutert Kras ble rettet mot mer begrensede embryonale eller voksen celle populasjoner. Vi brukte en nestin-Cre driver å målrette Kras
G12D til acinar og nestin-uttrykke celler (nestin-Grobunn, LSL-Kras
G12D eller N /K mus) (Fig. 1a), mens andre målrettede onkogene Kras til den acinar bare eller acinar /centroacinar celler med forskjellig elastase-Cre og mist1-Cre-drivere [6], [7], [8], [9]. I alle disse modellene, kan PDAC initiering og progresjon bli observert og dette demonstrerer at PDAC kan ha en ikke-ductal opprinnelse hos mus. Selv om en nyere studie antydet at PDAC kunne initiere i det endokrine rommet, har det vist seg at det promoter brukt i denne studien kan også målrette en liten brøkdel av akinærceller [10], [11]. I alle modellene der onkogen Kras ble aktivert under embryogenese, lavgradig PanINs utviklet, vanligvis utvikler seg i løpet av 8-12 måneder til høyverdig lesjoner og PDAC. Vi var ikke i stand til å observere progresjon til PDAC i N /K mus, som de vanligvis dør rundt alderen 6 måneder fra av sentralnervesystemet komplikasjoner.
(A) Skjematisk av den betingede Kras
G12D allel. I fravær av den Cre rekombinase, blir bare WT Kras uttrykt; når Cre uttrykkes, er det stopp regionen skåret ut og Kras
G12D blir uttrykt. (B-E) I nestin-Cre /R26R mus, er LacZ farging kun observert i akinærceller (B), og er fraværende i ductal celler (pilhoder) og skjær (I). (C) Overlegg av LacZ farging (E) med CK19 (D) viser at ductal cellene ikke er målrettet. (F) Pdx1-Cre fører til uttrykk av Kras
G12D i alle bukspyttkjertelen celletyper mens nestin-Cre driver uttrykk for Kras
G12D bare i akinærceller. Skala: 20 mikrometer
Aktivering av Kras
G12D i voksen bukspyttkjertelen førte til ikke-framdrift lavgradig lesjon formasjonen [7], [8], [12].. Men etter induksjon av kronisk pankreatitt, disse dyrene utviklet høy grad av lesjoner og kommet til PDAC [7]. Disse dataene er konsistent med epidemiologiske studier som viser at pasienter som lider av kronisk pankreatitt har en 16 ganger økt risiko for å utvikle kreft i bukspyttkjertelen [13]. Mens korte episoder med akutt pankreatitt (AP) føre til rask Panin progresjon og økt frekvens av PDAC i Pdx1-Cre; LSL-Kras
G12D mus [14], [15], [16], er det ukjent om det også ville føre til PDAC i nestin-drevet musemodell. Vi viser nå at N /K mus, når utsatt for to episoder av caerulein-indusert AP, raskt utvikle høyverdige PanINs som har kapasitet til å utvikle seg til PDAC. Denne studien bekrefter at akutt bukspyttkjertelskade har potensial til å bidra til PDAC utvikling i Kras-baserte musemodeller og støtter hypotesen om at PDAC kan oppstå i nestin celle avstamning.
Resultater
nestin stamfar cellene ikke gi opphav til duktale celler
Vi har tidligere vist at embryonale nestin-uttrykke bukspyttkjertelen stamfedre gi opphav til acinar celler og ikke til endokrine eller centroacinar celler, mens en potensiell bidrag til duktale cellene ikke var helt utelukket [ ,,,0],6]. For å løse dette problemet, ble flere avstamning tracing eksperimenter utført av avl musen linje som uttrykker Cre rekombinase under kontroll av nestin regulatoriske elementer [17] med reporteren musen linjen R26R. Denne siste linje bærer β-galaktosidase (LacZ) genet under kontroll av den allestedsnærværende promoteren R26 og en transkripsjonsstopp område omgitt av loxP-seter (loxP-stopp-loxP eller LSL) [18]. I de doble transgene mus, er LacZ uttrykk aktivert følgende Cre-formidlet rekombinasjon i embryoniske nestin-uttrykkende celler (tilsvarende fremgangsmåte til den som er beskrevet for Kras i fig. 1A). Deretter, ved genetisk overføring, alle celler avledet fra nestin-uttrykkende stamceller uttrykke LacZ. Seksjoner over pankreata av nestin-Cre /R26R dyr på 2 måneders alder ble farget for LacZ aktivitet. Som observert før, nestin-Cre trans tillatt for målretting av ~70% av akinærceller (Fig. 1B). LacZ farging ble kun observert i acinar strukturer, aldri i ductal, endokrine eller centroacinar celler (Fig. 1B) og co-immunfluorescens med ductal markør cytokeratin 19 (CK19) bekreftet denne observasjonen (Fig. 1C-E). Disse resultater viser at embryoniske pankreatiske nestin-uttrykkende progenitorceller ikke gir opphav til ductal-celler (fig. 1F). Uttrykk for LacZ ble også sjelden observert i bukspyttkjertelen ikke-parenkymatøs celletyper som endotelceller og mesenchymale celler (ikke vist).
Akutt pankreatitt akselererer dramatisk lesjon progresjon i N /K pankreata
Mellom 2 6 måneder, N /K musene lav karakter PanINs i begrenset antall (2-10 isolerte lesjoner eller små foci per avsnitt), samt begrensede områder av acinar å ductal metaplasi (ADM) (fig. 2A-B, G) lik det som er observert i Pdx1-Cre; LSL-Kras
G12D (P /K) mus [4], [14]. Mens med tiden P /K mus kan utvikle PDAC men ved svært lav frekvens, N /K mutant mus sjelden overlevde siste 6 måneder på grunn av alvorlige nevrologiske problemer, hindrer oss i å følge en mulig progresjon til kreft i bukspyttkjertelen.
( A-F) H (C-F) caerulein behandlet pankreata showet omfattende dysplasi med en blanding av lav (*) og høyverdig (pilspiss) lesjoner (D, innfelte av C) og (E) samt ADM foci (markert med stiplet linje ) (F). (G) Morfometrisk analyser viser dramatiske økninger i antall dyr som viser høy klasse Panin lesjoner og områder av microinvasion i caerulein behandlet pankreata. (H) En betydelig økning av spredning er observert i caerulein behandlet pankreata (* P 0,05, ** P 0,01). Skala: 50 um
Vi har tidligere vist at to episoder av akutt pankreatitt (AP) indusert av caerulein akselerert Panin progresjon fra lav- til høyverdig og økt PDAC frekvens i P /K. musemodell [14]. For å teste muligheten for at mutert Kras aktivering i nestin avstamning kan føre til PDAC, en kohort av 17 2 måneder gamle N /K mus ble utsatt for caerulein behandling. Caerulein er en cholecystokinin (CCK) analog som binder seg til og aktiverer CCK-reseptoren [19], [20]. Mens stoffet dosering vi brukte er lav sammenlignet med de som brukes av andre grupper [21], [22], ble det observert omfattende tap av akinærceller i villtype mus på 24 og 48 timer etter AP, samtidig med en dramatisk inflammatorisk infiltrasjon og interstitiell ekspansjon (Fig.S1) som beskrevet av andre [21], [22], [23]. En uke etter AP, ble nesten fullstendig regenerering av bukspyttkjertelen observert ved histologisk nivå, med sjeldne rest inflammatoriske infiltrater mens spredning nivåer forble høy som vist ved Ki67 ekspresjon i akinærceller (Fig.S1A-D). Disse resultatene er i samsvar med en annen publisert rapport [15]. For å vurdere muligheten for at følgende bukspyttkjertelen skade, kan nestin uttrykk påvises i ulike bukspyttkjertelen celletyper, ble kortvarig avstamning tracing eksperimenter gjort. LacZ flekker i nestin-Cre /R26R pankreata, en uke etter caerulein behandling, ble kun observert i acinar strukturer og ingen farging ble påvist i endokrine, centroacinar eller duktale celler (ikke vist).
Alle 17 caerulein behandlet N /K mus begynte å bli syk da de var ca 4 måneder gammel, 2 måneder etter behandling, og måtte ofres. Seks dyr gikk tapt uten obduksjon. I motsetning bare 3 av 9 ubehandlet N /K mus døde, og ingen av de andre ble ofret på grunn av sykdom i løpet av denne perioden. P /K-mus når den utsettes for AP ikke har kortere levetid enn ubehandlede mus i det minste over en periode på 8 måneder (ikke vist). Disse observasjoner antydet at nedgangen i total overlevelse av N /K-mus fra 6 til 4 måneder ikke var direkte relatert til bukspyttkjertelen insuffisiens. Fire måneder gamle N /K pankreata oppviste noen Panins-1A og -1B og sjeldne ADM foci (mindre enn 5% av den seksjon) (Fig. 2A, B og G). To måneder etter caerulein-indusert AP omfattende bukspyttkjertelen dysplasi ble observert i N /K pankreata preget av en blanding av lav- og høy klasse Panin og store ADM foci (Fig. 2C-F). Økningen i lesjon klasse og omfattende ADM ble dokumentert av morfometriske analyser som sammen tilstedeværelse og grad av lesjoner mellom seksjoner fra behandlede og ubehandlede N /K mus. Mens de fleste seksjoner fra ubehandlet I /K pankreata utstilt lavgradige lesjoner bare og mindre enn 5% av den delen presenteres ADM, viste mest caerulein behandlet pankreata betydelige økninger i Panin-2 og -3 (P 0,0002) samt omfattende ADM som dekker 15-95% av bukspyttkjertelen (fig. 2G). Disse resultatene er lik de som vi har observert i en parallell kohort av P /K kastet ved 2 måneder gamle til caerulein-indusert AP (Fig.S2); P /K Musene ble avlivet 6 måneder etter behandling (i en alder av 8 måneder) som forklarer høyere forekomst av høyverdig lesjoner og PDAC /microinvasion både ubehandlede og behandlede mus. Som observert i N /K mus, hele caerulein behandlede P /K mus viser omfattende ADM dekker 25-95% av delene (P 0,001) og dramatisk progresjon til høygradige lesjoner og PDAC (Fig.S2). I kontrast, i alle kontrolldyrene (villtype eller bære en enkelt mutasjon, nestin-Cre, Pdx1-Cre eller LSL-Kras
G12D only) behandlet med caerulein, den pankreata syntes å være normal med tidvis gjenværende spor av betennelse ( ikke vist).
Low-grade lesjoner i N /K pankreata viste en spredning indeks over 13% ± 3% lik det som er observert i P /K mus [4]. Høy grad av lesjoner observert etter caerulein behandling viste som forventet en høy spredning index (55% ± 3%), men interessant lavgradige lesjoner viste også en høyere spredning indeks over 31% ± 4% (Fig. 2H, S3A). Dermed blir generell økning i proliferasjon observert i bukspyttkjertelen umiddelbart etter AP episoder [21] ble opprettholdt i 2 måneder etter skade, men bare i de neoplastiske lesjoner i nærvær av et aktivert Kras allel.
Som observert i humane PDAC prøver, uttrykt PanINs høyt nivå av CK19, og understreker deres epitel karakter, fremvist slimakkumuleringen, som vist ved Muc5a uttrykket (Fig.S3B-C), og var omgitt av kollagenrikt stroma (fig. S3F). Forandringene viste en reaktivering av den tidlige pankreatisk progenitor markør Pdx1 samt hakk signale markør Hes1, begge kjent for å bli reaktivert i tidlige stadier av PDAC (Fig.S3D-E). ADM ble demonstrert ved samtidig uttrykk for acinar og duktale markører i de samme cellene (Fig.S3G-I) som observert av andre [24]. Disse data bekrefter at caerulein-indusert AP påvirker ikke innholdet av lesjoner på molekylært nivå, men akselererer sin progresjon til høy klasse.
Det ble vist nylig at den inflammatoriske megler Stat3 og interleukin IL6 var viktige bidragsytere til Panin progresjon og PDAC utvikling i hvert fall i de tidlige stadier av sykdommen, og var viktige komponenter for akutt respons på caerulein-indusert AP [16], [25]. Immunhistokjemisk analyse i N /K pankreata viste at fosfor-Stat3 var fortsatt sterkt uttrykt 2 måneder etter AP (Fig. 3) mens IL6 ikke er registrert (ikke vist). Fosfor-Stat3 ble vist tidligere for å være høyt aktivert i PanINs umiddelbart etter AP episoder [16], [25]. Men to måneder senere fosfo-Stat3 synes ikke å være uttrykt i lesjonene i seg selv, men ble rikelig detektert i inflammatoriske celler, i ADM og foci i grupper på tilsynelatende normale akinærceller (Fig. 3A-D). Tilsvarende, i ubehandlede N /K-mus, fosfo-Stat3 sjelden ble påvist, og bare i celler som omgir de PanINs (ikke vist).
(A-D) IHC for fosfo-Stat3 i N /K pankreata 2 måneder legge caerulein behandling. (A) Lav forstørrelse bilde av et representativt område. Fosfor-Stat3 er sjelden til uttrykk i utviklingen Panin lesjoner, men er observert i cellene som viser en normal ductal morfologi (B, piler); (Det er hovedsakelig uttrykt i inflammatoriske celler (C), i celler som gjennomgår ADM (C, D, piler), så vel som i morfologisk normale akinærceller (D, pilspisser) Skala:.. 20 um
onkogent Kras aktivering i nestin cellen avstamning fører til PDAC utvikling
i halvparten av musene utsatt for AP, områder med microinvasion kan observeres i den pankreata som vist ved tap av basalmembran i noen PanIN- 3 (fig. 4A-B) og CK19 ekspresjon i celler i tilstøtende stroma (fig. 4C). fra en liten gruppe av 4 N /K dyr behandlet med caerulein på senere stadier (4 måned gamle), 3 overlevde inntil alder 6 måneder og av disse, 2 viste tumorer (diameter ~ 5 mm) synlig på brutto anatomiske nivå. Bare en svulst var tilgjengelig for histologisk analyse, som viser den morfologiske karakteristisk for PDAC, og avslørende lokal infiltrasjon av fett og fibrøse vev (Fig . 4D). til tross for det faktum at kjernene var forstørret og overfylt, ble en kjertel morfologi vedlikeholdes og lav til høy grad av PanINs ble også observert (fig. 4E-F). Store deler av bukspyttkjertelen vises omfattende ADM (ikke vist). Som observert i humane PDAC, tumorene var meget proliferativ som vist med Ki67-ekspresjon (fig. 4G) og omgitt av påfallende reaktiv stroma karakterisert ved glattmuskel-aktin (SMA) ekspresjon (Fig. 4 H). Mens vi også observert høye nivåer av Cox2 i PanINs, sitt uttrykk var lav i kreftcellene som er overraskende som den er kjent for å være oppregulert i menneskelig PDAC (Fig. 4I).
Høy grad av lesjoner vise microinvasion (A, pilspisser) og (B) som vist ved CK19 uttrykk (tilstøtende seksjon) i celler i tilstøtende stroma (C); (D) Lav forstørrelse viser lokal invasjon av fett og fibrøse vev (piler). (E) Nuclei forstørres, er overfylt og kjertel morfologi opprettholdes. (F) Lav grad PanINs (stjerner) er observert i nærhet med adenokarsinom (piler). (G) adenokarsinomceller er meget proliferativ som vist med Ki67 ekspresjon. De er omgitt av reaktive stroma karakterisert ved SMA uttrykket (H). Cox2 uttrykk mens høyt i PanINs (piler) er fraværende fra adenokarsinom per se (pilspisser) (I). Skala: 20 mikrometer
nestin uttrykkes i mennesker og mus Panin
Etter AP, gjennomgår bukspyttkjertelen intense spredning og regenerering, og økninger i nestin uttrykk har blitt observert ved forskjellige. grupper [26], [27]. Det er uklart om denne økning skjer via en utvidelse av en allerede eksisterende populasjon av voksne nestin-uttrykkende celler, eller er på grunn av en forbigående ekspresjon av nestin i dedifferentiating og prolifererende akinærceller. Vi viser nå ved immunhistokjemi som nestin konsekvent uttrykt i muse Panin fra lav til høy klasse samt i menneskelige PanINs og PDAC (Fig. 5)
(A-D) Menneskelig Panin.; mus Panin i NK (E-G) og PK (I-K). Overlegg av CK19 (grønn), nestin (rød) og Hoescht (blå) viser klart koekspresjon av nestin med CK19 i lesjoner (A, E, I). I motsetning til dette, i normale kanaler, bare CK19 uttrykkes (piler) (H, L). (D) på menneskelig vev, det sekundære antistoff alene genererer høy bakgrunn i stroma, men ingen uttrykk i Panin (pil). Skala:. 20 mikrometer
Diskusjoner
Vi viste tidligere at N /K og P /K musemodeller utvikle lav karakter PanINs med lignende timing og effektivitet mellom 2 og 4 måneder av alder [6]. Disse data antydet at PDAC innvielsen skjedde hovedsakelig i nestin celle avstamning, som består i bukspyttkjertelen av akinærceller og sjelden voksne bukspyttkjertelen nestin-uttrykke celler. Likevel, den begrensede overlevelse av N /K mus siste 6 måneder hindret oss fra å forfølge forhold til PDAC scenen. I denne studien, viser vi at to nære episoder av caerulein-indusert AP i to måneder gamle NK mus ikke bare føre til rask Panin progresjon fra lav- til høyverdig, men også med lav frekvens fører til PDAC. Progresjonen effektivitet ligner igjen til en observert i P /K mus etter caerulein-indusert AP [14]. Disse dataene viser at N /K mus er en bona fide modell av PDAC, og ytterligere støtte at bukspyttkjertelen nestin avstamning er cellen avstamning som er hovedsakelig reagerer på Kras mutasjon i bukspyttkjertelen.
Satsingen på onkogene Kras til acinar rommet, ved hjelp av ulike acinar spesifikke arrangører også fører til utvikling i voksen mus av PanINs [8], [9] og sjeldne invasiv PDAC [7]. I N /K-mus, er Kras
G12D aktivert i akinærceller så vel som i voksne nestin-uttrykkende celler. Disse senere cellene utgjør mindre enn 0,1% av de totale bukspyttkjertelen, vises integrert i acinar struktur, men viser ikke differensieringsmarkører (manuskript under utarbeidelse, CC og MK). På dette stadium gjenstår deres funksjon ukjent. Det er viktig å merke seg at nestin regulatoriske elementer som benyttes for disse forsøk rettet mot alle nestin-uttrykkende celler i dyret [17]. Cre uttrykket kan spores noen ganger i endotelceller og mesenkymale celler, men det er ingen data i litteraturen tyder på at kreft i bukspyttkjertelen kan starte i ikke parenkymceller. Dermed tas sammen, disse dataene gir sterke bevis for en ikke-ductal celle opprinnelse PDAC minst i musen.
progresjon fra Panin til kreft er dramatisk akselerert når musene utsettes for miljø fornærmelser som kronisk pankreatitt [7], [10]. Disse dataene korrelerer med humane epidemiologiske studier som viser at kronisk pankreatitt øker risikoen for å utvikle PDAC [13]. Våre data og andre viser at caerulein-indusert AP fungerer som kreft promoter i PDAC musemodeller [14], [15], [16], noe som tyder på at AP, da forekommer i et individ hvis bukspyttkjertelen havner en Kras mutasjon, kan potensielt øke PDAC risiko.
Ved hvilke mekanismer som gjør AP påvirke kreft progresjon? Utvinning fra AP hos mennesker ikke nødvendigvis føre til irreversibel skade, og kan være forbundet med pankreatisk regenerering [28] som ble observert i mus. I løpet av de første 3 dagene etter caerulein behandling, mus bukspyttkjertel utvikle rørformede strukturer i steden for acini [23], og avstamning sporing forsøk under anvendelse av den elastase-promoteren tyder på at en del av disse rørformede strukturer er avledet fra akinærceller som synes å dedifferentiate, ved å gå gjennom en ductal lignende metaplastiske mellomtilstand før vi går spredning [23], [29]. Nye akinærceller kommer da i hovedsak fra forhåndsdefinert akinærceller [22], [23], [29] og må gjennomgå en sekundær ductal å acinar metaplasi (DAM), et viktig skritt for bukspyttkjertelen regenerering [15]. Interessant å følge AP, akinærceller som uttrykte onkogene Kras døde eller gikk ADM. Blant de acinar strukturer som gjennomgår ADM, noe som syntes å gi opphav til Panins, i det minste i løpet av den korte perioden hvor mus ble analysert for [15]. Pancreas regenerering også ut til å bli stoppet som tyder på at Kras
G12D-uttrykkende celler som gjennomgikk ADM var ikke i stand til å gjennomgå den omvendte prosessen DAM å generere nye akinærceller [15]. Vi observerte omfattende ADM /lavgradig Panin formasjonen i både P /K og N /K pankreata i 2-6 måneder etter AP hevder igjen at stort antall bukspyttkjertelen celler svare på onkogen aktivering. Likevel kan bare få høyere grad kreft blir oppdaget. Det tyder på at mens de fleste akinærceller svarer til en viss grad å onkogene Kras følgende caerulein-indusert AP ved gjennomgår ADM, er de ikke i stand til å gå videre til høyere grad lesjoner og PDAC.
nestin uttrykk er oppregulert i forskjellige modeller av bukspyttkjertel regenerering og nestin har vært foreslått som en forbigående markør av acinar dedifferentiation [26], [29]. Det er også kjent som en stamcelle markør både under embryogenese og voksen i forskjellige organer. Man kunne da tenke seg at pankreatisk voksen nestin-uttrykkende celler er nemlig voksne acinar progenitorer og at bukspyttkjertel regenerering følgende AP skjer delvis via utvidelsen av disse forløpere. Som sådan, ville voksen nestin-uttrykke celler potensielt være mer kompetent for kreft initiering og progresjon følgende AP-indusert spredning, som foreslått av uttrykk for nestin i alle grader lesjoner både i mennesker og hos mus. Flere eksperimenter vil bli pålagt å vurdere disse mulighetene.
Nyere arbeider viste at den inflammatoriske mediator Stat3 aktiveres på alle stadier av kreft i bukspyttkjertelen fra lavgradig Panin til PDAC og er nødvendig for kreft progresjon [25], [ ,,,0],30]. AP forårsaker forbigående Stat3 aktivering i normale bukspyttkjertelen. I P /K mus, caerulein-indusert AP fører til en betydelig oppregulering av fosfor-Stat3 både i neoplastiske lesjoner og de omkringliggende mikromiljøet i 2-3 uker etter at induksjon. Faktisk ble det fosfo-Stat3 vist å være direkte ansvarlig for den akselererte neoplastisk progresjon i P /K-mus etter AP [16]. I vår modell to måneder etter AP, fosfor-Stat3 ble bare sjelden påvist i PanINs. I motsetning til dette ble det uttrykt hovedsakelig i de omkringliggende inflammatoriske celler, og i ADM brennpunkter, så vel som i små grupper av histologisk normale akinærceller. Disse observasjonene tyder på at Stat3 aktivisering kan være involvert i metaplastiske prosesser som initierer trinnene i neoplastisk transformasjon. Det faktum at store deler av ADM fremdeles observert etter 2 måneder antyder også at andre hendelser er nødvendig for ADM å gå videre til Panin. Økte nivåer av Kras
G12D aktivitet kan være en viktig komponent for denne progresjon [31], [32].
Nyere studier viste at PDAC vokser sakte over flere tiår og metastaserer bare i «sent» faser [ ,,,0],33], [34]. Dette tyder på at tidlig oppdagelse og forebygging kan være de mest verdifulle måter å konfrontere denne svært dødelig kreft. Definere celletyper som kreft kan initiere samt forstå mekanismer som miljøskader kan påvirke kreft progresjon er både viktig for disse tilnærmingene.
Materialer og metoder
Alle dyreforsøk ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved Dartmouth College, protokollnummer. 07-09-07
mus koloni generasjon
LSL-Kras
G12D (01XJ6-B6, 129 -Kras2
tm4Tyj) mus ble generert av DA Tuveson og T. Jacks [35] og innhentet fra MMHCC, NCI. Nestin-Cre mus (B6.Cg-Tg (Nes-CRE) 1
Kln /J) som genereres av R. Klein [17] ble kjøpt fra Jackson laboratoriet. Pdx1-Cre mus var en gave fra G. Gu [35]. All genotyping ble gjort av PCR følge vilkårene for leverandørene. To tilfeller av akutt pankreatitt ble indusert ved en serie på syv time intraperitoneale injeksjoner av caerulein gitt på 2 dager, som beskrevet [14]. Caerulein (Sigma, St. Louis MO) ble fortynnet i PBS og injisert ved en dose på 50 pg /kg kroppsvekt. En andre gruppe av sammensatte mutante dyr og kontrolldyrene mottok injeksjoner av PBS bare. Alle dyr ble fastet i 12 timer før forsøket.
Histologi og immunhistokjemi
Mus ble perfusert med PBS og deretter 10% formalin /PBS og pankreata dissekert. For βGalactosidase farging ble vev overføres direkte etter perfusjon i 30% sukrose ved 4 ° C, og 24 timer senere cryoembedded i oktober sammensatte. For histologi og mest farging, ble pankreata faste over natten og behandlet for parafin innebygging. Rutinemessig Hematoxylin og Eosin (H H E og immun bildene ble tatt med fargeinnstillingene. Photoshop ble brukt til å behandle bildene.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Caerulein behandling fører til akutt pankreatitt. H E farging av pankreata ubehandlet (A) og behandlet med caerulein (B, C). (B) 48 timer etter caerulein behandling (48 timer etter C), viser bukspyttkjertelen omfattende ADM, eksokrin atrofi og inflammatorisk infiltrasjon. (C) Ved en uke etter C, bukspyttkjertelen gjenvunnet sin normale morfologi, men høye nivåer av proliferasjon blir fortsatt observert som vist ved Ki67 uttrykk (D)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027725.s001
(TIF)
Figur S2.
Morfometrisk analyser av P /K mus, 6 måneder etter caerulein-indusert AP. Dramatisk økning i antall dyr som viser omfattende ADM, høy klasse lesjoner og PDAC /microinvasion områdene er observert sammenlignet med ubehandlede dyr
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027725.s002 plakater (TIF)
Figur S3.
Panin karakterisering i NK mus. (A) Ki67 flekker viser en klar økning i spredning i lav og høy grad av lesjoner. Høy grad PanINs uttrykke CK19 (B), Muc5a (C). Embryonale stamceller markører reaktiveres (D, E). (F) Masson største Trichrome blåfarging viser tilstedeværelsen av kollagen rundt Panin lesjoner. (G) omfattende ADM er observert som vist ved koekspresjon av CK19 (grønn, H) og amylase (rød, I) i de samme cellene (hvite pilspisser). Skala: 20 mikrometer
doi:. 10,1371 /journal.pone.0027725.s003 plakater (TIF)
