Abstract
I Balkan og Taiwan, forholdet mellom eksponering for aristolochic syre og risiko for uroteliale svulster ble utledet fra A T genetisk kjennetegn i
TP53
gen fra ondartede celler. Denne studien hadde som mål å karakterisere
TP53
mutasjons spektrum i uroteliale kreft rad til Aristolochic Acid Nefropati i Belgia. Serial frossen tumorsnitt fra kvinnelige pasienter (n = 5) som utsettes for aristolochic syre i løpet av vekt-tap diett ble alternativt anvendes enten for p53 farging eller laser mikrodisseksjon. Vevsområder med minst 60% p53-positive kjerner ble valgt for microdissecting seksjoner i henhold til p53-positiv samsvarende områder. Alle områder viste seg å være carcinoma in situ. Etter DNA-ekstraksjon, ble mutasjoner i
TP53
hot spot region (eksoner 5-8) identifisert ved hjelp av nested-PCR og sekvensering. Falske-negative kontroller bestod i microdissecting fersk frosset tumorvev både fra en pasient med en Li-Fraumeni syndrom som bar en p53 konstitusjonell mutasjon, og fra
Kras
muterte adenokarsinomer. For å utelukke falske positive resultater potensielt generert av mikrodisseksjon og nestet-PCR, en phenacetin-assosiert urothelial karsinom og normale friske urinleder vev (n = 4) ble behandlet med høy laser makt. Ingen uventede resultater blir identifisert, ble molekylær analyse forfulgt på ondartet vev, som viser minst en mutasjon i alle (seks forskjellige mutasjoner i to) pasienter, med 13/16 exonic (tull, 2; missense, 11) og 3/16 intronic ( en spleisesete) mutasjoner. De ble distribuert som overganger (n = 7) eller transversions (n = 9), med en lik forekomst av A T og G T (3/16 hver). Mens dagens resultater er i tråd med A T utbredelsen tidligere rapportert i Balkan og Taiwan studier, de viser også at flere mutasjoner i
TP53
hot spot regionen og en høy frekvens av G T transversjon vises som en komplementær signatur reflekterer giftigheten av en kumulativ dose aristolochic syre inntak over en kort periode
Citation. Aydin S, Dekairelle AF, Ambroise J, Durant JF, Heusterspreute M, Guiot Y, et al. (2014) Entydig Påvisning av flere
TP53
genmutasjoner i AAN-Associated urothelial Kreft i Belgia Bruke Laser Capture mikrodisseksjon. PLoS ONE ni (9): e106301. doi: 10,1371 /journal.pone.0106301
Redaktør: Robert Hurst, Oklahoma University Health Sciences Center, USA
mottatt: 02.06.2014; Godkjent: 29 juli 2014; Publisert: 3. september 2014
Copyright: © 2014 Aydin et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer. Etikk uttalelsen ble innført under belgiske registreringsnummer B40320095694
Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
Aristolochic Acid Nefropati (AAN) ble først rapportert i begynnelsen av 1990-tallet i belgiske pasienter som har foretatt en vekt-tap diett forurenset med aristolochic syre (AA) [1], [2] . AAN er kjennetegnet ved en hurtig progressiv interstitiell nefropati med rørformet proteinuri og glukosuri, tidlig alvorlig anemi, omfattende hypocellular interstitiell fibrose avtar fra det ytre til det indre kortikale labyrinten, og en hurtig utvikling av urinveisovergangs karsinomer i 40-46% av pasienter innen 2-6 år etter avsluttet eksponering [3] – [6]. AAN er nå anerkjent som en ødeleggende sykdom som forekommer over hele verden med så mange som 100 millioner mennesker potensielt i fare for AA eksponering [7]. Mens mekanismen for AA nefrotoksisitet gjenstår å bli grundig undersøkt, er kreftfremkallende aktivitet for tiden knyttet til gentoksisitet av AL (aristolactam) -DNA addukter preget av en høy frekvens av A T transversjon i
TP53
tumorsuppressorgenet av AA-assosiert svulster. Det er godt dokumentert i dyreforsøk [8], [9] og, selv om det ikke er gjennomgående, i pasienter som viser kliniske og histopatologiske likhetstrekk med de opprinnelige belgiske AAN tilfeller [10] – [14]. Mens AL-DNA addukter demonstrerer AA eksponering er godt dokumentert i nyre vev fra den belgiske kohorten [6], [15], [16], tilstedeværelse av A T transversjon vitne til årsakssammenheng mellom eksponering og kreft hadde ennå å være undersøkt. Målet med dette arbeidet var derfor å karakterisere
TP53
mutasjonsspekteret i frosne prøver av ondartede uroteliale vev fra belgiske AAN pasienter som bruker grundig validerte genotyping metoder.
Pasienter og metoder
Etikk erklæringen
i 2001 ble en studie om genetisk polymorfisme av enzymer involvert i metabolismen av aristolochic syre blant belgiske AAN pasienter godkjent av Prof JM Maloteaux, leder av Avdeling for medisin og helsefag forskningsetikk Komiteen Université Catholique de Louvain (Belgia). Etter etiske komité godkjenning, ble et skriftlig informert samtykke fra hver pasient fra den belgiske AAN serien. Disse studiedata forble upublisert.
I 2009, et tillegg til pilotstudie defineres spesifikt gjeldende
TP53
forskning som ble utført på vevsprøver fra fem AAN pasienter rapportert i denne studien, og ble akseptert som sådan av den forskningsetiske komité for Université Catholique de Louvain (Belgia) som en videreføring av studien startet i 2001. Vevsprøver fra pasienter 1-5 som var en del av den opprinnelige studien (2001) ble anonymisert før analyseverktøy.
Blodprøver prøver~~POS=HEADCOMP var en del av en tidligere studie (UCL etiske komité godkjenning referansenummer. 2003/05/03/08) [17]. Adenokarsinom og kirurgisk ureter prøver ble samlet inn fra AA-urelaterte pasienter som en del av deres medisinsk behandling og ble anonymisert før analyse. Etter skriftlig informasjon, ble adenokarsinom vev lagret i UCL Biologisk bibliotek (https://www.centreducancer.be/fr/show/index/section/8/page/34). Ikke AA-relaterte ureter prøver tatt fra nephroureterectomies fjernet på tidspunktet for nyretransplantasjon ble brukt som kontroller i denne studien med en kodifisering etter patologisk analyse i samsvar med de belgiske lover på vev bank (2008).
blunk -frozen granulosa-celletumor prøven fra Li-Fraumeni pasient ble oppnådd fra den biologiske UCL biblioteket (samme som ovenfor). Etter skriftlig samtykke fra foreldrene, ble denne prøven anonymisert før bruk.
Forrige rapporterte data omfatter AL-DNA addukter identifisert i nyrevevet fra pasienter 1, 3, 4 [15], [16], [18 ] og
TP53
gensekvensering utført i en blære TCC fra pasient 1 [10].
AAN pasienter
Fem AAN pasienter henvist til Cliniques Universitaires Saint-Luc (Brussel, Belgia) ble studert (tabell 1). Alle var kvinner med en gjennomsnittsalder på 42,8 år (spredning: 27-53) på presentasjonen. En pasient var en røyker. Ingen hadde en historie med smertestillende misbruk eller typiske trekk ved analgetisk nefropati. De har alle gjennomgikk bilateral nephroureterectomy enten på tidspunktet for nyretransplantasjon eller senere for øvre urinveis maligniteter. Dessuten, en pasient gjennomgikk også transuretral resections av tilbakevendende overgangsordning celle carcinoma (TCC) av blæren og, til slutt, cystektomi. Diagnosen AAN var basert på følgende kriterier: AA inntak gjennom et vekttap diett phytochemically demonstrert som forurenset (pasienter 1, 2, 3 og 5), en typisk nedsatt histologi av interstitiell fibrose (alle fem pasienter), identifisering av AL -DNA addukter i nyrevev (pasient 1, 3 og 4) og utvikling av øvre urinveis malignitet (alle fem pasienter) [15], [16], [18]. I pasient 4, inntak av AA kan imidlertid aldri bli formelt bevist da hun hevdet å ha deltatt på vekttap klinikken før regimet forurenset med AA (såkalt «formel 2») ble innført [1]. Likevel, alle fem pasienter oppfylle nylig foreslåtte kriteriene for en sikker diagnose av AAN [19] i den aktuelle saken serien. Riktignok mangler
TP53
mutasjonsstatus, er det verdt å merke seg at pasienten 1 er n ° 3 i referanser 4, 5, 15 og 16, pasient 2 er n ° 7 i referanse 5, pasient 3 er n ° 4 i referanser 15 og 16, n ° 5 i referanse 5 og pasient 4 er n ° 2 i referanse 20 og nummer n ° 8 i referanse 18 mens pasienten fem har ennå ikke blitt rapportert.
Operasjon prøver
Vev fra fem pelvi-ureterectomies og et enkelt cystektomi ble valgt på grunnlag av tilgjengeligheten av frosne materiale. Carcinoma
in situ plakater (CIS) og papillær TCC ble diagnostisert i henhold til 2004 WHO klassifisering av uroteliale svulster [21], [22]. Ensidige multifokale Cis utviklet i høyre øvre urinveier (bekken, øvre, midtre og nedre urinleder) i to pasienter (pasient 1 og 5). Mens urinleder Cis invadert fokalt lamina propria i pasient 1, hun også utviklet blære papillær TCC. Bilaterale multifokale Cis utviklet i den øvre urinveiene av de 3 gjenværende pasientene. Forsinkelse mellom slutten av eksponering og kirurgi i gjennomsnitt 44,75 måneder (15-96) hos pasienter 1, 2, 3, 5 og var utilgjengelig i pasient 4. I de tidligere fire pasienter, ensidig og bilateralt TCC ble diagnostisert et gjennomsnitt på 61 måneder ( Område: 27-96) og 41 måneder (variasjon: 18-64) etter utløpet av kjente eksponering, henholdsvis
p53 immunhistokjemi (IHC)
cIS ble identifisert ved lysmikroskopi på hematoxylin eosin. farget seksjoner fra frosne pelvi-ureter prøver. Ut av serie frosne seksjoner (7 mikrometer tykt), §§ n ° 1, n ° 3 og n ° 5 ble brukt for p53 immunhistokjemi (IHC) og holdt over natten ved 37 ° C, mens seksjonene n ° 2, n ° 4 og n ° 6 ble anvendt for laser mikrodisseksjon. De sistnevnte tre delene ble plassert på biokjemisk inerte Polyetylen naphtalate (PEN) membran dekket lysbilder og holdt ved -20 ° C inntil bruk. For p53 IHC, seksjonene holdt ved 37 ° C ble deretter fiksert i 4% formaldehyd i 3 timer. Endogen peroxydase ble blokkert med 0,3% hydrogenperoksid i avionisert vann i 30 minutter. Platene ble inkubert ved 97 ° C i 75 minutter og skyllet i en oppløsning inneholdende avionisert vann og triton 0,05%. Seksjonene ble deretter dekket i 30 minutter med 10% normalt geiteserum (NGS) inneholdende 1% bovint serumalbumin (BSA), fortynnet i tris-triton. De ble inkubert over natten ved romtemperatur med anti-p53 monoklonalt antistoff fra mus DO-7 (Biocarta, Europe GmbH) i en fortynning på 1:1000. Etter vasking med Tris-triton 0,05%, ble platene inkubert ved romtemperatur i 75 min med et klar-for bruk anti-mus EnVision-peroksidase-systemet (Dako, Glostrup, Danmark) i henhold til produsentens protokoll og motfarget med hematoksylin. En normalt geiteserum ble anvendt som negativ kontroll.
Overekspresjon av p53 ble definert som nukleær farging uavhengig av IHC intensitet. Omfattende p53 farging av IHC har tidligere blitt anbefalt å forbedre mutasjonsdeteksjonsraten av
TP53 product: [23]. Følgelig ble det bare vevsområder som inneholder mer enn 60% av positive kjerner som er valgt for mikrodisseksjon. Nøyaktig matchende områder fra enda ubehandlet seriesnitt (n ° 2, n ° 4 og n ° 6) gjennomgikk mikrodisseksjon så detaljert heretter.
Laser fangst mikrodisseksjon
Etter toluidinblått flekker, hver unfixed frosset vevsområdet som samsvarer nøyaktig det området av interesse definert i henhold til p53 IHC objektglass ble isolert ved anvendelse av en PALM micro system (Bernried, Tyskland) utstyrt med en pulset UV nitrogen-laser (bølgelengde: 337 nm; puls~~POS=TRUNC energi 270 μJ, pulsvarighet 3nsec , pulsfrekvens 1-30 /sek) og PALM Robot Software versjon 2.2. Systemet var koblet til en Axiovert 200 mikroskop og en plan Neofluar 20 x (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). Microdissected foci ble slynget inn i en microtube cap og fryses ved -20 ° C til DNA-ekstraksjon (figur 1).
A-G TCC område som inneholder mer enn 60% p53 farget atomkjerner av IHC kontra med hematoksylin fra frosne delen av ureter (A). For laser capture mikrodisseksjon, ble en toluidinblått farget område i et representativt frosne delen matchet (B), kutt (C) og slynget (D) i hatten for en mikrorør (E). 3′-5’dideoxy sekvense elektroferogrammet av segmentet av p53 som viser villtypesekvensen (F, pil) og A T transversjon (G, pil) som fører til missense mutasjon E286V i exon 8.
DNA ekstraksjon
I hver hette, 10 ul av en oppløsning inneholdende EDTA 0,001 M (pH 8), Tris-HCl 0,02 M (pH 8), 0,5% Tween 20, proteinase K (2 mg /ml) og ultrarent vann var inkludert. Etter blanding og sentrifugering ble hvert reaksjonsrør belagt med en dråpe mineralolje for å hindre fordampning og inkubert over natten ved 55 ° C med kontinuerlig omrøring (600 rpm). Ultrarent vann (5 ul) ble deretter tilsatt til reaksjonsrøret for å øke det endelige volum av oppløsningen. Etter sentrifugering, ble løsningen oppvarmet ved 99 ° C i 10 minutter for å inaktivere proteinase K. Endelig ekstrakten ble overført til en annen microtube.
Nested PCR-
Eksoner 5 til 8, tilsvar til p53-DNA-bindende domene, et såkalt «hot spot» for
TP53
genmutasjoner [24], ble amplifisert ved nested-PCR. For det første PCR-runde, ble 3 pl av DNA ekstrahert fra hver microdissected prøve tilsatt til en endelig 50 ul PCR-blanding inkludert 2,25 mM MgCl
2, 0,2 U /pl Taq-gull-polymerase (Ampli Taq-gull, Applied Biosystems, Roche) , 0,2 mM dNTP og 12:02 /ul primere (Eurogentec, Liège, Belgia) (tabell 2). En innledende inkubering ved 95 ° C i 4 minutter, etterfulgt av 25 sykluser (95 ° C i 30 sek, 60 ° C bortsett fra ekson 7 hvor glødetemperaturen var 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 1 min) og en endelig forlengelse på 7 minutter ved 72 ° C. Den andre PCR-runde ble utført med 2,5 ul av det første PCR-produktet ved bruk av de samme betingelser som for den første runden, bortsett fra at 1,5 mM MgCl
2 og 0,4 U /pl Taq-gull-polymerase ble brukt for exon 6. ultrarent vann ble brukt som negativ kontroll mens DNA ekstrahert fra ubeslektede blodprøver ble brukt som kontroll for
TP53
forsterkning.
Sekvensanalyse analyse~~POS=HEADCOMP
amplifiserte produkter ble renset ved hjelp MSB Spin PCRapace kit (STRATEC Molecular GmbH, Berlin, Tyskland) i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvensanalyse ble utført på en automatisert ABI 377 A apparat (Applied Biosystems, Foster City, CA), ved hjelp av Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing kit fra samme produsent og i henhold til sin instruks.
TP53
referansesekvens fra Genbank var NC_000017.10.
Vurdering av potensialet
TP53
-artifactual endringer i vevsprøver
(a) For å vurdere evne til gjeldende mikrodisseksjon prosedyre for å identifisere DNA mutasjoner, fire colo-endetarms adenokarsinomer tidligere undersøkt for
Kras
mutasjon ved rutinemessig klinisk testing på FFPE (formalinfiksert parafin-embedded) vevsprøver ble valgt. To av dem bæres en mutasjon og to var vill-type. Disse fire prøvene ble valgt fordi en snap-frosset motstykke ble holdt lagret ved -70 ° C i Kreft Menneskelig Bio-bank av Université Catholique de Louvain (https://www.uclouvain.be/416846.html). Laser mikrodisseksjon og DNA-ekstraksjon av hurtigfrosset adenokarsinom prøver ble utført under anvendelse av fremgangsmåten beskrevet ovenfor, og resultatene av
KRAS
testing ble sammenlignet. I tillegg var et blunk frosne granulosa-celle tumor prøven fra en 15 år gammel ung jente med et Li-Fraumeni syndrom analysert ved hjelp av samme mikrodisseksjon prosedyre. Mens den konstitusjonelle mutasjonen hadde allerede blitt identifisert av FASAY (funksjonell analyse av separerte alleler i gjær) av
TP53
mRNA ekstrahert fra perifere mononukleære celler hos pasienten [25], tumor prøve ble undersøkt for ytterligere å bekrefte evne til gjeldende mikrodisseksjon prosedyre for å identifisere riktig denne
TP53
mutasjon i frosne deler av svulsten.
(b) Om snap-frosne vevssnitt kan bli påvirket av en laser-indusert effekt er ikke kjent og dette kan til og med bli forverret av ytterligere forstyrrende faktorer som for eksempel en skadelig virkning på de fiksering, beising og /eller nestet PCR-fremgangsmåter. For å utelukke en slik teknologisk bias, ble kirurgiske ureter prøver samlet inn etter nephroureterectomies (n = 4) tatt fra nyretransplanterte pasienter for terminal uremi skyldes polycystisk nyresykdom (n = 2), kronisk idiopatisk interstitiell nefritt definitivt ikke er relatert til AA inntak (n = 1 ), og diabetisk glomerulosklerose (n = 1). Disse prøvene ble umiddelbart innebygd i Tissue-Tek og snap-frosset, og uroteliale områder ble behandlet samtidig på tre forskjellige måter. Mikrodisseksjon ble utført under to forskjellige intensiteter (lav bety UV-energi: 68, og høy gjennomsnitts UV-energi: 69,4) og deretter behandlet som rapportert her for AAN-pasient prøvene. Til sammenligning ekstra seriesnitt fra samme ureter prøvegikk et enkelt lysbilde skrape som utføres i
Kras
rutine mutasjonstesting på FFPE- vevsprøver. DNA-ekstraksjon, forsterkning og
TP53
sekvensering ble utført i henhold til metoden beskrevet i denne artikkelen.
(c) Som ekstra kontroll av AA-urelaterte
TP53
kunstig endringer potensielt indusert av foreliggende analyse, en fenacetin-indusert urothelial karsinom som er angivelig karakterisert ved fravær av A T transversions i
TP53
genet [26] ble fjernet fra nedre ureter av en 64 år gammel kvinne, forankret i Tissue-Tek, snap-frosset i flytende nitrogen kjølte 2-methylbutane (isopentan) og lagret ved -70 ° C. IHC, mikrodisseksjon, DNA-ekstraksjon og
TP53
sekvensering ble utført i henhold til metodene som er beskrevet ovenfor.
Vurdering av deteksjonsgrensen for Sanger-sekvense
For deteksjonsgrensen studie DNA ble ekstrahert fra to hode og hals plateepitelkarsinom cellelinjer (SC173 og SC263, vennlig levert av AC Begg, Nederland Cancer Institute, Nederland) bærer forskjellige
TP53
mutasjoner og fra en villtype
TP53
HNSCC cellelinje (HN30, vennlig levert av M. Flinterman, Institutt for oral medisin og patologi, Kings College London, The Rain Institute, UK). Karakterisering av
TP53
status ble tidligere utført i vårt laboratorium ved hjelp FASAY analyse [25]. SC173 bærer en missense mutasjon i ekson 5: R175H (CGC CAC). SC263 presenterer et sammensatt heterozygot endring involverer en tull mutasjon R306X i ekson 8 (CGA TGA) og en 32-bp sletting i ekson 7 (del 704-735) (CTMA laboratorium data). DNA fra både
TP53
muterte celler ble serielt fortynnet og tilsatt i villtype celle-DNA for å ha 50 til 1,25% mutant i DNA-forhold villtype. Forsterkning og sekvensering analyse ble utført som beskrevet ovenfor.
Comparative statistisk analyse av antall og type mutasjoner i nåværende og tidligere data
En Poisson regresjonsmodell ble bygget for å sammenligne forekomsten og type ( A T og G T) av
TP53
mutasjoner i p53-bindingssetet mellom nåværende (n = 5) og tidligere [BEN (n = 11 og n = 97) og taiwanske (n = 151)] klinisk serie [11], [12], [14], og sammenligne resultatene fra denne analysen med de fra pasienter med uroteliale maligniteter (blære, urinleder, øvre urinveiene og nyrebekken) (n = 1111) som rapportert i
TP53
IARC database [27]. Det er verdt å merke seg at data knyttet til AA eksponering ble kastet fra
TP53
IARC database resultater.
Resultater
vurdering av potensielle kunstig
TP53
endringer i vevsprøver
Bruke mikrodisseksjon prosedyre aktivert en korrekt identifisering av kjente DNA mutasjoner preget av tidligere rutinemessig testing. Når det gjelder identifisering av
Kras
mutasjoner på snap-frosset adenokarsinomer, resultatene var strengt identiske med de tidligere innhentet på FFPE- prøver (dvs. identifisering av G12S og G12D mutasjoner i
Kras
muterte vev og villtype-status i de to andre tumorer). Når det gjelder identifikasjon av en konstitusjonell g.13380 G A, p.R248Q mutasjon identifisert ved FASAY analyse i perifere blodceller til en pasient med Li-Fraumeni syndrom, har denne mutasjonen ble også funnet i ondartede celler fra granulosa celle tumor ved bruk av DNA-ekstraksjon, mikrodisseksjon, nestet-PCR og sekvensering prosedyrer som brukes i denne studien.
Omvendt, ingen kunstig
TP53
endringer ble funnet i de ulike kontroller utført for å teste forekomsten av
TP53
DNA-indusert skade knyttet til DNA-ekstraksjon, mikrodisseksjon, nestet-PCR og sekvensering prosedyrer. Ingen mutasjoner ble funnet i tre av fire ureter prøver brukes til å teste en
TP53
feilbehandling-. Det eneste unntaket var ureter prøve fra en type 2 diabetiker pasient med en G En overgang (g.12455, p.R156H) i ekson 5 av
TP53
genet etter mikrodisseksjon under høyt laser makt. Ingen mutasjoner ble funnet i p53 DNA-bindende domene (eksoner 5 til 8) når analysere DNA ekstrahert fra en phenacetin-indusert urothelial karsinom.
Vurdering av deteksjonsgrensen for Sanger-sekvense
Grensen for påvisning av Sanger-sekvensering ble identifisert ved 6,25% av mutant til villtype-DNA-forhold med både
TP53
muterte cellelinjer, uavhengig av mutasjon eller delesjon vurdert. På dette DNA ratio, heterozygot A /G topp med serie DNA-fortynninger fra SC173 /HN30 blandet DNA var fremdeles synlig som også var heterozygot T og C topp kombinert med en 32-bp sletting i ekson 7 med serie DNA-fortynninger fra SC263 /HN30 blandede DNA.
morfologi
Alle p53 positive områder samsvarer papillær TCC eller cIS inneholder anaplastic og dysplastiske celler (tabell 1). Intra-urothelial og lamina propria betennelse, hyperplasi og reaktiv atypia var fraværende. I pasient 2 ble neoplastiske og dysplastiske celler klamrer seg til basalmembran (klamrer CIS).
TP53 genmutasjoner
Inkludert to tidligere rapporterte resultater [10], totalt 16 helt annen exonic (n = 13) eller intronic (n = 3) mutasjoner av
TP53
genet ble funnet i maligne uroteliale vev fra den belgiske AAN kohort (tabell 1). I pasient 1, ble to mutasjoner funnet i den samme ekson (ekson 7), mens en enkelt mutasjon ble funnet i pasient 2 (ekson 5) og 3 (intron 7). Pasienter 4 og 5 næret 5 forskjellige exonic og 1 intronic mutasjoner. Blant de 13 exonic mutasjonene, to var nonsense (pasient 2 og 5) og 11 missense mutasjoner (pasienter 1, 4 og 5). De ble plassert i ekson 5 (3 mutasjoner), ekson 6 (3 mutasjoner), ekson 7 (3 mutasjoner) eller ekson 8 (4 mutasjoner). En av de tre intronic mutasjoner (g.12627 A T, pasient 5) ble plassert på AG akseptor spleisesetet. Globalt mutasjoner berørt A:T par (7/16) og G:C par (9/16). Det var en nesten like mange overganger (7/16) og transversions (9/16). Transitions (7/16) skjedde faktisk med en lignende frekvens på A:T par (3/16) og G:C par (4/16). A G, G A og C T (2/16) skjedde med en lignende frekvens som T C (1/16). Tilsvarende ble transversions (9/16) funnet på A:T par (4/16) og G:C par (5/16) fordelt som følger: A T (3/16), G T (3/16 ), G C (2/16) og A C (1/16)
Comparative statistisk analyse av antall og type mutasjoner i nåværende og tidligere data
Poisson regresjon modell. viste en svært signifikant (p 0,001) relativ økning av
TP53
mutasjon utbredelsen i p53 hotspot kodon fra dagens kliniske serien, sammenlignet med IARC database resultater (Tabell 3). I motsetning til dette ble en signifikant reduksjon i forhold finnes både i BEN (n = 97) [12], og de Taiwan (n = 151) [14] klinisk serie sammenlignet med IARC og nåværende kliniske data (tabell 3). En ikke-signifikant (p 0,05) relativ nedgang /økning ble funnet i BEN (n = 11) [11] sammenlignet med IARC og aktuelle kliniske data (tabell 3)
Når det gjelder antall. A T transversjon per pasient, en betydelig relativ økning ble funnet i den nåværende, både BEN [11], [12], og de taiwanske [14] klinisk serien, sammenlignet med IARC database resultater (tabell 4).
Sammenlignet med IARC database resultater, en betydelig 5,85 økning av G T transversjon ble funnet i begge BEN serie. Angående den taiwanske serien, det var en ikke-signifikant relativ nedgang i G . T utbredelsen sammenlignet med IARC data Slikt Nedgangen var stor betydning sammenlignet med dagens resultater (Tabell 5)
Diskusjoner
Dette er den første rapporten fra mutasjons spekteret av
TP53
tumor suppressor genet i en rekke belgiske pasientene (n = 5) med dokumentert AAN og påfølgende utvikling av TCC i øvre urinveiene sammen med blære involvering i en av dem. Fire av dem hadde fulgt AA-forurenset vekttap diett og en nektet eksponering for AA mens presentere en typisk nedsatt histologi av interstitiell fibrose [20] med AL-DNA addukter [18].
Bruk utelukkende frosne prøvene ble en absolutt forutsetning for å tillate tilstrekkelig sammenlignet med rapporterte data. Med unntak av fem av 11 pasienter som formalinfiksert parafin innebygde vev ble benyttet [11], alle større
TP53
genetiske undersøkelser i tilfeller presenterer med AA-indusert gentoksisitet og uroteliale maligniteter ble faktisk ledet med ferske frosne vev [11], [12], [14]. Omvendt var målet å unngå den kjente skadelig virkning av formalinfiksering i form av DNA-kvalitet og karakterisering av vev mutasjonsstatus [28]. For å bevise at
TP53
mutasjoner førte ikke fra teknologiske gjenstander ved bruk av frossen delen, ble en spesiell oppmerksomhet til grundige valideringsprosedyrer. Den nåværende
TP53
testing inkludert påfølgende trinn (dvs. laser capture mikrodisseksjon av kreftceller etter toluidinblått flekker, DNA-ekstraksjon, nestet-PCR forsterkning og sekvensering). Denne metoden har ikke produsere falske negative resultater. Det aktivert faktisk en korrekt identifisering av kjente
Kras
onkogene mutasjoner i adenokarsinomer. Det er også aktivert en korrekt identifisering av en tidligere preget
TP53
konstitusjonell mutasjon assosiert med et Li-Fraumeni syndrom. Denne mutasjon ble funnet i tumorceller mens den foregående karakteriseringen ble utført ved et funksjonelt assay på perifere mononukleære celler.
Likeledes er den aktuelle fremgangsmåten ikke skape falske positive resultater i analysen av normale ureter prøver samlet etter nephroureterectomy i pasienter med AA-urelaterte sykdommer eller en phenacetin-indusert karsinom, og tar dagens konvensjonelle genotyping som gullstandard. Dette gjaldt også når du utfører laser capture mikrodisseksjon med høy intensitet. Den eneste mutasjon fant var et enkelt G En overgang (g.12455, p.R156H) i vevsprøve fra en type 2 diabetiker pasienten uten noen historie med neoplasi. Av interesse er det ingen signifikant forskjell i forekomsten av G En overgang mellom den generelle befolkningen og type 2 diabetes [29]. Som vurdert av serielle fortynninger av
TP53
mutert DNA, deteksjonsgrensen for gjeldende genotyping prosedyren var 6,25% av mutant til villtype-forhold.
Av interesse, alle pasienter fra den nåværende serien var kvinner og hver av dem presentert i det minste en
TP53
mutasjon i deres ondartede urothelial vev mens en mer balansert hann /hunn-forholdet ble funnet (53% /47%) i tidligere studier [11], [14] . I tidligere studier, den rapporterte forekomsten av pasienter med
TP53
hotspot mutasjon varierte fra 100% (11/11 BEN pasienter) [11] til 37% (36/97 BEN svulster) [12] eller 47% ( 71/151) taiwanske AA-pasienter [14]. Tatt i betraktning at bare en enkelt pasient ble rapportert med en femdobbelt mutasjon i IARC databasen, dagens observasjon at 40% (2/5) av pasientene næret flere
TP53
mutasjoner, hver med seks forskjellige mutasjoner (fem exonic og en intronic mutasjoner, hvorav en spleisesetet mutasjon i pasientens 5) var en slående og svært uvanlig å finne. Det er også interessant å merke seg at dette femdobbelt mutasjonen ble også funnet i BEN serien [12] som er en av de hittil største rapporterte menneske serie AA relatert
TP53
mutasjoner. Sammenlignet med data fra ikke AA-relaterte uroteliale kreft i IARC database (n = 1111) og fra den taiwanske serien (n = 151), den nåværende serien viste den høyeste relative økt forekomst av mutasjon og G T transversjon i
TP53
hotspot-regionen. Uavhengig av nåværende eller tidligere AA-serien, utbredelsen av A T transversjon var betydelig og gjennomgående høyere enn i IARC databasen [27]. Våre funn bekrefter at antallet og profilen til
TP53
mutasjoner per pasient er svært uvanlig, sannsynligvis reflekterer en plutselig svært giftig eksponering. Hvorvidt disse flere mutasjoner oppsto i forskjellige ondartede kloner ble ikke vurdert. Men antall forskjellige tumor områder knyttet til dette komplekset mutasjonsspekteret absolutt gjenspeiler bredt innen tumor heterogenitet med poly eller multiclonal ondartede urotelialceller.
Ser inn detaljer om hva slags hotspot mutasjon i denne studien, punkt mutasjoner ved A:T parene ble så hyppig som de på G:C parene (7/16 versus 9/16, henholdsvis). De ble dominert av transversions med A T og G T sto hver for 18,7% (3/16) av alle
TP53
mutasjoner. Interessant, A T transversjon i menneskelig AA-relaterte urothelial tumor ble først rapportert i en britisk pasient [30] men A T transversjon ble så ofte funnet i p53 hotspot-regionen fra urothelial karsinom knyttet til Balkan endemiske nefropati (BEN) [ ,,,0],11], [12], så vel som i Taiwan [14]. I alle disse studiene, ble befolkningen utsatt for AA i mange år, med tall så høyt som 66% (33/50) til 72% (13/18) og 55% (46/84) av alle
TP53
mutasjoner, henholdsvis. I den nåværende serien, en svulst med flere
TP53
mutasjoner næret to a T transversions, en har også ofte rapportert i BEN og taiwanske serie [11], [12], [14].
