Abstract
Vi har nylig vist at kreftceller som gjenopprette fra skade utstillings økt aerob glykolyse, men den molekylære mekanismen ved hvilken kreftceller overlever skaden og viser øket aerob glykolyse er ukjent. Her viser vi at ulike kreftceller som overlever hypoksisk eller oksidativ skade viser rask celledeling, og utvikle toleranse for skader forbundet med økt produksjon av hydrogensulfid (H
2S) som driver oppregulering av nikotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt). I samsvar med eksistensen av en H
2S-Nampt energisk krets, til skade gjenvinnes kreftceller, H
2S, Nampt og ATP produksjon utstillings en signifikant sammenheng. Videre behandling av kreftceller med H
2S donor, NaHS, øker koordinert Nampt og ATP-nivåer, og beskytter cellene mot legemiddelindusert skade. Hemming av cystationin beta syntase (CBS) eller cystathionase (CTH), enzymer som driver generasjon H
2S, minsker Nampt produksjon mens undertrykkelse av Nampt veien ved FK866, minsker H
2S og ATP nivåer. Skade gjenvundne celler isolert fra tumorer dyrket subkutant i atymiske mus også viser økt produksjon av H
2S, Nampt og ATP-nivåer, assosiert med øket glykolyse og hurtig spredning. Sammen viser disse data at ved utvinning fra potensiell dødelig skade, H
2S-Nampt retning og energiforbruk og aerob glykolyse i kreftceller, som fører til deres eksponentiell vekst, og fører til en høy grad av toleranse til skade. Identifisering av H
2S-Nampt som en vei ansvarlig for induksjon av skadetoleranse i kreftceller kan ligge til grunn for resistens mot behandlingen, og tilbyr muligheten til å målrette denne veien som et middel i behandling av kreft
Citation.: Sanokawa-Akakura R, Ostrakhovitch EA, Akakura S, Goodwin S, Tabibzadeh S (2014) AH
2S-Nampt Dependent Energisk Circuit er kritisk til overlevelse og cytobeskyttelse fra Skade i kreftceller. PLoS ONE ni (9): e108537. doi: 10,1371 /journal.pone.0108537
Redaktør: Stefan Strack, Universitetet i Iowa, USA
mottatt: 29. mai 2014; Godkjent: 27 august 2014; Publisert: 23.09.2014
Copyright: © 2014 Sanokawa-Akakura et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet:. Den forfatterne bekrefter at alle data som underbygger funnene er fullt tilgjengelig uten restriksjoner. Alle relevante data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering for å rapportere
Konkurrerende interesser:. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer.
Innledning
I de senere årene har det vist seg at gasotransmitters, nitrogenoksid (NO), karbonmonoksid (CO) og hydrogensulfid (H
2S), spille en avgjørende rolle i ulike fysiologiske funksjoner, inkludert vaskulær tone, vert forsvaret mot patogener, neuromodulation, apoptose, og energiomsetning i pattedyrceller [1]. Blant disse gassformede molekylene, er H
2S produsert i løpet av aminosyre metabolismen av trans-sulfuration og cystein avsvovling trasé [2]. Endogen H
2S produksjon katalyseres av tre enzymer, cystationin beta-syntase (CBS), cystathionase (CTH), også kjent som cystationin y-lyase, og 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (MST) [3] – [5].
H
2S fungerer som en stimulator av cellulære bioenergi, bidrar til økt avhengighet av kreftceller i glykolysen for ATP produksjon og fremmer angiogenese og cytobeskyttelse [6] – [8]. H
2S beskytter cellene mot oksidativt stress [9], kan det påvirke cellulære responser til skade [10], [11] og ble vist til å stille både pro-apoptotiske og anti-apoptotiske effekter [12] – [14]. Selv om noen foreslo at H
2S har anti-kreft effekt [15], mens andre rapporterte at det fremmer spredning av HCT116 og SW480 colonic kreftceller [16]. Fu
et al.
Viste at Ca
2 + stimulering fører til økt CTH uttrykk og øker H
2S og ATP produksjon [17]. Det ble vist at endogent H
2S produksjon drevet av 3-MST utfyller og balanserer de cellulære bioenergi og opprettholder elektronstrømmen i mitokondriene [18]. Colonic kreftceller har vist seg å oppvise opp-regulert ekspresjon av CBS og økt dannelse av H
2S, som dirigerer celleproliferasjon og angiogenese i tykktarmskreft [6].
Det er kjent at tumorceller kan gjenopprette fra potensiell dødelig skade indusert av hypoksi, acidose, eller ved stråling og behandling [19] – [22]. Vi har nylig rapportert at kreftceller som gjenopprette fra skader forårsaket av hypoksi, acidose og glukose deprivasjon viser mitokondrie ombygging, økt aerobic glykolysen, og viser en høy grad av ATP produksjon [23]. I denne studien undersøker vi rolle H
2S i prosessen med utvinning av kreftceller mot skade. Skadede kreftceller eksos sin energiforsyning på grunn av reparasjonsmekanismer. Både ATP og NAD
+ (nikotinamid adenindinukleotid) er de viktigste energikilder. Nikotinamid phosphoribosyltransferase (Nampt), et enzym som er nødvendig for NAD syntetisk berging vei [24], er avgjørende for vedlikehold av mobilnettet energiforsyning. Derfor, undersøkte vi rolle Nampt i forbindelse med H
2S i kreftceller som gjenvinner fra skade. Vi viser at H
2S styrer utvinning av kreft celler mot skader ved å regulere Nampt rettet endring i energiforbruket, som driver adopsjon av aerob glykolyse og økning i ATP og NAD
+ syntese. Samspillet mellom H
2S og Nampt tildeler kreftcellene en høy spredning rente og en høy grad av toleranse for skader.
Materialer og metoder
Material
H
2o
2, NaHS, bleomycin,
O Anmeldelser – (carboxymethyl) hydroksylamin hemihydrochloride (CHH) DL-propargylglycine (PAG) og FK866 ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . Antistoffer mot CBS (A-2), CTH (G-1) og β-Actin (C-2) ble kjøpt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Antistoffer mot Nampt (Visfatin, PBEF) og Bax ble kjøpt fra Abcam (Cambridge, MA). Antistoff mot γ-H2AX ble kjøpt fra Millipore (Billerica, MA). Sekundære antistoffer konjugert til pepperrot peroksidase ble kjøpt fra Jackson Immunoresearch Laboratories (Baltimore, PA).
Cell kultur
HepG2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s ble oppnådd fra ATCC ( Manassas, VA) dyrket i DMEM med 2 mM glutamin, 25 mM glukose og 10% føtalt bovint serum, i 37 ° C inkubator med 5% CO
2. Skade ble indusert i kreftceller ved hypoksi, glukosemangel og hydrogenperoksyd. For induksjon av hypoksi (DR
H), ble cellene inkubert i 18 timer i 1% O
2. For glukosemangel (DR
G-), ble cellene dyrket i 18 timer i et medium uten glukose i nærvær av 5% CO
2. For induksjon av skade ved hydrogenperoksid (DR
H2O2) ble cellene behandlet med 800 mikrometer H
2o
2 i 3 timer.
Dyreforsøk
Animal omsorg og alle prosedyrer ble utført etter godkjenning av Institutional Animal Care Committees av University of California, Irvine (protokoll # 2012-3042). Åtte uker gamle atymiske nakne (nu /nu) hannmus (n = 10) ble anskaffet fra Charles River Laboratories (San Diego, CA). Mus ble anestetisert ved inhalering av isofluran før injeksjon av tumorceller. Hver mus mottok 1 × 10
5 tumorceller i et totalt volum på 100 ul subkutant i fire steder i midten av mage og lavere flanke områder. Musene ble overvåket 2 ganger per uke i løpet av tumorvekst eksperiment. Tyve dager etter injeksjon av cellene, ble musene avlivet ved karbondioksyd inhalering når tumorene vokste til en størrelse på 10-15 mm i diameter. Svulster ble fjernet for isolering av levedyktige kreftceller (T
V) eller skade gjenvinnes celler fra
in vivo
vokst tumor (T
DR).
Måling av H
2S produksjon i ekstra og intra-celler
Måling av ekstracellulære H
2S nivå ble utført ved hjelp av Free Radical Analyzer (TBR4100 og ISO-H2S-2, Verden Precision Instruments, Sarasota, FL) etter produsentens anvisninger . I korthet, ble celletallet justert til 1 x 10
6 levedyktige celler i PBS og cellesuspensjoner ble inkubert ved 37 ° C i 1 time. Celler ble deretter sentrifugert og supernatantene ble utsatt for målinger. Før hver måling ble sensoren polarisert og kalibrert ved å tilsette fire aliquoter av Na
2S stamløsning på de endelige konsentrasjoner på 0,25, 0,5, 1,0 og 2,0 uM. Påvisning av intracellulær H
2S ble utført av H
2S fluorescerende probe HSN2 (en slags gave fra professor Michael D. Pluth, University of Oregon, Institutt for kjemi, Eugene, Oregon).
Whole celleprotein utvinning og Western-blotting
proteiner fra celler ble ekstrahert i lyseringsbuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 2 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM na
3VO
4, 50 mM NaF, og proteasehemmer cocktail). Protein-målinger ble utført ved Bio-Rad proteinanalyse basert på Bradford fargebindingsmetode (Bio-Rad Lab, Hercules, CA).
blotting-båndene ble påvist ved ECL forsterket kjemiluminescens (Amersham ECL Plus Western blotting Detection reagenser GE Healthcare og biovitenskap, Pittsburgh, Pennsylvania) ved hjelp av C-Digit Digital Imager (LI-COR, Lincoln, NE) og densitometrisk analyse ble utført ved hjelp myImage Analysis programvare (Thermo Scientific). β-actin fungert som en lasting kontroll.
Celleviabilitet måling
Relativ celle nummer ble målt ved XTT assay (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Celler ble inkubert med XTT og fenazin metosulfat (PMS) ved 37 ° C i 2 timer og absorbansen ble avlest ved 450 og 650 nm som referanse.
Revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (PCR) og kvantitativ PCR ( qPCR)
Total RNA ble isolert ved hjelp GenElute pattedyr Total RNA Miniprep Kit (Siγma-Aldrich, St. Louis, MO). Revers transkripsjon ble utført ved hjelp av High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California). RT-PCR ble utført ved hjelp av spesifikke for den menneskelige CBS primere (frem: GAACCAGACGGAGCAGACAA, reverserer: GTCGCTCAGGAACTTGGTCA), for den menneskelige CTH (frem: AAAGACGCCTCCTCACAAGG; omvendt: AAGGCAATTCCTAGTGGGATTTC) og for den menneskelige MTS (frem: CGCCGTGTCACTGCTTGAT; omvendt: CAGGTTCAATGCCGTCTCG ). Genekspresjon ble bestemt ved PCR ved anvendelse av
Taq
5 x Master Mix (New England Biolabs. Ipswich, MA) med en innledende denatureringstrinn 94 ° C i 5 minutter, etterfulgt av 30 sykluser med hverandre ved 94 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, og 68 ° C i 1 min.
Kvantitativ evaluering ble utført ved hjelp myImage Analysis programvare (Thermo Scientific, New Hampshire). For normalisering av data,
β-ACTIN
ble forsterket med spesifikke primere (forward: AAGCCACCCCACTTCTCTCT; omvendt: GAGACCAAAAGCCTTCATACATCT). qPCR ble utført med Quanti tect SYBR Grønn PCR Kit. qPCR ble utført ved hjelp av spesifikke for den menneskelige NAMPT primere (frem: ATC CTG TTC CAG GCT ATT CTG, reverserer: CCC CAT ATT TTC TCA CAC GCA T).
XF (ekstracellulære flux) bioenergetikk
XF24 ekstracellulær Flux Analyzer fra Seahorse Biovitenskap (N. Rica, MA) ble benyttet for ekstracellulær væske bioenergetisk analyse [25]. Under typisk
in vitro
celledyrkningsforhold, ekstracellulære forsuring rate (ECAR) er bidratt av melkesyre produksjon generert av glykolyse. For å undersøke den aerobe glykolyse, fem biologiske duplikate kulturer av kontroll (3 x 10
4) og fem uavhengig genererte DR-celler (3 x 10
4) ble sådd ut i hver brønn på xf 24 kulturplate og cellene inkubert over natten ved 37 ° C i nærvær av 5% CO
2. Alle kulturer ble undersøkt i XFAssay medier i fravær av CO
2. Nivå av ECAR var normalisert til proteininnholdet.
Kvantifisering av Nampt, ATP og NAD
+ /NADH
Intracellulær Nampt nivåene ble målt ved hjelp av en Visfatin C-terminal (human) EIA kit (Phoenix legemidler, Belmont, CA, USA). ATP-nivåer i celler ble analysert ved anvendelse av ATP-Bioluminescent somatiske celleanalysesett (FLASC, Sigma-Aldrich selskap) og kolorimetrisk ATP analysesett (Abcam, Cambridge, MA) i henhold til produsentens instruksjoner. NAD
+ /NADH ble målt ved hjelp av NAD
+ /NADH analysesett (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, Michigan og Bio analysesystemer, Hayward CA) etter produsentens anvisninger. Nivåer av Nampt, ATP og NAD
+ /NADH ble normalisert til proteininnholdet.
statistikker
Alle analyser ble gjort i 3-6 replikerer i minst tre uavhengige forsøk. Data er vist som gjennomsnitt ± SEM (standardfeil av middelverdien).
p
verdier ble bestemt ved å sammenligne data fra eksperimentelle versus kontrollceller fra minst tre uavhengige eksperimenter eller seks replikater av samme eksperiment. Midler og
p
verdier for eksperimentelle data ble analysert ved å utsette data til to tailed t-test. Data som involverer mer enn to grupper ble åpnet av en enveis ANOVA med Bonferroni-test for post hoc-analyse.
p
verdier mindre enn 0,05 ble betraktet som signifikant.
p
Verdiene er vist som 0,05 (*), 0,005 (**) eller. 0,0005 (***)
Resultater
Den generasjonen H
2S øker som svar på stress
i motsetning til tidligere rapporter der H
2S har blitt målt i cellelysat, benyttet vi H
2S-sensitive elektroder for å måle utslipp H
2S fra intakte celler. Vi fant at mengden av H
2S frigitt fra celler var signifikant høyere enn det som ble målt i homogeniserte celleekstrakter (data ikke vist). I sammenligning med nivåene av H
2S frigjøres fra 293-celler og fibroblaster, kreftceller (HepG2, MDA-MB-231, MDA-MB-435s) produserte signifikant mer H
2S (figur 1A). Vi utsettes epiteliale kreftceller av ulik opprinnelse (lever, bryst, og melanocyte) til tøffe forhold som eksisterer i svulsten mikromiljøet, som alle fører til celleskader inkludert hypoksi (
H), glukose deprivasjon (
G-) og hydrogenperoksid (
H2O2). «H
2S generasjonen ble øket i kreftceller i respons til akutt stress så som hypoksi, bleomycin, hydrogenperoksyd og glukosemangel (figur 1B). Stress relatert økning i H
2S frigjøres fra kreftceller var assosiert med økning av cystationin beta-syntase (CBS), et av enzymene som driver H
2S produksjon, samtidig med økning i spenning og apoptose-relaterte Bax og γH2AX , som er en kritisk faktor av S /G
to DNA-skade sjekkpunkt kompleks (figur 1C, D). Interessant, stress-indusert økning i H
2S produksjon korrelert med alvorligheten av skaden (figur 1E).
(A) Mengde H
2S utgitt av 293 celler, fibroblaster (fibro.), HepG2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s celler. (B) Konsentrasjonene av H
2S i HepG2, MDA-MB-231 og MDA-MB-435s Pc-celler underkastes hypoksi (0,5% O
2, 18 timer), glukose deprivasjon (glukosefritt medium, 18 timer) eller behandling med bleomycin (35 nM, 18 timer), H
2o
2 (800 mikrometer, 3 timer). Data er uttrykt som prosent av H
2S frigjøres fra ubehandlede celler. (C) Intracellulær CBS og Bax (venstre panel) vurderes av western blot analyse i MDA-MB-435s Pc celler, og Pc celler behandlet med 400 eller 800 mikrometer fra H
2o
2 i 3 timer. (D) Nivået på CBS og γH2AX med eller uten behandling med H
2o
2 (800 mikrometer, 3 timer) i MDA-MB-435s celler. Protein tetthet ble normalisert ved hjelp av β-Actin. (E) Mengde H
2S og cellelevedyktigheten etter behandling med et konsentrasjonsområde av H
2o
2. *;
p
0,05, **;
p
0.005, ***;
p
. 0,0005
Den økte generasjon H
2S i skade gjenvunnet celler øker toleranse for skade
Ordningen i figur 2a viser metoden som brukes til å generere den skaden gjenvunnet kreftceller. Innen 24 timer etter skade, noen levedyktige celler som forble festet til kulturflaske mens mesteparten av cellene løsnet fra kulturoverflaten. Skadede frigjorte celler utviser et høyt nivå av H
2S sannsynligvis begrense skaden og kan forbedre overlevelsespotensial (fig S1). For å fjerne mitotiske celler, dyrket vi celler i nye kulturskip i 24 timer. For å isolere skadede celler som ikke klarte å binde seg til kulturbeholdere, men har hatt mulighet for å komme seg fra skade, vi overført flytende celler til nye kulturbeholdere for å tillate celler som gjenvinner fra skade til å binde til dyrknings substrater. Serie ukentlige passasjer av flytende celler til nye kultur fartøy tillates isolering av skade gjenvinnes celler med forskjellig utvinning tid. Gjennom denne artikkelen, henviser vi til disse cellene som skader gjenvinnes (DR) celler med angitte restitusjonstid på ett (DR
W1), to (DR
W2) eller tre uker (DR
W3) fra skade, mens vi viser til foreldrekontrollcellene som Pc-celler (figur 2A). Denne metoden gjorde oss i stand til å skille tre populasjoner av celler som gjenspeiler hvor lang tid som kreves for å bli frisk. For å kunne vurdere om isolerte DR celler utvinnes fra skade, undersøkte vi uttrykket av pro-apoptotisk molekyl, Bax. DR-celler viste en reduksjon i Bax ekspresjon i en gjenopprettingstidsavhengig måte som en indikasjon på reparasjon, samtidig som forutsagt, Pc-celler utsatt for H
2o
2 i 3 timer (akutt skade) uttrykte et høyt nivå av Bax (figur 2B). Videre kreftceller utvinnes fra skade også oppviste en økt produksjon av H
2S, sammenlignet med de uskadede Pc cellene i en gjenvinningstidsavhengig måte (figur 2C, D). Siden endogen hydrogensulfid er generert av tre enzymer, CBS, CTH og MST, vi undersøkte mRNA og protein nivåer av disse enzymene i Pc og DR celler. Som vist i figur 2E, mRNA-nivåer av CBS og CTH økning i DR-celler også i en gjenopprettingstidsavhengig måte. Men MST var fraværende i PC eller DR celler. I forhold til foreldre uskadet Pc celler, hadde kreftceller utvinnes fra skader økt CBS og CTH proteiner i direkte sammenheng med utvinning perioden. Blant de DR-celler, disse celler med en lengre utvinning tid fra skade viser den høyeste oppregulering av CBS og CTH (figur 2F). CBS ble oppregulert opp til to ganger etter utvinning fra skader indusert av glukose deprivasjon, hypoksi og hydrogenperoksid (figur 2G). I forhold til Pc-celler, DR-celler generere høyere nivåer av H
2S hadde en høyere spredningshastighet og viste en høyere grad av toleranse til skade indusert av bleomycin (figur 2 H, I). Disse funnene viser at i cellene utvinnes fra skade, H
2S produksjon kan spille en rolle i deres økt toleranse for skader.
(A) En ordning for isolering av Skade-Gjen (DR) celler. (B) Bax uttrykk i H
2o
2 behandlet Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. (C) Mengde H
2S utgitt av DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. Betydning mellom Pc og tre DR celler var
p
0,0005 i ANOVA statistisk analyse. (D) H
2S farging av Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler med fem mikrometer H
2S fluorescerende probe, HSN2. Skala barer, 50 mikrometer. (E) PCR-analyse av
CBS
,
CTH Hotell og
MTS
gener i Pc, DR
H2O2 W1 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. (F) Western blot analyse av CBS og CTH i Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. (G) Western blot analyse av CBS i Pc og DR
H2O2 W1, DR
H W1 og DR
G W1 HepG2 celler. (H) Spredning av HepG2 utvinnes fra H
2o
2, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 celler som en prosentandel av det i Pc celler. (I) Livskraftig av Pc, DR
H2O2 W1 og DR
H2O2 W2 HepG2 celler med og uten behandling med bleomycin. *;
p
0,05, **;
p
0.005, ***;
p
. 0,0005
DR celler utviser økt glykolyse og forbedrede cellulære bioenergi
Fordi raskt dele celler vedta aerob glykolyse for å fremme økt biomasse etterfulgt av celle divisjon, undersøkte vi nivået av nøkkel glykolytiske mellomprodukter og enzymer i celler utvunnet fra skade. DR-celler viste en forhøyet ekstracellulær surgjøring hastighet (ECAR), som er en indikator på graden av glykolyse (figur 3A). DR celler genererer høye nivåer av H
2S hadde en bedre bioenergetisk profil som gjenspeiles av økt nivå av cellulær ATP (figur 3B).
(A) ECAR i Pc HepG2 celler behandlet med eller uten 800 pM H
2o
2 og DR
H2O2 W2 HepG2 celler. (B) ATP nivåer i Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. Betydning mellom Pc og tre DR celler var
p
0,005 i ANOVA statistisk analyse. (C) NAD
+ nivåer i Pc HepG2 (med eller uten H
2o
2), DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. NAD
+ var normalisert til nivået av totalt protein. Betydning mellom Pc og det DR celler var
p
0,005 i ANOVA statistisk analyse. (D) NAD
+ nivåer i Pc og DR
H W1 HepG2 celler. (E) Western blot analyse av intracellulær Nampt og CBS i Pc og DR
H2O2 MDA-MB-231 celler. (F) Nampt nivåer vurderes av ELISA i Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. Betydning mellom Pc og tre DR celler var
p
0,05 i ANOVA statistisk analyse. (G) Sammenheng mellom Nampt uttrykk og produksjon av H
2S og nivå av ATP i Pc, DR
H2O2 W1, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler. Betydningen av H
2S og Nampt var
p
0,05, og betydningen av ATP og Nampt var
p
0,05 i ANOVA statistisk analyse. *;
p
0,05, **;
p
0.005, ***;
p
. 0,0005
For å ta opp om undertrykkelse av glykolyse demper H
2S produksjon, vi målte H
2S nivå i DR celler behandlet med Ht1 -inhibitor, 100 uM bromopyruvic syre, eller LDH-A-inhibitor, 1 mM natrium-oksamat, i 15 timer. Som vist i fig S2, var det ingen statistisk signifikant forskjell i nivået av H
2S etter behandling med enten bromopyruvic syre eller natrium-oksamat, mens, som forventet, glykolytiske aktivitet ble betydelig redusert av begge inhibitorer. Disse data indikerer at glykolytiske enzymer ikke regulerer H
2S-Nampt krets.
Celler utvunnet fra skade sterkt avhengig av glykolyse den økte etterspørsel for NADH /NAD
+. Derfor, som et mål på bioenergetisk tilstand, evaluerte vi nivåene av NAD
+ og NADH. Selv om akutte skader førte til en reduksjon i nivået av NAD
+, NAD
+ var signifikant økt i kreftceller som utvinnes fra skader indusert av H
2o
2 og hypoksi (figur 3C, D fig S3). Redusert form av NAD
+, NADH, var signifikant økt i DR-celler (Figur S4).
Nampt, som er nødvendig for NAD
+ syntetisk salvage pathway [24], ble betydelig øket ved utvinning i DR celler og økningen sammenfalt med oppregulering av H
2S generere CBS (Figur 3E). Dr celler med lengre rehabiliteringsperiode fra skade viste den høyeste økningen i Nampt (figur 3F). Videre fant vi at Nampt nivåer korrelert med både nivået av H
2S frigjøres fra celler (R
2 = 0,9,
p
0,05) og den intracellulære nivået av ATP (R
2 = 0,94,
p
. 0,05) (figur 3G)
Sammen utgjør disse funnene viser at kreftceller utvinnes fra skade generere et høyt nivå av H
2S og Nampt, og at de er sterkt avhengig av produksjonen av H
2S og aerob glykolyse for deres effektiv metabolisme.
H
2S, på en doseavhengig måte, opp-regulerer Nampt, øker aerob glykolyse og gir cytobeskyttelse
for å vurdere ytterligere betydningen av H
2S i oppkjøp av nye metabolske egenskaper, ble Pc celler behandlet med H
2S donor, NaHS. I likhet med våre observasjoner i DR celler (figur 3a), behandling med NaHS forbedrede ECAR på en doseavhengig måte, økt ATP og NAD
+ utgang og førte til betydelig økning i nivået av Nampt (figur 4A-F). I samsvar med tidligere rapporter som viser at H
2S gir cytobeskyttelse [8], [26], Pc-celler forbehandlet med NaHS oppviste en høyere motstand mot skade fremkalt ved enten hydrogenperoksyd eller bleomycin (figur 4G).
(A) ECAR i Pc HepG2-celler ble behandlet i 48 timer med 0, 1, og 100 uM av NaHS og DR
H W1 HepG2 celler. (B) Sammenligning av ATP nivåer i Pc HepG2 celler behandlet i 48 timer med 0, 10 og 100 mikrometer av NaHS, DR
H2O2 W1 HepG2 celler og Pc MDA-MB-231 celler behandlet i 48 timer med 0, 10 og 100 mikrometer av NaHS. Data er uttrykt som en prosent av nivået av ATP i ubehandlede celler. (C) Nivåer av NAD
+ i HepG2 og MDA-MB-231 PC-celler behandlet med 0, 10 og 100 uM av NaHS i 48 timer. (D) Western blot-analyse av intracellulær Nampt i MDA-MB-231 PC-celler behandlet i 48 timer med 0 og 100 uM av NaHS. (E) qPCR analyse av
NAMPT
uttrykk i Pc HepG2 celler behandlet i 48 timer med 0 og 100 mikrometer av NaHS. (F) Kvantitering av intracellulært Nampt ved hjelp av ELISA i Pc HepG2-celler ble behandlet i 48 timer med 0, 10 og 100 uM av NaHS. (G) Levedyktigheten i HepG2-celler forbehandlet i 24 timer med 0, 1 og 10 mM av NaHS og deretter underkastet H
2o
2 (800 uM) eller bleomycin (35 nM, 18 timer). Levedyktigheten ble bestemt ved trypan blå eksklusjon. *;
p
0,05, **;
p
0.005, ***;
p
. 0,0005
Sammen våre funn viser at oppregulering av H
2S og Nampt fører til glykolyse og bioenergetisk endringene er viktige mekanismer i utviklingen av legemiddelresistens og overlevelse av kreftceller.
H
2S-Nampt pathway regulerer bioenergi i DR celler
for ytterligere å håndtere forholdet mellom Nampt og H
2S produksjon, DR celler ble behandlet med en hemmer av Nampt, FK866. Behandling av celler med 200 nM av FK866 ikke påvirke cellenes levedyktighet indikerer fravær av FK866 cytotoksisitet ved denne dose i HepG2 (figur S5). Undertrykkelse av Nampt av sin inhibitor, FK866, samt inhibering av CTH av D, L-propargylglycine (PAG), førte til redusert H
2S produksjon (figur 5A). I samsvar med en slik endring i H
2S produksjon, ble ekspresjonen av både CBS og CTH dempes ved behandling av celler med FK866 (figur 5B, C). Nivået av ATP ble også betydelig redusert ved behandling av DR celler med PAG og FK866 (figur 5D, E). Denne reduksjon av ATP var i samsvar med tidligere undersøkelse som viser at inhibering av Nampt av FK866 undertrykt produksjon av ATP i eggstokkreft celler [27]. Interessant, behandling av DR-celler med inhibitor av CBS (CHH) og inhibitor av CTH (PAG) redusert Nampt (figur 5F). Disse data antyder at Nampt kan fungere som en stimulator av H
2S-producting enzymer og derved produksjon av H
2S, mens H
2S fører til oppregulering av Nampt.
(A ) Mengde H
2S løslatt fra DR
H W1 HepG2 celler behandlet med CTH-hemmer, PAG (100 mikrometer, 18 timer), og Nampt inhibitor, FK866 (200 nM, 24 timer). (B) Western blot-analyse av CBS i DR-celler i fravær og nærvær av FK866 (200 nM, 24 timer). (C) Western blot-analyse av CTH i DR-celler i fravær og nærvær av FK866 (200 nM, 24 timer). (D) ATP-nivåer i DR
H2O2 W3 HepG2-celler i fravær (-) og nærvær (+) av PAG (100 uM, 18 timer). (E) ATP nivåer i Pc, DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler i fravær og nærvær av FK866 (200 nm, 24 hr). (F) Western blot-analyse av Nampt i DR
H2O2 W2 og DR
H2O2 W3 HepG2 celler behandlet med CBS-inhibitor, CHH (500 uM, 18 timer) eller CTH inhibitor, PAG (100 uM, 18 timer). *;
p
0,05, **;
p
0.005, ***;
p
. 0,0005
Til sammen våre funn viser at oppregulering av H
2S og Nampt og deres crosstalk forbedre bioenergetisk effektivitet og forenkle utvinning fra skade.
Opphopning av H
2S fører til høyere glykolyse, bedre bioenergi og økt spredning i skade gjenvinnes kreftceller isolert fra
in vivo
dyrket svulster
for å finne ut om celler i likhet med
in vitro
genererte DR celler eksisterer eller kan genereres i tumorer, ble epiteliale kreftceller inokulert i atymiske nakne mus. Vi isolerte levedyktige kreftceller (T
V) og skader gjenvunnet (T
DR)-celler, som beskrevet i vår tidligere studie [23]. T
DR-celler isolert fra
in vivo
genererte tumorer viste akkumulering av H
2S, så vel som økt ekspresjon av CBS og CTH (figur 6A, B). I likhet med
in vitro
data, nivåene av NAD
+ og Nampt ble økt i T
DR celler i forhold til nivåene påvist i Pc og T
V celler (figur 6C, D). ECAR ble økt i T
DR celler og disse cellene viste en bedre bioenergetisk profil som gjenspeiles av økt nivå av ATP og en høyere spredning rate (figur 6E-G).
(A) H
2S nivåer i T
V og T
DR-celler isolert fra HepG2 svulster vokst
in vivo
. (B) Uttrykk for CBS og CTH i T
V og T
DR celler. (C) NAD
+ nivåer i T
V og T
DR-celler isolert fra HepG2 svulster vokst
in vivo
. (D) Nampt nivåer i T
V og T
DR-celler isolert fra HepG2 svulster vokst
in vivo
. (E) ECAR i T
V og T
DR-celler isolert fra HepG2-tumorer dyrket
in vivo
uttrykt som prosent av den ECAR nivå i Pc. (F) ATP-nivå i levedyktige tumorceller (T
V) isolert fra HepG2-tumorer dyrket
in vivo
uttrykt som prosent av den ATP-nivået i Pc. (G) Spredning av T
V og T
DR-celler isolert fra HepG2 svulster vokst
in vivo
uttrykt som prosent av spredning av PC. Celler ble sådd ut ved en konsentrasjon på 2 x 10
4, og det totale antall celler ble bestemt etter 24 og 48 timer av kulturen. (H) En ordning for H
2S-Nampt avhengig bioenergetisk krets. Celleskader fører til økt H
2S og Nampt at coordinately føre til metabolske endringer. Disse cellene oppviser eksponensiell vekst og toleranse mot skade. *;
p
0,05, **;
p
0.005, ***;
p
. 0,0005
Basert på disse funnene, foreslår en ordning der kreftceller utvinnes fra skade endre sin metabolske profil via oppregulering av H
2S- Nampt pathway (figur 6 H). Dermed H
2S-Nampt avhengig energisk krets er en kritisk regulator av stresstoleranse, økt glykolyse, forbedret bioenergi og økt celledeling.
Diskusjoner
Den endogene produksjonen av H
2S er sterkt oppregulert i epitel-kolorektal og prostata kreftceller, og i tumoravledet endotelceller [28], [29]. I tråd med dette beviset, viser vi at epiteliale kreftceller (lever, bryst, hud) medfødt produsere store mengder hydrogensulfid uavhengig av deres opprinnelse. H
2S økes ytterligere i kreftceller ved akutt skade indusert ved hypoksi, hydrogenperoksyd og bleomycin, eller etter gjenvinning fra skade som et resultat av økt ekspresjon av H
2S-produserende enzymer,
CBS
og
CTH
.
