Abstract
Matrix metalloproteinase 7 (MMP7), en metallohydrolase involvert i utviklingen av flere kreftformer, er nedregulert i
Apc
Min /+
tykktarmskreft musemodell følgende sulindak behandling. For å avgjøre om denne effekten er relevant for den menneskelige tilstand, ble HT-29 menneskelige kolon kreftceller behandlet med sulindak og dets metabolitter, og sammenlignet med resultatene fra
in vivo
musestudier. Uttrykket av
MMP7
ble overvåket. Resultatene viste at sulindac sulfid effektivt nedregulert både
MMP7
ekspresjon og aktivitet. Videre aktivitetsbaserte proteomforskning viste at sulindac sulfid dramatisk redusert aktivitet av leukotrien A4 hydrolase i HT-29-celler som gjenspeiles i en reduksjon i nivået av sitt produkt, leukotrien B4. Denne studien viser at effekten av sulindak behandling i en musemodell for tykktarmskreft kan være relevant for den menneskelige motstykke og fremhever effekten av sulindak behandling på metallohydrolases
Citation. Guillen-Ahlers H, Tan J, Castellino FJ, Ploplis VA (2011) Effekt av sulindak Herding på Metallohydrolases i human tykktarmskreft cellelinje HT-29. PLoS ONE 6 (10): e25725. doi: 10,1371 /journal.pone.0025725
Redaktør: Matthew Bogyo, Stanford University, USA
mottatt: 03.02.2011; Godkjent: 09.09.2011; Publisert: 03.10.2011
Copyright: © 2011 Guillen-Ahlers et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (National Heart, Lung, and Blood Institute) stipend PO1HL07375 (til FJC). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs), for eksempel sulindak, er chemo-forebyggende reagenser mot kolorektal kreft [1], [2], [3]. Denne effekten er i samsvar med observasjoner
in vitro
i humane tykktarmskreftceller [4], så vel som
in vivo
i
Apc
Min /+
mus modell, hvor en stor reduksjon i tumorbyrde observeres [5]. Gastrointestinale komplikasjoner som utvikler seg i NSAID-brukere er godt dokumentert [6], og representerer en hindring i bruken av disse stoffene som chemo-forebyggende midler. De pleiotrope effekter av sulindak på tykktarm kreft forebygging er fortsatt uklart og hindre utvikling av mer spesifikke behandlinger med forminskede bivirkninger. Når det gjelder denne saken, har det vist seg at sulindak behandling fører til endringer i ekstracellulære matrise remodeling hendelser, herunder nedregulering av matriksmetalloproteinase 7 (
MMP7
) i tarm adenomer av
Apc
Min /+
mus [7].
MMP7 tilhører en gruppe av metallion-avhengige proteaser. I henhold til Merops database (www.merops.sanger.uk), matriks-metallproteaser (MMP), bestående av 24 medlemmer, omfatter M10 familien av MA familien av metallohydrolases klan M. MMP’er har vært sterkt implisert i utviklingen av mange kreft. Sletting av
MMP2 Hotell og
MMP9
i mus har vist seg å redusere bukspyttkjertel tumorigenesis ved å redusere angiogenese [8]. Relevant for denne studien,
MMP7
sletting i
Apc
Min /+
mus har vist seg å sterkt redusere intestinal tumor belastning [9]. Disse observasjonene implisere MMP7 som et levedyktig mål for utviklingen av nye behandlingsregimer.
studien bestemmes effekten av sulindac behandling på MMP7 i den humane koloncancer cellelinje HT-29, og benyttet en global tilnærming å oppdage endrede aktivitetene til andre metallohydrolases. Resultatene av disse undersøkelsene er beskrevet her.
Materialer og Metoder
Cell kultur
HT-29 celler (American Type Culture Collection, Manassas, VA) ble opprettholdt i McCoys 5A medium (Gibco, Grand Island, NY) med 10% føtalt bovint serum ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft /5% CO
2. Sulindak, sulindak sulfid, og sulindak sulfone ble kjøpt fra Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Disse stoffene ble fortynnet i dimetylsulfoksid (DMSO). DMSO ble tilsatt til mediet til en sluttkonsentrasjon på 1%, og cellene ble dyrket i 6-brønns plater. Når celler var 80% sammenflytende, ble de behandlet med forskjellige konsentrasjoner av sulindak og dets metabolitter. Etter 24 timer ble cellene trypsinert og levedyktige celler telles ved hjelp av trypanblått metoden.
Gene uttrykk
HT-29 celler, på tidspunktet for innhøsting, ble trypsinert, sentrifugeres og cellepelleten brukes til å ekstrahere RNA som følge av Qiagen-protokollen. Konsentrasjon og kvalitet av prøvene ble vurdert ved hjelp av den spektrale profilen oppnådd fra Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Sanntids revers transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR) ble utført som tidligere beskrevet [7]. Primere og prober konstruert for menneskelig
MMP7
,
MMP25
,
Trypsin1
, og
RPL-19
er vist i tabell 1.
for RT-PCR-studier, total-RNA ble ekstrahert fra HT-29 celler behandlet med DMSO eller 100 uM sulindac sulfid i 24 timer ved bruk av Qiagen-protokollen. RT-PCR reaksjon inkludert 2,5 × Hotmaster Mix (5 Primer Inc., Gaithersburg, MD), RNase Inhibitor, Multiscribe RT enzym, passiv henvisning fargestoff ROX, og SYBR Green. Total RNA (25 ng) ble Revere-transkribert i 30 ul reaksjonsblanding ved 48 ° C i 30 minutter. De følgende betingelser ble anvendt for amplifikasjon: pre-denaturering i 5 minutter ved 95 ° C, 30 sykluser med denaturering ved 95 ° C i 20 sekunder, annealing ved 59 ° C i 20 sekunder, og forlengelse ved 72 ° C i 25 sek. PCR-produkter ble separert ved elektroforese på en 3% agarosegel inneholdende etidiumbromid. En 50 bp DNA-stige (Promega, Madison, WI) ble anvendt som molekylvektmarkør.
Western blotting
proteom ble ekstrahert fra HT-29 celler og deretter behandlet med sulindak sulfid (100 uM) i 24 timer ved 80% konfluens. Cellene ble trypsinert, sentrifugert, og deretter vasket i PBS. Cellepelletene ble deretter Dounce homogenisert og sonikert. Proteomet ble sentrifugert ved 100.000 x
g
å skille cytosoliske og membran fraksjoner. Den utskilte fraksjon ble erholdt ved sentrifugering av cellemateriale ved 100.000 x
g
. Proteomet ble utfelt ved tilsetning av ammoniumsulfat. Prøvene ble passert over en PD-10 avsalting kolonne (GE Healthcare, Piscataway, NJ) og proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved hjelp av Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE). Prøver var belastning på en 10% polyakrylamidgel, elektroforese, og deretter overført til en PVDF-membran. Membranene ble inkubert over natten ved 4 ° C med polyklonalt kanin-anti-humant MMP7 (Abcam, Cambridge MA), og polyklonalt kanin-antihuman aktiv MMP7 (Abcam) ved 1 pg /ml i blokkeringsbuffer (PBS, 3% fettfri tørrmelk , 0,1% Tween 20). For MMP25 og α-Tubulin, kanin-anti-human MMP25 (Abcam) og muse anti-humant α-Tubulin (Santa Cruz Technology), respektivt, ble anvendt. HRP-konjugert anti-kanin-IgG-antistoff eller HRP-konjugert-anti-mus IgG (Cell Signaling Technology, Boston, MA) i blokkeringsbuffer ble brukt som det sekundære antistoff. Blottene ble utviklet ved hjelp av LumiGLO reagenser (Protein Forskning Products, Gaithersburg, MA) eller Western Lightning ECL substrat (Perkin Elmer Inc., Waltham, MA).
Aktivitetsbasert proteomikk for identifikasjon av aktiverte metallohydrolases
proteom ble justert til en konsentrasjon på 1 mg /mL, i PBS. En cocktail av alkyn prober rettet mot det aktive området av metallohydrolases var en sjenerøs gave av Benjamin F Cravatt (The Scripps Research Institute, La Jolla, CA). Merkingen ble utført som tidligere beskrevet [10]. I korthet prober ble tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 1 mM og inkubert under UV-lys i 1 time. Rhodamine azid ble deretter bundet til sondene bruker klikk kjemi [11]. Prøvene ble elektroforese på en 10% polyakrylamid gel og skannet ved hjelp av enten en Hitachi FMBio IIe planskanner (MiraBio, Alameda, California) eller KODAK In-Vivo multispektrale System FX (Carestream Health, Rochester, New York).
identifisering av aktivitetsbaserte merkede proteiner
real-size gel scan utskrifter ble brukt som en mal for å trekke ut de ønskede band og skannet etterpå for å sikre korrekt kutting av gelen. Hver gel pluggen ble redusert med 10 mM ditiotreitol i ammoniumbikarbonat og alkylert med 55 mM jodacetamid. Prøvene ble spaltet med 0,1 ug trypsin (Promega, Madison, WI) i 100 ul 10 mM ammoniumbikarbonat og inkubert over natten ved 37 ° C. Tryptiske peptider ble ekstrahert fra gel-plugger med 50% acetonitril /49,9% H
2O /0,1% trifluoreddiksyre, etterfulgt av 100% acetonitril og til slutt med 0,1% trifluoreddiksyre.
tryptiske peptider ble kromatografert på en 100 um x 10 cm C18 kolonne (partikkelstørrelse: 5 um) og eluert ved anvendelse av en lineær gradient på 3 til 45% acetonitril i H
2O i løpet av 70 minutter ved romtemperatur, ved en strømningshastighet på 500 nl /min. Elueringsmidlet ble elektro sprøytet inn i den lineære kvadrupol ionefelle (LTQ) massespektrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Sequest og X! Tandem algoritmer ble brukt til å søke i databasen utnytte internasjonale protein indeks (IPI) mus database.
Leukotriene B4 enzymimmunoassay
Ved 80% samløpet, HT-29 celler ble inkubert med enten sulindac sulfid eller DMSO i 24 timer. Den utskilte proteom- ble oppnådd og konsentrert ved vakuum-sentrifugering. Proteom ble justert til 5 mg /ml og LTB4 kvantifiseres med en enzymatisk immunoassay kit (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI).
Resultater
Den reduserte metabolitten av sulindak, sulindak sulfid, øker selektivt celledød av HT-29 celler
HT-29 celler ble behandlet med sulindak, sulindac sulfid, og sulindac sulfon ved konsentrasjoner i området 10-1000 pM (figur 1). Starter på 250 mikrometer, sulindak sulfid betydelig økt celledød, og nådde 100% celledød på 500 mikrometer. I motsetning til dette, sulindac og sulindac sulfon mislyktes i å vesentlig øke celledød, selv når medikamentene hvor tilsatt i mM konsentrasjoner.
Ved 80% sammenflyting ble cellene behandlet med økende konsentrasjoner av sulindac (grå), sulindac sulfid ( hvit), og sulindak sulfone (svart).
sulindak sulfid reduserer
MMP7
på mRNA, protein, og aktivitetsnivået
det ble rapportert at to dager av sulindak behandling er tilstrekkelig til å nedregulere MMP7 i svulster
Apc
Min /+
mus [7]. For å bestemme hvilken metabolitt effektivt redusert MMP7, ble HT-29 celler ble behandlet med sulindak og dens metabolitter ved 100 pM, en konsentrasjon som ikke er toksisk for cellene som vist i figur 1, i 24 timer. Uttrykket profil
MMP7
ble sammenlignet med resultatene som tidligere ble oppnådd i musestudier (figur 2A). Bare den aktive metabolitten, sulindak sulfid, var i stand til å betydelig redusere uttrykk for
MMP7., En titrering kurve ved hjelp av ulike konsentrasjoner av sulindak sulfid avslørt at selv på 50 mikrometer,
MMP7
viste en liten (14%), men statistisk signifikant nedregulering av ekspresjon (p = 0,044) (figur 2B). På 100 uM, ble en reduksjon på 65% observert (p = 0,000001). Forskjellen mellom 100 um og 200 um var mindre dramatisk (11%), men var fremdeles signifikant forskjellig mellom de to konsentrasjoner (p = 0,017).
(A) Sanntid RT-PCR av RNA fra HT- 29 celler etter 24 timers behandling med DMSO, sulindac (S), sulindac sulfid (SD) og sulindac sulfon (Sn). Resultatene ble oppnådd ved bruk av metoden med ΔΔCt
hRPL-19
som husholdningsgenet. C
T-verdier mellom 20.10 og 20.56 på tvers av alle prøvene viser konstante nivåer av
hRPL-19
uttrykk. (B) uttrykk for
hMMP7
etter 24 timer med sulindak behandling. Den nedregulering av
hMMP7
var signifikant ved alle konsentrasjoner. Resultatene ble oppnådd ved bruk av metoden med ΔΔCt
hRPL-19
som husholdningsgenet. C
T-verdier mellom 23.22 og 23.56 på tvers av alle prøvene viser konstante nivåer av
hRPL-19
uttrykk. (C) cytosol, membran, og utskilles av proteomet fraksjoner utvunnet fra DMSO og sulindac sulfid-behandlede HT-29-celler ble utsatt for Western blot-analyse ved å bruke et antistoff som skiller ikke mellom aktiv og inaktiv MMP7 (øverst), og et antistoff som gjenkjenner bare det aktive sete (nederst). Den forventede band for MMP7 vises ved 28 kDa, men et bånd ved 45 kDa blir ofte rapportert, muligens en dimer. Cyto betegner cytosoliske fraksjon; Mem, membranfraksjonen, sekretærtjenester, utskilte fraksjon, og aMMP7, aktiv MMP7.
Western blotting av MMP7, i tillegg til det aktive sete av MMP7, ble utført på cytosol, membran, og utskilte fraksjoner av HT-29 proteom etter 24 timer av sulindak sulfid behandling på 100 mikrometer (Figur 2C). I begge tilfeller MMP7 ble bare påvist i de utskilte fraksjoner av proteome. Sulindac sulfid behandling viste en klar reduksjon av MMP7 i det utskilte fraksjon ved en 100 uM konsentrasjon. Western blot analyse rettet mot det aktive området av MMP7 avdekket en fullstendig bortfall av påvisbare aktive MMP7 etter sulindak sulfid behandling.
For å finne ut om andre MMP, andre klasser av proteaser og husholdningsgenet, RPL-19, ble påvirket av sulindak i HT-29 celler, RT-PCR (hele celleekstrakter) og Western blot (utskilt, cytosolic, og fraksjoner) analyser ble utført. mRNA for MMP25, trypsin1, og RPL-19 ble ikke endret etter sulindak sulfid behandling (figur 3A, B). Western blot-analyse av membranfraksjonen av disse cellene bekreftet RT-PCR-resultater for MMP25 (figur 3C).
(A) PCR-produkt av RT-PCR av RNA fra HT-29-celler etter 24 timers behandling med DMSO eller sulindak sulfid. Lane 1, 50 bp DNA stigen; lane 2,
MMP25
etter sulindak sulfid behandling; spor 3,
MMP25
etter DMSO behandling; lane 4,
Trypsin1
etter sulindak sulfid behandling; lane 5,
Trypsin1
etter DMSO behandling; kjørefelt 6,
MMP7
etter sulindak sulfid behandling; lane 7,
MMP7
etter DMSO behandling; kjørefelt 8
RPL-19
etter sulindak sulfid behandling; kjørefelt 9,
RPL-19
etter DMSO behandling. Resultatene viser at bare
MMP7
uttrykk påvirkes av sulindak sulfid behandling. (B) Kvantitativ RT-PCR av
MMP25
,
Trypsin1
, og
MMP7
etter DMSO eller sulindak sulfid behandling. Resultatene ble oppnådd ved bruk av metoden med ΔΔCt
hRPL-19
som husholdningsgenet. Resultatene tyder på kvantitative forskjeller i
MMP7
uttrykk etter sulindak sulfid behandling i forhold til DMSO behandling. (C) Western blot av utskilt brøkdel av HT-29 celler som viser at proteinnivåer MMP25 i membranfraksjonen er lik mellom sulindak sulfid og DMSO behandlede celler.
Aktivitetsbasert protein profilerings målretting metallohydrolases avslører en nedgang i LTA4H aktivitet
proteom hentet fra HT-29 celler etter 24 timers behandling med sulindak sulfid eller DMSO ble merket med en sonde cocktail rettet mot metallohydrolase super og kjøre på en 1D gel. Et sterkt bånd mellom 60 og 65 kDa ble observert i HT-29 celler behandlet med DMSO. Sulindac sulfid-behandlede celler viste et svakt bånd av lignende molekylvekt. Båndene ble kuttet ut og analysert ved hjelp av massespektrometri. Prøvene ble kjørt ved lineær kvadrupol MS /MS (figur 4), og resultatene passet med den Merops database for metallohydrolases. Det var to peptider (LTYTAEVSVPK og LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK) oppdaget i ~70 kDa band som matchet leukotrien A4 hydrolase (LTA4H). Den forutsagte molekylvekt av LTA4H er 69 kDa. LTA4H har tidligere blitt vist å være et mål for denne metalloprotease sonde cocktail (10).
Metallohydrolase aktivitet basert på merking av HT-29 celler utskilt proteom. MMP2 og MMP7 standarder ble tilsatt celle proteom (piler). Bandet som viser en sterk nedgang (*) etter sulindac sulfid behandling ble ekstrahert og analysert ved massespektrometri. MS /MS-spektra av LVVDLTDIDPDVAYSSVPYEK og LTYTAEVSVPK peptider som tilsvarte aminosyrene 366-386 og 155-165, respektivt, av LTA4H proteinet. Proteininnhold i alle prøvene ble justert til 1 mg /ml og den tilsvarende 15 ug proteom- ble tilsatt pr kjørefelt. MW betegner molekylvekt; Kjønnssykdommer, standarder, Sd, sulindak sulfid-behandlet og D, DMSO-behandlet.
For å validere reduksjon i LTA4H aktivitet, ble en enzymatisk immunoassay brukes til å måle leukotrien B4 (LTB4) nivåer etter sulindac behandling (figur 5). Sulindac sulfid-behandlede celler viste sterkt reduserte nivåer av LTB4 i forhold til DMSO-behandlede celler.
Utskilte proteom DMSO-behandlede og sulindac sulfid-behandlede celler ble analysert for LTB4-nivåer ved hjelp av en enzymatisk immunologisk måling.
Diskusjoner
Denne studien viste at sulindak sulfid er i stand til å redusere RNA og proteinnivåer MMP7, som er konsistent med det som ble observert i mus studier [7]. Gjennom aktivitetsbaserte protein profilering, ble det vist at sulindac sulfid dramatisk reduserer aktiviteten av LTA4H. Dette resultatet ble bekreftet av redusert nivå av LTB4.
Involvering av metalloproteaser i tykktarmskreft har tidligere blitt identifisert, men utviklingen av behandlingsstrategier rettet mot disse enzymene har vært mislykket [12]. Ett problem er den lave spesifisiteten av metallprotease hemmere som har gjort det til kliniske studier. MMP7 har imidlertid konsekvent blitt funnet å være relevante i tykktarmskreft og dets dyremodeller [9], [13]. Denne studien viste at sulindac sulfid er i stand til å redusere ekspresjonen av
MMP7
i den humane koloncancer-cellelinje HT-29, som også ble observert,
in vivo
, i
APC
Min /+
mus [7]. For å bestemme om andre MMP’er eller andre klasser av proteaser ble også endret, MMP25, en membran-assosiert MMP som blir høyt uttrykt i kreftceller [14], og trypsin1 ble analysert og vist å være upåvirket av sulindac sulfid behandling. I tillegg husholdningsgenet RPL-19 ble heller ikke berørt av dette NSAID. Nobiletin, en annen agent med kreft egenskaper, har også vist seg å nedregulere
MMP7 product: [15] i HT-29 celler. Flere mekanismer har blitt foreslått ved hvilken MMP7 fremmer tumorvekst. Flere av disse studiene kobling MMP7 med en forstyrret Fas-mediert apoptotisk respons [16], [17], [18], og betennelse knyttet til tilrettelegging av tumorvekst har blitt foreslått å være forårsaket av MMP7 spaltning av Fas-liganden [19].
Sink metallopeptidases bestå av 12 medlemmer og tilhører familien av metallohydrolases. Disse proteaser har vært implisert i en rekke kreftformer, inkludert aminopeptidase N i tykktarmskreft [20], cystinyl aminopeptidase i nyrekreft [21], og LTA4H i lunge og tykktarm adenokarsinomer [22]. Dette er den første studien bindings sulindac til å regulere LTA4H. Den nedregulering av aktiviteten til LTA4H, og reduksjon i tumorbelastning, etter sulindak behandling støtter studier hvor det har vist seg å være oppregulert i tykktarmskreft. Videre [6] -gingerol, en naturlig komponent med antitumorigenic egenskaper, er blitt funnet å undertrykke veksten av kreft ved LTA4H inhibering [23]. Nedgangen i LTA4H aktivitet ble bekreftet ved observasjonen om at lavere LTB4-nivåene ble funnet etter behandling sulindac. LTB4 er et velkjent eicosanoid med kjemotaktiske egenskaper og har vist seg å stimulere spredning,
in vitro
, av HT-29 tykktarm kreft celler [24].
Det har ikke vært noen annen rapport av involvering av sulindac eller andre NSAID, på MMP7 eller LTA4H uttrykk. Men i foreløpige studier, har vi vist at sulindak er ikke den eneste NSAID stand downregulating
MMP7
, dvs. acetylsalisylsyre (data ikke vist), noe som tyder på at
MMP7
er nedregulert med et delt NSAID mekanisme [7], [25] og ikke en unik egenskap ved sulindak.
i sammendraget, denne studien identifiserte to kandidater, som tidligere er rapportert å være svært relevant i svulstutvikling, som er endret etter sulindak behandling . Nye behandlingsmetoder selektivt rettet mot MMP7 og LTA4H, enkeltvis eller i kombinasjon, tilby nye terapeutiske tilnærminger som kan dra nytte av fordelene med sulindak behandling, men potensielt uten de negative bivirkninger av dette stoffet.
Takk
forfatterne takker Benjamin Cravatt (Scripps Research Institute, La Jolla CA) for alkyn prober rettet mot det aktive området av metallohydrolases og Sherry Niessen og Eranthie Weerapana (Scripps Research Institute, La Jolla CA) for teknisk bistand med proteomikk eksperimenter.
