Abstract
Bakgrunn
Bevaring av microRNAs i formalinfiksert og parafininnebygd (FFPE) vev gjør dem spesielt nyttig for biomarkør studier. Nytten av små RNA sekvensering for mikroRNA uttrykk profilering av FFPE-prøver har ennå ikke bestemt.
Metoder
Total RNA ble ekstrahert fra de-paraffinized og proteinase K-behandlede FFPE- prøver (15- 20 år) med 8 humane lunge adenokarsinom tumorer ved affinitetskromatografi på silika kolonner. MicroRNAs i RNA preparatene ble kvantifisert ved Illumina HiSeq 2000 sekvense plattform med sekvens biblioteker utarbeidet med TruSeq små RNA Sample Preparation Kit (versjon 2.0) for å få uparet leser på 50 b for små RNA fragmenter. MicroRNAs ble også kvantifisert ved hjelp av Agilent Menneskelig miRNA (slipp 16,0) mikromatriser som kan oppdage 1.205 modne microRNAs og ved kvantitativ revers transkripsjon (RT) -PCR analyser.
Resultater
Mellom 9,1 til 16900000 leser ble oppnådd ved små RNA-sekvensering av ekstrahert RNA prøver. Av disse er det kun 0,6 til 2,3% (gjennomsnitt = 1,5%) representert microRNAs. Den sekvenseringsmetode oppdaget 454-625 microRNAs /prøve (gjennomsnitt = 550) sammenlignet med 200-349 (gjennomsnitt = 286) microRNAs oppdaget av microarray. I Spearman korrelasjonsanalyse, gjennomsnittlig korrelasjonskoeffisient for de 126 microRNAs påvist i alle prøvene ved begge metodene var 0,37, og 0,5 for 63 microRNAs. I korrelasjonsanalyser av sequencing- og RT-PCR-baserte målinger koeffisientene var 0,19 til 0,95 (gjennomsnitt = 0,73) og 0,7, henholdsvis, for syv av ni undersøkte microRNAs. Den gjennomsnittlige inter-replikere Spearman korrelasjonskoeffisient for sekvensering metoden var 0,81.
Konklusjoner
Små RNA sekvensering kan brukes til å oppnå mikroRNA profiler av FFPE- vevsprøver med ytelsesegenskaper som ligner de av mikromatriser , til tross for fragmentering av ribosomale og messenger RNA som reduserer metodens informative kapasitet. Nøyaktigheten av metoden kan tenkes å bli bedre ved å øke sekvense dybde og /eller tappe FFPE- vev RNA av ribosomale RNA fragmenter
Citation. Buitrago DH, Patnaik SK, Kadota K, Kannisto E, Jones DR, Adusumilli PS (2015) små RNA sekvensering for profilering microRNAs i langsiktige Bevarte formalinfiksert og parafin Embedded ikke-småcellet lungekreft vevsprøver. PLoS ONE 10 (3): e0121521. doi: 10,1371 /journal.pone.0121521
Academic Redaktør: Soheil S. Dadras, University of Connecticut Health Center, UNITED STATES
mottatt: 27 august 2014; Godkjent: 03.02.2015; Publisert: 26 mars 2015
Copyright: © 2015 Buitrago et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer
Finansiering:. forfatternes laboratoriearbeid er støttet med tilskudd fra National Institutes of Health (R21 CA164568-01A1, R21 CA164585-01A1, R01 CA136705-06, U54 CA137788, P30 CA008748, og P50 CA086438-13), US Department of Defense (PR101053 og LC110202), og Mr. William H. Goodwin og Mrs. Alice Goodwin, Commonwealth Foundation for kreftforskning og Experimental Therapeutics Center of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser. To av medforfattere av dette manuskriptet (PA og SKP) er PLoS ONE redaksjon~~POS=TRUNC styremedlemmer. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til PLoS ONE redaksjonelle retningslinjer og kriterier.
Innledning
microRNAs er single-strandet, ikke-kodende RNA av 18-25 nukleotider i lengde som fungerer som epigenetisk regulatorer ved å hemme protein oversettelse fra eller indusere nedbrytning av budbringer RNA (mRNA) transkripsjoner at de målet [1, 2]. MicroRNAs er involvert i viktige biologiske prosesser slik som celleproliferasjon, differensiering og apoptose [3], og den feilregulering av microRNAs er vist i initiering og progresjon av en rekke humane maligniteter [4-8]. Karakterisering av mikroRNA uttrykk har vært nyttig i klassifisering, diagnose og prognose av flere kreftformer [9-12].
Vevsprøver som har blitt bevart gjennom fiksering i formalin er en verdifull ressurs for retrospektive studier. På grunn av sin enkelhet og lav kostnad, blir store mengder av kliniske prøver rutinemessig lagring etter formalinfiksering. I motsetning til mRNA, microRNAs bevare godt i formalinfiksert vev på grunn av deres ultra-kort lengde [13, 14]; Dette tillater bruk av slike vev for mikroRNA målinger for kliniske og forskningsformål. MikroRNA profiler av formalinfiksert og parafininnstøpte (FFPE) vev er sammenlignbare med de hentet fra matchet, fersk-frosne vevsprøver (f.eks [15, 16-19]), understreker egnethet FFPE eksemplarer som hensiktsmessige ressurser til mikroRNA uttrykk analyser. Et stort antall studier på den biologiske rolle, så vel som anvendeligheten av biomarkør microRNAs har derfor blitt utført ved anvendelse av FFPE-prøver (f.eks, [20, 21]).
Hybridisering mikromatriser blir rutinemessig brukt for global mikroRNA ekspresjon profilering av FFPE- prøver. Små RNA sekvensering har dukket opp som en ny teknologi for mikroRNA uttrykk profilering. Det tilbyr fordelene med høy sensitivitet og spesifisitet, deteksjon av både nye og kjente microRNAs, identifisering av mikroRNA sekvens polymorfismer og redigering, og enklere data normaliserings strategier for å sammenligne prøvene [22]. Med kostnadene for tilstrekkelig informative RNA-sekvenseringsanalyser som nærmer seg det av mikromatriser, og med forbedringer i brukervennlighet og robusthet av metoder for RNA-sekvensering av data analyse, er liten RNA-sekvensering sannsynligvis vil bli brukt oftere enn mikromatriser i nær fremtid. RNA i FFPE-prøver er kjemisk modifisert ved tverrbinding på grunn av formaldehyd, og det er vesentlig fragmentert [23] ved oksydasjon fra utsettelse for luft, aktivitet av endogen ribonuklease under fiksering, og bruken av høye temperaturer i løpet av parafin-innebygging prosess. Degradering av RNA forekommer også i løpet av dens isolasjon fra FFPE-prøver, noe som medfører langvarig eksponering for høye temperaturer (55 ° C-70 ° C). Små fragmenter av ribosomale RNA (rRNAs) og mRNA som følge av deres nedbrytning konkurrere med endogene små RNA (f.eks microRNAs) under RNA sekvensering. For eksempel viser Sanger DNA-sekvensering av cDNA klonet fra FFPE vev RNA at mer enn 80% av 18-25 nukleotid-sized små RNA i FFPE vev er fragmenter av rRNAs og overførings RNA [24]. Til tross for disse negative effektene av formalin fiksering, er det teoretisk mulig å profilere microRNAs i FFPE- vev hvis RNA sekvensering utføres med en tilstrekkelig dybde. Derfor søkte vi å undersøke muligheten for små RNA sekvensering for kvantifisering av microRNAs i FFPE-prøver. Når vi satt i gang dette arbeidet, var det bare en publisert studie som hadde forsøkt å ta opp dette spørsmålet [25].
Materialer og metoder
Etikk uttalelse
Denne studien ble utført med forstått skrevet og informert samtykke fra deltakerne og godkjent av Institutional Review Board of Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) i New York, New York (IRB antall WA0269-08).
vevsprøver
FFPE- eksemplarer av 8 terapi-naive ensomme patologiske scenen i lunge adenokarsinom svulster resected på MSK mellom januar 1995 og desember 1999 ble brukt. De 8 svulster var fra et sett med stadium I lunge adenokarsinom saker som tidligere har blitt beskrevet [26, 27]. Valsede deler av 4 mikrometer og 20 mikrometer tykkelse ble innhentet fra prøvene for RNA ekstraksjon. De 4 mikrometer seksjoner ble farget med hematoksylin og eosin for histologisk vurdering under en BX51 mikroskop (Olympus, Tokyo, Japan) for å sikre at RNA ble ekstrahert fra vev med 70% svulst innhold
RNA ekstraksjon og kvantifisering.
Total RNA ble isolert fra 4 seksjoner, eller ca. 3 mm
3 av hver tumor, ved hjelp av affinitets-spinnkolonne-baserte høy Pure FFPE RNA Isolation Kit (Roche, Indianapolis, USA). RNA ble kvantifisert via absorbans spektrofotometri på en Nanodrop 2000 instrument (Thermo Scientific, Waltham, USA) og via RiboGreen fargestoff fluorescens på en qubit fluorometer (Life Technologies, Carlsbad, USA). Integritet av RNA ble vurdert ved hjelp av elektroforese på eukaryote Total RNA Pico chip på Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, USA). RNA prøver ble lagret ved -80 ° C.
Microarray analyse av microRNAs
Åtte RNA prøver ble analysert i duplikat, og i egne microarray eksperimenter for de to settene med gjentak. Agilent SurePrint G3 Menneskelig miRNA 8x60k (slipp 16,0) microarray plattform [28] ble brukt. Denne plattformen kan oppdage 1205 mennesker og 287 menneskelige virus modne microRNAs. For hver av disse microRNAs og kontroll RNA, har microarray 1-4 forskjellige DNA-prober av 40-60 b; hver av disse ble syntetisert på microarray på 10-40 flekker av 30 mikrometer diameter. RNA (120 ng) ble merket med 3 «, 5′-cytidin bisfosfat med cyanin fargestoff festet til 3»-fosfat og de ble hybridisert i 45 ul til en microarray i 20 timer ved 45 ° C under rotasjon i 1/3 Hz, ved hjelp av reagenser og metoder som følger med Agilent miRNA Komplett Merking og Hybridisering Kit. Etter post-hybridisering vask, ble microarray lysbilder scannet på en Agilent G2505C microarray scanner og data fra bildene ble hentet ved hjelp av Agilent Feature Extraction (versjon 9.5.3). Raw microarray data ble avsatt i NCBI Gene Expression Omnibus depot [29] (tiltredelse antall GSE57835).
Små RNA sekvense
En mikrogram RNA ble brukt til å generere en liten RNA sekvense biblioteket ved hjelp av reagenser og metoder som følger med TruSeq små RNA Sample Prep Kit versjon 2 (Illumina, San Diego, USA). I korthet, ble T4-RNA-ligase som brukes for å ligere RA5 og RA3 RNA-oligonukleotider til 5 «og 3» ender av RNA, respektivt. Adapter-ligert RNA ble revers-transkribert ved anvendelse av en RTP primer og det resulterende cDNA ble amplifisert i en 11-syklus PCR som benyttet RP1 og indeksert RP1 primere. PCR-produktene fra 140-160 bp ble isolert etter elektroforese gjennom en 6% Novex Tris-borat polyakrylamid gel (Life Technologies). Kvaliteten på den genererte lite RNA sekvensering bibliotek ble bekreftet ved hjelp av Agilent High Sensitivity DNA analyse Kit på Bioanalyzer 2100 instrument. Quadruplexed sekvensering av biblioteker for å generere én ende leser på 50 b ble utført på Illumina HiSeq 2000 instrumentet med HiSeq clustering og sekvense reagenser (versjon 2.0). Illumina HCS (versjon 1.4.8), RTA (versjon 1.12.4.2), og casava (versjon 1.8.2) programvare ble anvendt for basis-ringer og generering av rå, de-multiplekset sekvenseringsdata i FASTQ format. Rå sekvense data ble avsatt i NCBI Sequence Les Arkiv [30] (tiltredelse antall SRP047429).
Revers transkripsjon (RT) -PCR analyser av små RNA
Kort, 50 ng av RNA var revers transkribert i 15 ul med en mikroRNA-spesifikk oligonukleotid; reagenser og metoder ble gitt i TaqMan mikroRNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies). CDNA (1,33 ul) ble anvendt som templat i sanntid PCR på 40 sykluser og 15 ul som ble utført i triplikat på en 7900HT maskin (Life Technologies) med denaturering i 15 sekunder ved 95 ° C og kombinert utglødning og forlengelse i 60 s ved 60 ° C. SDS-programvaren (versjon 2.4, Life-teknologi) ble brukt til å beregne kvantifisering syklus (C
q) verdier med automatisk start og terskel deteksjon. DNA-oligonukleotider som følger med TaqMan mikroRNA RT-PCR-analyser [31] med identifikasjonsnummer 397, 509, 1097, 398, 526 og 2340 (Life Technologies), ble brukt til å kvantifisere menneskelig modne microRNAs
MIR-21-5p
–
205-5p
, –
146b-5p
, –
22-3p
, –
223-3p
, og-
423-5p
hhv. Moden microRNAs
MIR-16-5p
, –
210-3p
, og-
486-5p ble målt ved hjelp av tilpassede analyser som ble laget basert på prinsippet om TaqMan
mikroRNA RT-PCR-analyser og ble deretter validert (referanser [31, 32] og S1 tabell). Alle RT-PCR-analyser ble utført i et enkelt eksperiment og data-set av rå C
q-verdier ble normalisert ved hjelp av den globale middeltemperaturen metoden [33].
Bearbeiding og analyse av microarray data
Rådata fra alle mikromatriser ble behandlet sammen med AgiMicroRna Bioconductor pakken [34] (versjon 2.10.0) i R (versjon 3.0.2). Kort fortalt, og som per optimal arbeidsflyt identifisert for microarray plattform [35], den robuste multi-chip gjennomsnittet (RMA) metoden [36] ble først brukt for probe-set samandrag uten bakgrunn korreksjon; dataene på tvers av matriser ble deretter normalisert med quantile metoden. En enkelt uteliggeren microarray ble identifisert ved undersøkelse av normaliserte data ved hjelp av relativ log uttrykk, uten tilsyn hierarkisk clustering, inter-matrise korrelasjon, og hovedkomponent tomter; rå microarray data ble gjen behandlet etter eksklusive uteliggeren. Moden mikroRNA identifikasjonsnumre (MIMAT IDS) av microRNAs påvisbare med microarray plattform ble hentet fra miRBase mikroRNA sekvens depot [37] (versjon 20). Verdien av IsGeneDetected flagg, som ble deermined av Agilent Feature Extraction programvare, ble brukt til å avgjøre om microRNAs ble oppdaget av plattformen.
Bearbeiding og analyse av RNA sekvense data
Trimmomatic [38 ] (versjon 0.32) ble brukt til å trimme leser av adapter og dårlig kvalitet baser med disse kriteriene, i rekkefølge: (1) fjerne lese segmenter som passet sekvenser av adaptere og primere som brukes for sekvensering bibliotek forberedelse; (2) fjerne fremre /bakre baser med Phred
33 basis kvalitet poengsum 3; (3) ved hjelp av et glidende vindu av 4 baser, fjerne 5′-terminale base, hvis den gjennomsnittlige Phred
33 stillingen av de 4 baser var mindre enn 15; og (4) helt forkaste trimmet leser med 16 gjenværende baser. For å bestemme moden mikroRNA uttrykk, ble miRExpress [39] (versjon 2.0) som brukes til å kartlegge behandlet leser mot humant pre-mikroRNA og modne mikroRNA sekvenser (miRBase frigjøre 20). Standardinnstillingene for miRExpress ble brukt under prosessen (100% identitet mellom lese- og pre-mikroRNA sekvens for justering, lese lengde ≥80% av modne mikroRNA lengde, og ≤4 ekstra fremre /bakre baser i en lese i forhold til å modne mikroRNA sekvens ). For å oppsummere count verdier av lyder som tilordnes til én enkelt moden mikroRNA men flere pre-microRNAs, avrundet gjennomsnitt eller median verdien av pre-mikroRNA-kartlegging tellinger ble brukt da den maksimale verdien var mindre enn 50% eller ≥50% av minimum, henholdsvis. Den oppsummert rå modne mikroRNA telle data ble deretter normalisert tvers prøver ved bruk av trimmet gjennomsnitt av M-verdier (TMM) normaliseringsfremgangsmåten, som angitt i kantskjæreren Bioconductor pakken [40] (versjon 3.2.4). For å bestemme biotypes av RNA (f.eks mRNA, rRNA, mikroRNA, etc.) at sekvensering leser representert, subread-align funksjon av Subread aligner programvare [41] (versjon 1.4.4) ble brukt til å justere behandlet leser-med multi-mapping tillatt og en ungapped genom indeks til det menneskelige genom (Ensembl GRCh37.75 primærenheten). Den featureCounts funksjon [42] av Subread ble deretter brukt, med multi-overlappende lov, for å identifisere RNA «biotype at sekvensering leser representert via undersøkelse av merknader av genom steder at leser ble tilordnet. Den Ensembl er GRCh37.75 genet merknads data med . 25 forskjellige gene_biotype attributtverdier ble brukt
Annet
For analyser som involverte sammenligning av gjentak, normalisert mikromatriser, og normaliserte og logge
2-transformert (med offset = 0,1) sekvense data ble i tillegg behandlet med parametrisk Combat funksjon av SVA Bioconductor pakken [43] (versjon 3.6.0) for å justere for batch effekten av separate microarray eller sekvense eksperimenter brukes for gjentak. For korrelasjonsanalyser, normalisert microarray- og sekvensering-baserte mikroRNA målinger var log
2-transformert og RT-PCR-basert normalisert C
q målinger for microRNAs var negative-transformert. Prism programvare (versjon 6.0c, GraphPad, La Jolla, USA) ble brukt til å plotte data. En
P
-verdi 0,05 ble assosiert med statistisk signifikans. RT-PCR-analyser og dataanalyser ble utført ved Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA; alt annet arbeid ble gjennomført på MSK.
Resultater og diskusjon
Vi hentet total RNA fra FFPE- eksemplarer av resected stadium I lunge adenokarsinom svulster. RNA ble isolert ved anvendelse av silikamatriks-inneholdende spinnkolonner fra omtrent 3 mm
3 fra FFPE vev (n = 8) etter natten over spaltning med proteinase K. RNA utbytter varierte 8,0 til 59,7 ug, som kvantifisert ved absorbansen ved 260 nm, men 6,1 til 34,6 mikrogram, som kvantifisert med RiboGreen fargestoff. Dette har mer spesifisitet for RNA enn det gjør for DNA (fig. 1A), og det tyder på tilstedeværelsen av DNA i preparatene, som har blitt notert av andre [32]. Som forventet, gelelektroforese assay på Bioanalyzer instrument viste at RNA isolert fra FFPE-prøver var sterkt nedbrutt (Fig. 1B), med verdier av RNA integritet som strekker seg 1,9 til 2,5 [44].
A. Korrelasjon mellom målinger av RNA utbytte (ug) oppnådd ved anvendelse av absorbansen ved 260 nm eller fluorescens med RiboGreen fargestoff (n = 8). Linjene om identitet og lineær regresjon (minste kvadraters metode) og verdier og 95% konfidensintervall av Pearson koeffisienten (
r
) og skråningen av lineær regresjon (
m
);
P
-verdier er også notert. B. Electrophoretogram av de 8 RNA prøver (
A
–
H
). Prøvene ble kjørt på et Agilent eukaryote Total RNA Pico-brikken på Bioanalyzer 2100. Størrelser av molekylvektmarkører og RNA integritets tallene er angitt.
Sekvense bibliotekene ble samlet fra 1 ug av hver av de totale RNA prøver ved ligering av adapter RNA ved 5 «og 3» endene, etterfulgt av revers transkripsjon og PCR der Illumina TruSeq små RNA Sample Preparation Kit. Bibliotekene ble størrelse valgt for sekvensering av RNA fragmenter av 15-25 nukleotider. Sekvensering ble utført på Illumina HiSeq 2000 plattformen for å tilveiebringe enkelt-ende-leser på 50 baser. Mellom 9,1 og 16,9 millioner lesninger ble oppnådd for hver av de 8 prøver (gjennomsnitt = 13,2 millioner, SD = 3,5 millioner; Tabell 1). Etter leser ble behandlet for å fjerne nukleotid sekvenser av adaptere brukes for bibliotek forberedelse og baser av dårlig kvalitet, 67.6-% 83,4% (gjennomsnitt = 76,8, SD = 4,5) av lyder kan kartlegges mot hg19 referansen menneskelige genom enheten (Ensembl GRCh37.75 primære montasje). Mer enn 90% av den tilordnede leser innrettet mot transkriberte regioner av genomet. Men bare 0,14% -0,53% (gjennomsnitt = 0,29, SD = 0,13) av leser kartlagt til loci for microRNAs, mens 49,4% -54,6% og 34,8% -39,3% kartlagt til regioner som kodet for rRNAs og mRNA, henholdsvis (Tabell 1). Dermed er det bare en meget liten del (ca. 0,1% -0,5%) av små RNA fra 15-25 nukleotider som ble isolert fra vevsprøvene FFPE var microRNAs; det overveldende flertallet av disse var rRNA og mRNA-fragmenter.
mikroRNA uttrykk profiler ble hentet fra de små RNA sekvense data ved hjelp av miRExpress verktøy [39]. MiRExpress kartlagt 0,6% -2,2% av prosessert sekvense leser å modne menneskelige microRNAs. Per miRBase mikroRNA sekvens database utgivelse 20 (juni 2013), 2,620 modne menneskelige microRNAs ble kjent [37]. Totalt 1,021 microRNAs ble detektert (kartlagt lese telle ≥1) blant de 8 prøver, med 454-625 detektert per prøve (gjennomsnitt = 550; SD = 69), og 283 påvist i alle prøver. For å validere de små RNA-sekvensering-baserte mikroRNA målinger, ble kvantitative RT-PCR-analyser anvendes for å kvantifisere 9 vilkårlig valgt microRNAs som ble vurdert som detekteres av både den microarray og små RNA-sekvenseringsplattformene i alle de 8 RNA prøver. I Spearman korrelasjonsanalyser av de mikroRNA målingene oppnådd ved RT-PCR og små RNA-sekvensering, korrelasjonskoeffisientene var 0,19 til 0,95 (gjennomsnitt = 0.73, SD = 0.24). Koeffisienten verdien var 0,7 til 7 av de 9 microRNAs (tabell 2), og derved indikerer en moderat nøyaktighet av RNA-sekvenseringsmetode. For å estimere teknisk reproduserbarheten av mikroRNA ekspresjonsanalyse via sekvenseringsmetode, 2 av de 8 RNA prøver ble utsatt for små RNA-sekvensering i et duplikat eksperiment. Den inter-replikere Spearman korrelasjonskoeffisienter for de dupliserte mikroRNA målinger av de 2 prøvene var 0,75 og 0,88 (fig. 2).
microRNAs i 2 prøver (
A Hotell og
B
) ble profilert i duplikat av både små RNA sekvensering og microarray plattformer. Scatter-plott skildre den inter-replikere korrelasjon av normaliserte mikroRNA målinger. Den kumulative brøkdel av microRNAs langs X-aksen (
Svart
), og verdiene av Pearson korrelasjonskoeffisient av mikroRNA målinger i en glidende vindu langs X-aksen i størrelse 51 på midten av vinduet (
grå
) er også vist.
Kvantifisering av microRNAs via hybridisering av RNA til DNA-prober på mikromatriser er i dag standardmetoden for global mikroRNA profilering av FFPE- vev. For å vurdere resultatene av den lille RNA sekvenseringsmetode mer grundig, målte vi microRNAs i 120 ng av hver av de 8 FFPE- vev RNA prøver ved hjelp av Agilent 8x60k menneskelige miRNA microarray plattform, som er i stand til å oppdage 1.205 modne menneskelige microRNAs. Totalt 368 microRNAs ble detektert (IsGeneDetected flagg-verdi = 1) blant de 8 prøver, med 200-349 detektert per prøve (gjennomsnitt = 286; SD = 45) og 175 påvist i alle prøver. Av disse 175 microRNAs, ble 126 også påvist i alle 8 prøver av de små RNA-sekvenseringsmetode. I sammenligninger med RNA sequencing- og microarray-baserte mikroRNA målinger, gjennomsnittlig The Spearman korrelasjonskoeffisient for de 126 microRNAs var 0,37 og for de 63 microRNAs var 0,5. Sammenheng mellom FFPE- vev mikroRNA målinger innhentet av små RNA sekvensering og microarray plattformer har blitt bekreftet av andre grupper [45-47].
Microarray-baserte mikroRNA analysene ble replikert for 7 av de 8 RNA prøver. Målt mot et gjennomsnitt inter replikere Spearman korrelasjonskoeffisient på 0,81, sett med den lille RNA sekvenseringsmetode, mellom replikere Korrelasjonskoeffisienter for microarray plattform var i 0,98 til 0,99 området (gjennomsnitt = 0,99; SD = 0,01). Men i Spearman korrelasjonsanalyser av mikroRNA målingene oppnådd ved RT-PCR og mikromatrise-analyser, korrelasjonskoeffisientene ble -0.36-0.84 (gjennomsnitt = 0.22, SD = 0.55) og var mindre enn de som ble observert i RNA-sekvenseringsbaserte målinger (Tabell 2). Dermed, mens den lille RNA sekvense plattform oppdaget en større mengde microRNAs med større nøyaktighet enn microarray plattform, dens presisjon var ikke så bra. Tabell 3 oppsummerer ytelsesegenskaper som ble observert i de 2 mikroRNA profilering plattformer brukes i denne rapporten.
Totalt våre funn demonstrere gjennomførbarheten av små RNA-sekvensering for mikroRNA profilering av FFPE vev RNA på tross av sin kompromittert kvalitet og integritet. Selv om bare 1,54% av 12,1 millioner små RNA-sekvensering leser av FFPE- vev ble identifisert som representerer 550 kjente microRNAs i denne studien, antall microRNAs som ble påvist og kvantifisert var mer enn det av microarray plattform (tabell 1 og 3). De Spearman korrelasjonskoeffisienter for målinger innhentet av sekvense og microarray plattformer for halvparten av de 126 microRNAs som ble påvist i alle prøver av begge plattformene var 0,5. I korrelasjonsanalyser av sequencing- og RT-PCR-baserte målinger av ni microRNAs som ble undersøkt, var koeffisientene 0,7 til 7 (tabell 2). Den tekniske replikerbarhet av de små RNA-sekvenseringsmetode var imidlertid relativt dårlig i forhold til microarray-metoden (gjennomsnittlig inter-replikate Spearman korrelasjonskoeffisienter på 0,81 og 0,99, respektivt; tabell 3). Det er tenkelig at presisjonen av sekvenseringsfremgangsmåten kan forbedres ved å øke den dybde sekvensering for å oppnå et større antall leser og ved å benytte metoder for å utarme rRNA fra RNA-preparatene [48-50], eller for å redusere dens representasjon i sekvense biblioteket bruke strategier som «gift primer «blokkerer [24].
Bare én studie [25] hadde rapportert at muligheten for å bruke små RNA-sekvensering for mikroRNA profilering av FFPE vev RNA når vi satt i gang arbeidet er beskrevet i denne papir. Siden den gang i det siste året, har minst 5 andre studier vist at RNA sekvensering kan brukes til nøyaktig profil microRNAs i FFPE- prøver (S2 Table) [45-47, 51, 52]. Disse studiene for det meste utført fra cellelinjer og menneskelige FFPE- vev av 2-9 år har vist at mikroRNA uttrykk profiler innhentet av små RNA-sekvensering er høyt konkordant mellom FFPE og ferskt frosset vev [25, 47, 51, 52], og at små RNA sekvensering og microarray plattformer generere tilsvar mikroRNA profiler av FFPE- vev [25, 47]. Resultatene av disse og våre studier utført på NSCLC eksemplarer av 15 til 20 år gamle derfor vise at små RNA sekvensering kan brukes til å oppnå mikroRNA profiler av FFPE- vevsprøver med ytelsesegenskaper som ligner de av mikromatriser.
Hjelpemiddel informasjon
S1 Table. Custom TaqMan mikroRNA revers transkripsjon (RT) -PCR analyser for menneske modne microRNAs
MIR-210-3p Hotell og
MIR-486-5p
doi:. 10,1371 /journal.pone. 0121521.s001 product: (docx)
S2 Table. Seks studier som har vurdert RNA sekvensering for profilering microRNAs i formalinfikserte, parafininnstøpte vev
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0121521.s002 plakater (DOCX)
Takk
Vi takker Alex Torres av Thoracic Surgery service på MSK for sin redaksjonelle hjelp.
