Abstract
I mange typer kreft, har en side befolkningen (SP) blitt identifisert basert på høy utstrømming kapasitet, for derved å anrike for kjemoresistent celler, så vel som for kandidat kreft stamceller (CSC). Her utforsket vi om menneskelige bukspyttkjertel ductal adenokarsinom (PDAC) inneholder en SP, og om dens genuttrykk profilen er forbundet med chemoresistance, CSC og prognose. Etter spredning i enkeltceller og inkubasjon med Hoechst fargestoff, analyserte vi menneskelige PDAC resections eksemplarer ved hjelp av flowcytometri (FACS). Vi identifiserte en SP og hoved befolkningen (MP) i alle menneskelige PDAC reseksjon prøver (n = 52) analysert, men oppdaget immun (CD45
+) og endothelial (CD31
+) celler i denne fraksjonen sammen med tumorceller . De SP og MP celler, eller mer rensede fraksjoner utarmet fra CD31
+ /CD45
+ celler (PSP og PMP), ble sortert etter FACS og utsatt for hel-genom uttrykk analyse. Dette avslørte oppregulering av gener assosiert med terapi motstand og markører identifisert før i antatte bukspyttkjertelen CSC. PSP gen signaturer av 32 eller 10 opp- eller nedregulert gener ble utviklet og testet for diskriminerende kompetanse mellom PSP og PMP i ulike sett av PDAC prøver. Den prognostiske verdien av PSP genene ble validert i en stor uavhengig serie PDAC pasienter (n = 78) ved hjelp av NCounter analyse av uttrykket (i tumor
versus
rundt bukspyttkjertelen vev) og Cox regresjon for sykdom og total overlevelse. Av disse genene, uttrykk nivåer av
ABCB1 Hotell og
CXCR4
var korrelert med dårligere pasient overlevelse. Dermed vår studie for første gang viser at menneskelig PDAC inneholder en SP. Dette svulst undergruppe kan representere en verdifull terapeutisk mål gitt sin chemoresistance- og CSC-forbundet genekspresjon egenskaper med potensiell prognostisk verdi
Citation. Van den Broeck A, Vankelecom H, Van Delm W, Gremeaux L, Wouters J , ALLEMEERSCH J et al. (2013) Menneskelig Bukspyttkjertelkreft Inneholder en Side Befolknings Uttrykke Cancer Stem Cell-Associated og Prognostiske gener. PLoS ONE 8 (9): e73968. doi: 10,1371 /journal.pone.0073968
Redaktør: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., USA
mottatt: May 15, 2013; Godkjent: 23 juli 2013; Publisert: 17.09.2013
Copyright: © 2013 Van den Broeck et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Studien er støttet av Fond for Scientific Research Flandern (FWO ASP-08-00379; 3M080177). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
til tross for store anstrengelser for å forbedre sin prognose, kreft i bukspyttkjertelen (pankreas ductal adenokarsinom eller PDAC) er fortsatt en viktig årsak til kreftrelatert dødelighet [1]. Forsinket deteksjon og behandling motstand er kritiske faktorer som bestemmer PDAC behandlingssvikt. En bedre forståelse av mekanismene bak terapiresistens er derfor viktig. I flere typer kreft, har en side populasjon (SP) blitt identifisert som en subpopulasjon som beriker for celler som er kjemo- og radioresistant på grunn av tilstedeværelsen av multilegemiddel transportører og evne til å reparere DNA-skade og motstå apoptose [2]. Basert på deres utstrømning kapasitet, er SP-celler identifisert i flow-cytometrisk (FACS) analyse som en sidegren av «Hoechst-lav»-celler etter inkubasjon med Hoechst33342 fargestoff [3].
Therapy motstand er også vurdert en spesiell karakteristikk av såkalte kreftstamceller «(CSC) [4]. CSC er tenkt å overleve konvensjonell terapi og derfor ansvarlig for svulst tilbakefall. Kandidat bukspyttkjertelen CSC populasjoner har nylig blitt identifisert basert på cellemembran markører. CD24
+ /CD44
+ /epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)
+ celler og CD133
+ celler ble vist å vise CSC egenskapene [5], [6]. Det er imidlertid bare delvis overlapping ble funnet mellom disse forskjellige pankreatiske CSC populasjoner, noe som indikerer behov for alternative identifikasjons strategier. I forskjellige krefttyper, har SP blitt vist å være anriket for CSC (-lignende) fenotype og aktivitet [7]. Når det gjelder kreft i bukspyttkjertelen, ble en SP tidligere funnet i dyrkede cellelinjer [8] – [11], og nylig, vår gruppe identifisert en SP i xenografttumorer vokst fra humane PDAC prøver i immunsvikt mus [12]. Disse SPs ble vist å ha kjemoresistent kapasitet. Det har imidlertid ikke vist seg om PDAC direkte fra pasienten, uten å gripe kultur eller utvidelse i den murine vertsmiljøet, inneholder også en SP. I denne studien rapporterer vi at PDAC isolert fra pasienter havner en SP, og at dette SP uttrykker gener assosiert med bukspyttkjertelen CSC og chemoresistance, så vel som med pasientens prognose.
Materialer og metoder
PDAC prøver og SP analyse
Mellom 2008 og 2010, ble PDAC kirurgisk reseksjon prøver hentet fra 52 pasienter ved Universitetssykehuset Leuven (UZ Leuven, Belgia) etter skriftlig informert samtykke. Studien ble godkjent av UZ /KU Leuven Etisk Komité før rekruttering av pasienter, og mottok undersøkelsen nummer ML3452. Studien ble registrert på clinicaltrials.gov under nummeret NCT00936104. Etter reseksjon, ble tumorvev hakket i små stykker og inkubert med kollagenase type IV (1 mg /ml i medium 199; Invitrogen, Grand Island, NY) i 2-3 timer mens mekanisk dispergert i regelmessige 20-min tidspunkter. Den endelige cellesuspensjon ble filtrert gjennom et 40 um nylonnett (BD Biosciences, Erembodegem, Belgia), og celletallet og levedyktigheten bestemt. Levedyktigheten av cellene oppnådd etter dispergering av PDAC vev ble rutinemessig ~ 50% og utbyttet av 400 mm
3 ferskt oppnådde PDAC prøvene var ca. 3 x 10
6 levende celler.
SP analysen ble utført som beskrevet før
3. Celler ble inkubert med Hoechst33342 (Sigma-Aldrich, Bornem, Belgia) i løpet av 90 minutter ved en sluttkonsentrasjon på 5 ug /ml, og analysert ved hjelp av FACS (FACSVantage SE, utstyrt med FACS DIVA programvare, versjon 6.0, BD Biosciences). Lasere som ble brukt var: nær-UV (375 nm, 10 mW output), blå (488 nm, 13 mW) og gul-grønn (561 nm, 30 mW). Filtrene som ble brukt var: 450/40 for Hoechst blå; 630/22 og 610 LP for Hoechst rød; 530/30 og 520 LP for FITC; og 582/15 for PE. Propidiumjodid (2 ug /ml; Sigma-Aldrich) ble tilsatt for å merke ikke-levedyktige celler, med unntak av avfallet i Hoechst-blå og rød Hoechst-kanal. Dual-bølgelengde FACS analyse identifisert en sidegren av «Hoechst-lav «celler som SP, ytterligere verifisert av co-tilsette verapamil (100 mikrometer, Sigma-Aldrich) som resulterer i reduksjon av SP størrelse ved å blokkere fargestoff utstrømming gjennom multidrug transporter (s). Hoved befolkningen (MP) ble gated som mesteparten av «Hoechst-lyse» celler. For ytterligere karakterisering, ble PDAC celler immunostained for endothelial markør CD31 og blodkreft /immun markør CD45. Etter inkubasjon med Hoechst ble cellene løst i farging buffer (PBS + 2% FBS), og fluorescein (FITC) -merket anti-human CD31 og fykoerytrin (PE) -merket anti-human CD45-antistoffer ble tilsatt ved bruk av fortynninger anbefalt av produsenten (BD Biosciences). Både isotype (BD Biosciences) og positive kontroller ble utført. Andre stainings ble ikke gjort som disse kan hindre analyse av FACS utfallet.
Hel-genomet Expression analyse av microarray
25000 SP og 25000 MP celler (totalt eller utarmet fra CD45
+ /CD31
+ celler) ble sortert ved hjelp av FACS i kald lyserings oppløsning av RNeasy Micro Kit (Qiagen, Venlo, Nederland). Total RNA ble ekstrahert i henhold til produsentens instruksjoner. RNA konsentrasjon og renhet ble bestemt spektrofotometrisk ved bruk av Nanodrop ND-1000 system (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) og RNA integritet ble vurdert ved hjelp av en Bioanalyser 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Bare prøver med RNA Integrity Number (RIN) ≥7.5 ble brukt for videre microarray analyse på VIB Nucleomics Kjerne (www.nucleomics.be). RNA ble forsterket med Nugen Pico WTA kit (Nugen Technologies, Santa Carlos, CA) og deretter biotinylert. Den endelige Arna blanding var renset og fragmentert, og deretter hybridisert på Affymetrix HG U133 Plus 2,0 arrays (Affymetrix, Santa Clara, CA), etterfulgt av farging og vasking i en Genechip fluidics stasjon 450 (Affymetrix) i henhold til produsentens prosedyrer. For å måle rå sonde signalintensitet, chips ble skannet med en Genechip skanner 3000 (Affymetrix) og analysert med affy_1.26.0 pakken (Bioconductor, Seattle, WA).
Statistiske og Funksjonell analyse av mikroarray data
den rå microarray data ble normalisert i løpet av matriser og mellom arrays følge Robust multichip Average (RMA) prosedyre [13]. MAS 5.0 algoritmen (Microarray suite bruksanvisning, versjon 5, Affymetrix 2001) ble brukt for å vurdere deteksjon over bakgrunnen. Fra 54616 probe sett, 10 255 var under bakgrunn og utelatt fra videre analyse. Principal Component Analysis (PCA) ble gjort med pcurve pakken fra Bioconductor og brukes til å beregne de viktigste kildene til variasjon mellom prøvene. For komparativ analyse mellom SP og MP, ble data paret per pasient. Den limma pakken fra Bioconductor ble brukt for å vurdere kontrasten mellom SP og MP [14]. Statistisk signifikans av denne kontrasten ble testet med en moderert t-test (implementert i limma). Betydelig opp- eller nedregulert gener ble definert som gener med ≥2 ganger endring (log
2 SP /MP≥1 eller ≤-1), i kombinasjon med p 0,001. Klassiske ordninger for å justere for multippel testing kan føre til lav statistisk styrke for microarray studier. Den strenge cut-off av p 0,001 ble brukt som et alternativ, pragmatisk tilnærming for å balansere antall falske positive og falske negative [15]. Genuttrykk data er tilgjengelige fra Gene Expression Omnibus (GEO, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/geo/) gjennom serien sjonsnummer GSE42404. Funksjonell pathway analyse på alle signifikant forskjellig uttrykt probe sett var ferdig med oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) program (Oppfinnsomhet Systems, www.ingenuity.com, Redwood City, CA), bygget på oppfinnsomhet Knowledge Base, et manuelt kuratert litteraturdatabase. Alle probe sett med en korrigert p-verdi 0,001 og en fold endring av 2 eller -2 ble brukt som input. I tilfelle av flere sonder referert til det samme genet, ble den gjennomsnittlige log
2-forhold på settet av inngangsverdier for dette gen tatt for videre analyse. Genererte nettverk ble bestilt av en poengsum betyr betydning, beregnet som forholdet mellom det antall inngangs sonder som er tilordnet den veien dividert med det totale antall spredningsveier prober. Betydningen av biologiske funksjoner og kanoniske banene ble testet ved hjelp av Fishers eksakte test p-verdi etter påføring av Benjamini-Hochberg fremgangsmåte for multippel testing korreksjon. Pathways ble betraktet som signifikant når p 0,05. Ytterligere identifikasjon av biologiske funksjoner (Gene Ontologi, GO) og KEGG (Kyoto Encyclopedia of gener og genomer) trasé ble utført ved hjelp av databasen for kommentering, visualisering og integrert Discovery (DAVID, versjon 6.7, http: //www.david.abcc. ncifcrf.org). For denne analysen, setter sonde med en korrigert p-verdi 0,001 og a 2,0 ganger endring ble brukt som input. Den enkle poeng, en modifisert Fishers eksakte p-verdi test, ble brukt til å justere for multippel testing.
Utvikling av en Gene Signatur
En overvåket læringsstrategi ble brukt på microarray data av CD45
– /CD31
– SP og MP populasjoner (dvs. den rensede SP eller PSP, og PMP). En liste over 200 gener av interesse var sammensatt basert på en grundig litteraturstudie ved hjelp av følgende vilkår: «bukspyttkjertelkreft», «kreftstamcelle», «side befolkning», «kanoniske veier», «stemness gener», «epitelial mesenchymale overgang (EMT) «,» multiresistens «,» onkogener «og» polycomb gener «. De forhåndsbehandlet Dataene ble begrenset til 512-probe-sett (195 gener) som hadde genet symboler i listen over 200 gener som er av interesse. I alt ble 29 ulike klassifiserings tilnærminger brukes, som representerer ulike kombinasjoner av 5 klassifiseringsmodeller, 3 moduser av funksjonsvalg og 3 ranking metoder [16]. Evaluering av disse metodene ble gjort ved hjelp av leave-one-out-kryssvalidering (LOOCV) for å lage en mottaker drift karakteristikk (ROC) kurve [17]. De univariate funksjon seleksjonsmetoder viste seg å ha noen ekstra verdi siden den optimale tilnærmingen med høyest arealet under ROC-kurven (AUC) og lavest balansert feilrate (BER) besto av en støtte vektor maskin uten forutgående trekk vurdering eller utvalg (data ikke vist ). For ytterligere å redusere gensignaturen brukte vi PINTA strategi for genet kandidat prioritering [18]. Ved å se på differensial ekspresjon av det området av et gen i et genom-wide protein-protein interaksjon nettverk, PINTA strategien utfører effektivt multivariat funksjonsvalg ved inkorporering av tidligere kunnskap om molekylærbiologi. En gruppe på 32 gener ble tildelt som viktig, og sondesett med det høyeste uttrykk nivå ble valgt. Endelig PINTA signaturen ble ytterligere redusert til de 10 gener med den største ganger endring (opp eller ned).
prediktiv verdi av 32-genet og den reduserte 10-genet signaturen ble validert med LOOCV på forskjellig SP
versus
MP datasett.
NCounter Analyse
Mellom 2006 og 2010 ble vevsprøver samlet, etter informert samtykke fra pasienter som gjennomgikk pankreas reseksjon for PDAC. Prøvene ble lagret ved -80 ° C i RNAlater (Qiagen). Fra den primære svulsten av 143 pasienter og fra omkringliggende ikke-tumoral bukspyttkjertel (kontroll) vev av 14 pasienter, ble total RNA ekstrahert ved bruk av RNeasy Mini Kit (Qiagen) ifølge produsentens instruksjoner. Bare prøver med et RNA integritet nummer (RIN) av 7.0 ble brukt for videre analyse, dvs. 78 PDAC prøver (mann /kvinne ratio: 41/37, alder: 32-80 år med median på 64 år) og 6 kontroll vev (mann /kvinne ratio: 4/2, alder: 51-66 år med median på 63 år). Tumor egenskaper og prognostiske funksjoner (med en oppfølging til juli 2011) av de 78 pasientene er gitt (se tabell S1). Bruke NCounter system (Nanostring Technologies, Seattle, Washington), ble uttrykk nivåer av de ovenfor definerte signatur gener kvantifisert i bukspyttkjertelen tumor
versus
omkringliggende vev (VIB Nucleomics Core) [19].
ABCB1 immunohistokjemi i PDAC Reseksjon prøver
for å analysere uttrykket av ABCB1 protein ved immunhistokjemi, ble 5-mikrometer seksjoner preparert fra formalinfiksert parafin-embedded PDAC eksemplarer av de 11 pasientene som PSP og PMP RNA ble brukt for microarray analyse. Etter deparaffinization og rehydrering av lysbildene, ble målet gjenfinning gjort med seg FLEX Target Retrieval Solution (Dako, Glostrup, Danmark) i løpet av 20 min. Endogen peroksidaseaktivitet ble blokkert ved hjelp av EnVision Peroxidase-Blocking reagens (Dako) i 5 minutter. Seksjoner ble inkubert med primært antistoff (anti-human ABCB1 fra Monosan, Uden, Nederland) ved anbefalt fortynning (1/20) i 30 minutter ved romtemperatur. Deretter ble slides behandlet ved hjelp Envision Dual Link (Dako). Komplekset ble visualisert med DAB (3,3′-diaminobenzidin; Dako) etterfulgt av en hematoxylin (Dako) kontra. Bildene ble tatt med en Leica DC 300 kameraet på en Leica DMLB mikroskop
Statistical Analysis
SAS statistisk programvare (versjon 9.1, SAS Institute, Cary, NC). Ble brukt for alle statistiske analyser. En p-verdi 0,05 ble ansett som statistisk signifikant. Sykdomsfri overlevelse (DFS) og total overlevelse (OS) ble beregnet ved hjelp av Kaplan-Meier-metoden (tabell S1). For å teste prognostisk verdi av gener, univariat analyse for DFS og OS ble utført ved anvendelse av Cox regresjon med og uten begrensede kubiske spline (RCS), etterfulgt av multivariat analyse for OS ved hjelp av Cox regresjon. En valgte modellen ble brukt for analyse uavhengig av variabler allerede korrelerte med overlevelse (ECLNI, kjønn, PM og PT, se tabell S1).
Resultater
Menneskebukspyttkjertelkreft Inneholder en Side Befolknings
Humant PDAC reseksjon prøver ble analysert for tilstedeværelse av en side populasjon (SP). I alle undersøkte prøvene (n = 52), var en SP identifisert som representerer mellom 0,2 og 21,5% (median: 1,8%). Av den totale PDAC celler (Fig. 1A)
A) Dot tomt på to- bølgelengde FACS analyse av ferske humane PDAC celler etter inkubasjon med Hoechst33342 viser en hale av «Hoechst-lav» celler (SP), i forhold til en større bulk av «Hoechst-lyse enes celler, hoved befolkningen (MP) (
igjen panel
). Et representativt eksempel er vist og SP-andelen er angitt. PI
POS (døde) celler ble ekskludert fra analyse for Hoechst33342, CD45 og CD31 merking. Den boxplot (
innfelt
) oppsummerer SP andeler av de 52 PDAC analyserte prøvene. Verapamil blokker Hoechst utstrømning, og dermed redusere SP størrelse og bekrefter SP fenotype (
panel midt
). B) FACS prikkplott av PDAC SP, immunostained for CD45 og CD31. Et representativt eksempel er vist. Tallene angir andelen av CD45
+, CD31
+ og CD45
– /CD31
– celler i SP. C) Principal Component Analysis (PCA) av hele genomet uttrykk profiler fra CD45
– /CD31
– SP (PSP,
rød
) og CD45
– /CD31
– MP (PMP,
blå
) (n = 11). D) Immunhistokjemisk farging av ABCB1 i PDAC reseksjon prøver (n = 11). Et representativt eksempel (4% SP i FACS-analyse) er vist. Original forstørrelse: x200 (
venstre
) og X400 (
høyre
)
SP og «hoved befolkningens (MP) celler (se figur 1A for.. gating) ble sortert ved hjelp av FACS og utsatt for hel-genomet ekspresjonsanalyse (n = 10 PDAC). Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) avslørte i SP gener og stier knyttet til immunologiske prosesser, slik som T-hjelpecelledifferensiering «,» Kommunikasjon mellom medfødte og ervervede immunceller «og» Dendritic cellemodning «(data ikke vist). Immun-type celler, så vel som endotelceller, er kjent for å ko-segregere ved varierende grad i SP av vev og tumorer. Derfor, analyserte vi det humane SP PDAC ved strømningscytometri for ekspresjon av immun /hematopoetiske markør CD45 og CD31 endotel-markør. Omtrent 60% av SP-cellene er CD45
+ (middelverdi: 61,4%, Område: 19,5 til 75,4%; n = 18), mens bare et lite antall av SP-celler er CD31
+ (median: 0,7%, område~~POS=HEADCOMP: 0,2 til 2,1%, n = 15) (figur 1 B).. CD45
+ og CD31
+ celler ble også observert i MP på sammenlignbare nivåer (median 63,7% og 1,6%, og spenner: 41,1 til 75,4% og 0,1 til 6,7%, henholdsvis). For senere analyser, ble SP og MP utarmet fra CD45
+ og CD31
+ celler.
Den Renset PDAC SP Viser Uttrykk for CSC-forbundet Gener
Vi sortert CD45
– /CD31
– SP og CD45
– /CD31
– MP celler (videre referert til som renset SP eller PSP, og renset MP eller PMP, henholdsvis) fra 11 PDAC prøver og igjen utført hel-genom uttrykk profilering. Principal Component Analysis (PCA) viser at PSP klyngen og skille fra pmps (fig 1c).
Av de 1861 sondesett som er forskjellig uttrykt (≥2-fold, p 0,001)., 993 er oppregulert i PSP og 868 er nedregulert (se GEO, tiltredelse antall GSE42404). Den multidrug transporter
ABCB1 product: (
MDR1
,
P-glykoprotein
) er sterkt oppregulert i PSP
versus
PMP (fold: 5.3, p 0,001), og blir eventuelt underliggende SP-fenotype. Immunhistokjemisk analyse bekreftet ABCB1 ekspresjon i PDAC tumorcellene, hovedsakelig lokalisert i den apikale overflate av cellene (n = 11 PDAC prøver, Fig. 1D).
ABCG2
, en annen transportør som kan megle SP utstrømming, er ikke uttrykt forskjellig (p 0,5), men microarray signalet var generelt lav, og ikke over bakgrunn i halvparten av prøvene. Interessant, tidligere beskrevet bukspyttkjertelen CSC markører (inkludert
CD44, CD133 Hotell og
CXCR4
) er betydelig overuttrykt i PSP (tabell S2). I tillegg andre (kreft) «stemness gener (for eksempel
LGR4, SOX9, KLF5 Hotell og
MET
) er også oppregulert i PSP.
Av alle forskjellig uttrykt probe sett, 1690 kan bli kartlagt til gener i oppfinnsomhet Knowledge Base og ble utsatt for IPA (tabell S3). Nettverkene mest oppregulert i PSP er «Amino acid metabolism» (som inkluderer
HNF4A
eller «hepatocytter nukleær faktor 4 alpha «, fold: 2,7, p 0,001),» Cell-til-celle signalisering» ( som inkluderer
TJP2
eller «Tight krysset protein 2», fold: 2.4, p 0,001) og «Cellular vekst og spredning» (som inkluderer
EPHA2
eller «Efrin reseptor A2», brett : 2,1, p 0,001; og
EPHA4
, fold. 2.6, p 0,001)
Biologiske funksjoner beriket i PSP
versus
PMP omfatte «Cellular bevegelse «,» celle-til-celle-signalisering og interaksjon «,» Cellular vekst og proliferasjon «,» utvikling av embryo «,» Tumor morfologi «og» Cancer «(tabell S3). For å skille mellom PSP og PMP-tilknyttede biologiske funksjoner i mer detalj, ble DAVID analyse anvendt. Klynger relatert til «Cell-celle krysset «(Enrichment Score eller ES 6.8),» Protein kinase aktivitet «(ES: 3,4),» utvikling «(ES: 3,0),» Mitogen aktivert (MAP) kinase aktivitet» (ES: 1.8), «Intesignale» (ES: 1,6) og forskrift av apoptose «(ES: er 1,4) anriket i PSP
Canonical trasé, basert på forskjellig uttrykte gener, ble også analysert ved hjelp av IPA.. Et antall 46 kanoniske trasé nådd betydelige SP berikelse cut-off av p 0,05, inkludert «human embryonal stamcelle pluripotency «,» tight junction signalering», «NF-kB signale «,» Wnt /β-catenin signale « «Intesignalering «og» Efrin signale» (tabell S3). Ytterligere detaljert analyse ved hjelp DAVID (KEGG pathways) viste oppregulering av «ErbB signalveien «(inkludert
ErbB3
, fold: 2.1, p 0,001). I PSP
Gene Signaturer som diskriminerer den PDAC psp fra PMP
Ved hjelp av en veiledet læringsstrategi anvendt på hel-genom uttrykk data fra 11 CD45
– /CD31
– PSP og PMP parene som analyseres ovenfor, har vi utviklet en satt av 512 probe sett (195 gener) som potensielle «PSP gen signatur». Nøyaktigheten til å diskriminere mellom PSP og PMP bruke denne signaturen ble 95% i opplæringen kohorten, som evalueres med LOOCV (se Materialer og metoder).
Ved hjelp PINTA (se Materialer og metoder), denne store PSP genet signatur ble redusert til 32 gener, hvorav 19 er oppregulert og 13 nedregulert (tabell S4). Validering av dette redusert PSP genet signatur i det opprinnelige datasettet (n = 11 PDAC prøver) viste en 91% klassifisering nøyaktighet på PSP og PMP, kan sammenlignes med prediksjon ved hjelp av 195-genet signatur. Innenfor 32-genet signatur, inkluderer gener oppregulert i PSP tidligere foreslått bukspyttkjertelen CSC markører (
CXCR4
,
CD133
) eller spille en rolle i multiresistens (
ABCB1
) og i trasé viktige i tumorigenesis og tumorprogresjon (se tabell S4).
til slutt, vi ytterligere snevret genet signatur til de 10 genene med største kaste opp- eller nedregulering (tabell S4, med fet skrift). Nøyaktigheten av denne kondensert gen signatur å skille PSP fra PMP (90%) er sammenlignbar med den diskriminerende kraften i 32-genet sett.
Som en ultimate test av den diskriminerende verdien av 32- og 10- gen signaturer, søkte vi begge settene til en ekstra, uavhengig serie på 10 SP /MP parene bruker LOOCV. Begge gen signaturer presenteres en diskriminerende nøyaktighet mellom SP og MP på 85%.
prognostisk verdi av ABCB1 og CXCR4
For å undersøke hvorvidt gener av PSP (32- og 10-) gen signaturer ha prognostisk verdi, ekspresjonsnivåer ble først bestemt i en uavhengig serie av pasienter (n = 78; tabell S1) i tumor
versus
omgivende vev ved hjelp av NCounter analyse (se Materialer og Metoder), og deretter underkastet univariat analyse for potensiell sammenheng med prognose /overlevelse. Først blir signatur gener overuttrykt i PSP relatert til prognose mens ingen korrelasjon ble funnet med signatur gener nedregulert i PSP (data ikke vist). Videre oppregulering av
ABCB1 Hotell og
CXCR4
er signifikant korrelert med dårligere prognose, dvs. med lavest OS og DFS (tabell S5). Multivariat analyse ble deretter utført på gener med p 0,1 i univariat analyse (
ABCB1
,
ADAM10
,
CDH1
,
CXCR4
,
ESRP1
,
MMP1
,
RAB25
,
ST14
), som betegner
ABCB1
som en uavhengig prediktor for dårlig OS (tabell S5) .
Diskusjoner
i denne studien identifiserte vi en SP i menneskelig kreft i bukspyttkjertelen. Så vidt vi vet, er dette den første rapporten som beskriver tilstedeværelsen av en SP i PDAC analysert fra pasienter. Som i andre vev og svulster, inneholder PDAC SP en brøkdel av CD31
+ endotelceller og CD45
+ immunceller [20]. I denne studien har vi fokusert på ikke-endotelial, ikke-immune SP (PSP) og gransket sin genuttrykk profil. PSP representerer hovedsakelig tumor epitelceller gitt den høye uttrykk for
CDH1
,
EpCAM, TJP1 Hotell og
TJP2 product: [21]. I denne PDAC PSP har vi funnet oppregulering av multidrug transporter
ABCB1
, som kan være ansvarlig for chemoresistance av disse cellene. Immunfarging bekreftet tilstedeværelsen av ABCB1 i PDAC, hovedsakelig lokalisert i den apikale overflate av tumorcellene hvor aktiv medikamenttransport kan forekomme. Oppregulering av apoptose regulerende faktorer (
Bcl2L11, etter fold: 2,9, p 0,001;
EPHA2
, se resultater) i PDAC PSP kan videre støtte sin kjemoresistent karakter. Vi har nylig vist at SP er svært motstandsdyktig mot gemcitabin i en musemodell, hvor PDAC ble dyrket som xenotransplantater [12]. Motstand fra SP til gemcitabin har også blitt rapportert i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer
in vitro product: [8], [9], [11]. Til sammen vises SP til å representere en kjemoresistent undergruppe av bukspyttkjertelen svulst, og kan dermed være en av gjerningsmennene for behandlingssvikt og kreft tilbakefall.
I flere typer kreft, er SP beriket for kandidat CSC [7], [22]. Vi fant ut at markører nylig identifisert i antatte CSC bestander av menneskelig kreft i bukspyttkjertelen, er oppregulert i PDAC PSP. I tillegg har vi oppdaget noen andre «kreft stemness» markører (f.eks
LGR4, SOX9, KLF5, MET
) samt bukspyttkjertelen embryogenesen relaterte faktorer som kan gjenopptas i CSC (f.eks
HNF4A
) [5], [6], [23] – [26]. Videre
i silico
funksjonell analyse av uttrykket data belyser forekomsten av veier av embryoutvikling og embryonale stamceller pluripotency i PDAC SP, ytterligere støtte sin «stemness «. Også i bukspyttkjertelen kreft cellelinjer, dukket SP beriket i CSC [9] – [11]. Likevel er det klart at flere bevis er nødvendig for å endelig vise CSC fenotype av PSP, inkludert tumorigent aktivitet
in vitro plakater (sfære dannelse) og
in vivo plakater (tumorvekst i immunsvikt mus ).
PDAC PSP kan representere en interessant terapeutisk mål gitt sin chemoresistance- og CSC-assosiert karakter. PSP celler uttrykker høye nivåer av
CXCR4, etter som ved aktivering, kan stimulere cellene til å flytte eller å gjennomgå «epitelial-mesenchymale overgang» (EMT), en prosess kjører kreft progresjon og malignitet. I bukspyttkjertelkreft cellelinjer, kan SP faktisk aktiveres mot EMT når de behandles med TGFB [21]. I PDAC PSP, observerte vi oppregulering av
SMAD3
, kjent for å megle TGFB signalering. Videre interessant,
CXCL12
, liganden av CXCR4, er sterkt uttrykt i det omgivende pankreasvevet av PDAC tumor (data ikke vist), og kan lokke celler ut av tumoren for invasjon eller ytterligere spredning. Analogt har CXCR4 uttrykk blitt funnet å karakterisere en underpopulasjon av CD133
+ pankreatisk CSC som synes å være reponsible for metastasen av svulst [6], [27].
Oppregulering av
EPHA2 Hotell og
EPHA4
i PSP er i tråd med en viktig rolle Efrin signalveien i PDAC patogenesen. Ekspresjon av EPHA2 i PDAC har blitt assosiert med øket invasive og metastatisk evne og dårlig overlevelse [28]. Knockdown av EPHA4 uttrykk synker PDAC celleviabilitet [29]. I tillegg fant vi at ErbB signalveien er oppregulert i PSP (KEGG analyse), inkludert høyere uttrykk av
ErbB3
. Den ErbB3 reseptoren spiller en avgjørende rolle i bukspyttkjertelen utvikling samt i bukspyttkjertelen tumorigenesis. Overekspresjon av
ErbB3
korrelerer med avansert PDAC scenen og redusert total overlevelse, og nylig har sin rolle som potent formidler av PI3K signale blitt fremhevet [30], [31]. Videre kan aktivering av ErbB3 være avgjørende i motstanden til mono EGFR-inhibering. Spesielt hemme ErbB3 aktivitet (f.eks med MM-121) vises lovende
in vitro, etter og dermed kan også ha klinisk potensial [31]. Både Efrin og ErbB signalveier kan utgjøre potensielle terapeutiske mål i PDAC. Det bør bemerkes at vår studie ikke undersøke den prognostiske verdien av
EPHA2 Hotell og
ErbB3
siden disse genene ble ikke inkludert i PSP signaturer vurdert opp mot overlevelse.
utviklede PSP gen signaturer tillitsfullt diskriminere PSP fra PMP. Noen av oppregulert gener er knyttet til CSC /’kreft stemness «som for eksempel
CXCR4, CD133, EpCAM Hotell og
SOX9 product: [5], [6], [24], mens andre er assosiert med apoptose (
FASLG, TJP2, DUSP4
), MAPK pathway (
MAP2K4, DUSP4
), og chemoresistance (
MMP1
, en
ETS1
målgenet) [32], [33]. I tillegg inneholder signaturen gener relatert til økt motilitet og invasjon (
ADAM10, RAB25, DUSP4, CXCR4
). Også noen av disse genene kan representere lovende mål.
Til slutt, vi evaluert den prognostiske betydningen av gener som inngår i PSP signaturer.
CXCR4 Hotell og
ABCB1
er negativt relatert til overlevelse etter kurativ reseksjon, som også finnes i andre rapporter [34], [35].
