Abstract
Mål
For å screene og karakter germline varianter for E-cadherin
(CDH1)
i ikke-arvelig magekreft (GC) pasienter og hos pasienter på risikoen for GC.
Metoder
59 GCer, 59 første grad slektninger (FDRs) av GC, 20 autoimmune metaplastiske atrofisk gastritt (AMAGs) og 52 blodgivere (BDS) ble analysert for
CDH1
ved direkte sekvensering, strukturell modellering og bioinformatikk. Funksjonell innvirkning på spleising ble vurdert for intronic mutasjoner. E-cadherin /β-catenin immunhistokjemisk farging og E-cadherin mRNA kvantifisering ved hjelp av RT-PCR ble utført
Resultater
I GCer, 4 missense varianter (p.G274S,. P.A298T; p.T470I; p.A592T), en mutasjon i 5’UTR (-71C G) og en mutasjon i intronic IVS12 (c.1937-13T C) region ble funnet. Først patogene effekten av p.A298T mutasjon ble spådd av protein 3D-modellering. Den nye p.G274S mutasjon viste en ingen klar funksjonell betydning. Videre først, intronic IVS12 (c.1937-13T C) mutasjon ble vist å føre til en avvikende
CDH1
karakterutskrift med exon 11 sletting. Denne mutasjonen ble funnet i 2 GCer og i en BD. I FDRs identifiserte vi 4 varianter: den polymorfe (p.A592T) og 3 mutasjoner i uoversatt regioner med uidentifiserte funksjonell rolle bortsett fra 5’UTR (-54G C) som hadde blitt funnet å redusere
CDH1
transkripsjon. I AMAGs, vi har oppdaget 2 endringer: en missense (p.A592T) og en roman variant (IVS1 (c.48 + 7C T)) uten effekt på
CDH1
spleising. Flere tause og polymorfe erstatninger ble funnet i alle de gruppene som er undersøkt.
Konklusjoner
Totalt vår studie bedrer på den aktuelle karakterisering av
CDH1
mutasjoner og deres funksjonelle rolle i GC og hos personer med risiko for GC. Mutasjoner som finnes i uoversatt regioner og data på spleise effekter fortjener en spesiell oppmerksomhet som assosiert med en redusert E-cadherin beløp. Nytten av
CDH1
screening, i tillegg til identifisering av andre risikofaktorer, kan være nyttig for tidlig deteksjon av GC i fag på risiko (dvs. FDRs og AMAGs), og garanterer videre studier.
Citation: Garziera M, Canzonieri V, Cannizzaro R, Geremia S, Caggiari L, De Zorzi M, et al. (2013) Identifisering og karakterisering av
CDH1
kimcellelinje Varianter i Sporadiske magekreft pasienter og personer som er utsatt for magekreft. PLoS ONE 8 (10): e77035. doi: 10,1371 /journal.pone.0077035
Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA
mottatt: 29 april 2013; Godkjent: 05.09.2013; Publisert: 29 oktober 2013
Copyright: © 2013 Garziera et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC De Re N. 10266 og AIRC Cannizzaro spesialprogram Molecular Clinical Oncology 5×1000 N. 12214), og Direzione Centrale del Lavoro, Formazione, Università e Ricerca Della Regione Autonoma Friuli Venezia Giulia, Codice Progetto 200502027001. De finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:. Dr. Valli de Re erklærer at han er medforfatter og redaksjonelle styremedlem i PLoS EN. Dette endrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikk på deling av data og materialer.
Innledning
Magekreft (GC) er fortsatt den fjerde vanligste kreftformen i verden, selv om dens forekomst og tilhørende dødelighet har gått ned de siste tiårene. GC prognose er nært knyttet til det stadium av sykdommen ved diagnose [1]. Tidlig debut magekreft (EOGC) er definert som GC presentere i en alder av 45 år eller yngre [2] og har en dårlig total overlevelse [3], [4]. De fleste GCer er sporadisk og ofte utvikle følgende
Helicobacter pylori plakater (HP) -associated gastritt [5], [6]. Men familiære aggregering studier understreker også viktigheten av en genetisk predisposisjon i sporadisk utvikling av GC. Frekvens av familiær mage aggregering er ca 10%
Den mest aksepterte GC histopatologisk klassifisering (Lauren klassifikasjon) [7] skiller mellom to typer GC:. Intestinal type og diffuse typen. Diffuse GC viser en større arvelig basis og et generelt dårligere prognose sammenlignet med tarm subtype [8].
CDH1
genet som koder for E-cadherin har blitt identifisert til å ha en utløsende rolle i ca 30% -50% av arvelig diffuse GC (HDGC), en autosomal dominant GC og lobular brystkreft mottakelighet syndrom utgjør 1-3% av familiær opphopning av GCer [9], [10] og i diffuse GC subtype [11] .
CDH1
germline mutasjoner (slik mutasjon er gått på hver celle i avkom kropp) er spesifikt knyttet HDGC (ca 30% -40% av tilfellene); stor
CDH1
slettinger har blitt funnet i ca 6,5% av tilfellene [12]. Familiær intestinal magekreft (FIGC) med en positiv familiehistorie er også beskrevet, men så langt ingen kimcellelinje
CDH1
defekter har vært forbundet med FIGC eller tarm GCer. Denne mangel på bevis på
CDH1
mutasjoner i intestinal-subtypen har ført til hypotesen om at familiære clustering i disse tilfellene er bestemt av delte miljømessige faktorer, i motsetning til en arvelig genetisk disposisjon. Men nyere data viser at
CDH1
somatiske endringer (idet slike endringer akkumuleres i kreftcellene i kroppen i løpet av en persons levetid) er som hyppig i tarm som i diffust GC [13], hvilket antyder en viktig rolle
CDH1
i både histotypes. Likevel,
CDH1
germline endringer i tarm GCer er den nøyaktige utbredelsen av fortsatt ukjent.
CDH1
promoter hypermethylation er den vanligste andre genetiske hit i GC kreftfremkallende prosessen [14], [15].
CDH1
mutasjoner er også forbundet med økt mottakelighet for invasiv og metastatisk [16], [17] tykktarm, blære, prostata, bryst og gynekologisk kreft [18] – [20]. E-cadherin er et transmembran-glykoprotein som spiller en rolle i å opprettholde epitelvev arkitektur ved å involvere Ca
2+ avhengige celle-celle-interaksjoner [21], [22]. E-cadherin omfatter en cytoplasmaområde, en kort transmembrane domene og fem ekstracellulære gjenta cadherin-lignende domener (EC1-5) som spenner eksoner 4-13 og inneholder svært konservert kalsiumbindende regioner [23], [24] og konserverte cysteiner sannsynlige å danne disulfidbroer [25]
i denne studien analyserte vi
CDH1
germline mutasjoner i en sammenhengende rekke av tilfeldige GC saker og personer med risiko for GC.; hovedsakelig første grads GC-slektninger (FDRs) og autoimmune metaplastiske atrofisk gastritt (AMAG) pasienter videre til vårt institutt for gastrointestinale symptomer og endoskopisk evaluering. For å undersøke hvilken rolle E-cadherin uttrykk, strukturelle, funksjonelle og immunhistokjemiske analyser ble utført i prøver med en
CDH1
germline mutasjon. Målet med denne studien var å evaluere utbredelsen og karakter
CDH1
germline mutasjoner i en sammenhengende rekke av sporadiske GC pasienter mangler kriteriene HDGC klassifisering, og i en valgt befolkning står i fare for GC utvikling, for å teste sin nytteverdi som en markør for å forbedre tidlig svulst deteksjon. Data innhentet kan brukes til å utvikle et verktøy som raskt og billig oppdager
CDH1
mutasjoner hovedsakelig til stede i vår befolkning.
Resultater
Pasient karakterisering og
CDH1
kimcellelinje genetisk screening
Kliniske og histopatologiske funksjoner i GC, FDR og AMAG fag er oppsummert i tabell 1 og 2. Blant de 59 GC pasienter, 2 (3,4%) har en familiehistorie med GC (S15 er den bror av S16) uten å møte kriteriene for arvelig diffuse GC, som definert av International Gastric Cancer Heis Consortium (IGCLC) på tidspunktet for prøvetaking. I vår GC-serien, 5 sporadiske tidlig GC pasienter (≤45 år) var til stede, men ingen
CDH1
endringer ble funnet hos disse pasientene. Median alder for de FDRs var 49 år (fra 28-78 år) og for AMAGs 56 år (range, 31-72 år). Blant de 59 GC pasienter, 16 fagene hadde førstegradsslektning inkludert i studien (16/59 FDRs). FDRs og AMAGs kom til vår institusjon for en gastroenterologi besøk og gastroskopi eksamen, manifestert de ulike symptomer, men verken kreft eller intestinal metaplasi /dysplasi var til stede i disse fagene.
CDH1
genetiske screening resultater er oppført i tabell 3 med
nye
mutasjoner: 1 intronic (ID 5), en missense (ID 10), og to tause (ID 13 og ID18). Totalt fant vi 4 varianter, som koder for en aminosyre (AA) substitusjon (en roman (ID10) og tre tidligere rapportert i andre populasjoner (ID 11, ID 12, ID 15), en i 5’near genet regionen og 2 mutasjoner i uoversatt (UTR) regulerende element (ID 1, ID 3, allerede rapportert) og 6 erstatninger i intronic regioner (tre mutasjoner: Identifikasjons 5, ID 9, ID 17, tre intronic polymorfe varianter: Identifikasjons 4, ID-6, ID 8, sannsynligvis uten effekt på GC cancerogenesis). Ingen slettinger eller innsett ble funnet i ekson grenser.
Andre endringer ført vanlige polymorfismer (frekvens på minst 1% i befolkningen) eller stille mutasjoner som koder for samme aminosyre enn den opprinnelige tråden. Ingen statistisk sammenheng ble observert blant de fire grupper av pasienter testet for ID 4, ID 6 eller ID 19 varianter.
RefSNP (rs) tall for å identifisere genetiske varianter tidligere utgitt samt deres rapportert frekvens (NIEHS Miljø Genome Project, Seattle, WA (URL: https://evs.gs.washington.edu/niehsExome/Nås august 2013); ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/phase1/analysis_results/paper/Nås desember 2012) er rapportert i tabell 3.
Alle
CDH1
varianter var i heterozygot tilstand med unntak av 4-ID og ID 19 hvori en homozygot tilstand ble også påvist.
Frekvens av mutasjoner og varianter ble beregnet i individer uten GC eller AMAG sykdom (52BDs + 59FDRs, n = 111). Seksten FDRs var førstegradsslektninger til vår GC-serien; når en av varianten var til stede i GC, og dens tilhørende FDR tilfelle utelukket vi FDR individet fra beregningen frekvens. ID4 for eksempel, var til stede i 5 FDRs knyttet til vår GC for vår familie; derfor kontrollpopulasjon frekvens endres fra totalt 111 til 106 individer (7FDRs + 8BDs /106; 14,5%). Figur 1 viser sekvense kromatogrammene av de nye mutasjonene vi har funnet. Vi har tidligere rapportert ID 10 kromatogrammet i en annen artikkel [26]
(A) ID 5, ny intronic mutasjon nær ekson 1 (IVS1 c.48 + 7C T). Funnet i en pasient påvirket av AMAG (S121). (B) ID 13, stille mutasjon (c.1416C T) med konservert Ala rest i posisjon 472 i
CDH1
ekson 10 (p.T472T) funnet i en GC (S4). (C) ID 18, den stille mutasjon (c.2073C T) med konservert Ala rest i posisjon 691 i
CDH1
ekson 13 (p.A691A) funnet i en GC (S48)
bioinformatiske prediktiv rolle og strukturell modellering resultatene av missense varianter funnet
de missense muterte rester vi fant er alle lokalisert til E-cadherin ekstracellulære domene. Den kodon posisjon i umodne og modne (etter N-terminale cleavage) proteiner og data fra PolyPhen-2 og sile
i silico
analysene er rapportert i tabell 4. Alle fire missense varianter er potensielt skadelig ved PolyPhen -2, men bare den p.A298T (ID 11) og p.A592T (ID 15) substitusjon kan påvirke protein funksjon av SIFT analyse (tabell 4). De p.G274S (ID 10) som vi nylig beskrevet [26], imidlertid ikke forstyrre det lokale miljøet, men introduserer et potensielt rest for fosforylering og glykosylering som kan ha mulige effekter på stabiliteten og integriteten av E-cadherin som vi hypotese [26]. Den patogenetisk Effekten av ID 11 substitusjon ble tidligere etablert [27], men er her for første gang påvist av strukturanalyse. Som vist i figur 2A, er AA endringen i exon 7 av p.A298T (ID 11) posisjonert i nærheten av det interaktive området mellom protomere EC1 og EC2. Således kan alanin-treonin polar rest substitusjon drive H-bindingsdannelse gjennom sin oxydrilic gruppe, og dette kan forstyrre den lokale struktur av proteinet i en region som er grunnleggende for Ca
2 + interaksjoner. Treonin i posisjon 144 er sterisk demonstrert påtrengende fordi den samhandler med to asparaginsyrerester (Asp136 og Asp 138) som er direkte involvert i Ca
2 + bindende. Videre er bindingslengdene spesielt stresset, blir mindre enn 3 Å (figur 2B)
I A-B PyMOL og Kvakk programvare representasjoner av EC1-EC2 protomere basert på menneskelig sekvens. (PDB kode: 2O72); i C-F, EC3 og EC4 protomere basert på murine E-cadherin (PDB kode: 3Q2W) av Kvakk programvare. (A) Cartoon representasjon høydepunkter A144 (
gul
) stilling: A144 er i nærheten av kalsium nettsider (
lilla
) og i nærhet av dimerization grensesnittet mellom EC1 (
blå
) -EC2 (
grønn
) domener. (B) Structural representasjon av A144T substitusjon i EC2 domene. Plassering av AT144 er profilert i gult. Treonin i posisjon 144 er ganske dramatisk for lokal struktur fordi den samhandler med to asparaginsyre rester (
grønn
) direkte involvert i kalsium områder, og disse bindingslengdene er spesielt stresset blir mindre enn 3 Å. (C) Den T316 (
gul
) er
O
-glycosilated (
blå
) og tilstede på overflaten av EC3 domene. (D) Den hydrofobe sidekjede I316 (
gul
) kan ikke være
O
-glycosilated og fremmer protein-protein interaksjoner. (E) Den methylenic sidekjede av A438 (
gul
) tillater konformasjonell frihet på overflaten av EC4 domene. (F) T438 (
gul
) substitusjon er ikke dramatisk for lokal struktur, men det kan representere et potensielt område for post-translasjonelle modifikasjoner. Kalsiumioner er uthevet (
grønn
).
I forhold til de resterende to missense mutasjoner, de har en mindre klar funksjonell effekt som også gjengitt i tabell 4. p .T470I (ID 12) substitusjon [28] for å endre AA overflaten av extradomain EC3 i det modne protein (figur 2C). I både muse-E-cadherin og N-cadherin sekvens (PDB-kode: 3Q2W) treonin er vanligvis funnet
O
-glycosylated antyder en viktig rolle for denne rest i strukturen til proteinet. Imidlertid, som vist i figur 2D, endringen til isoleucin, en ikke-polar AA med en hydrofob sidekjede som ikke kan gjennomgå post-translasjonell modifikasjon, antyder ingen bestemt intermolekylær spenning. Vi hypotese at i det ekstracellulære medium, i nærvær av en isoleucinrest i samme posisjon enn treonin kan favorisere protein-protein interaksjoner, og denne mutasjonen kan således anta en beskyttende betydning. Den siste mutasjon rapportert, p.A592T (ID 15) ble funnet i alle gruppene som ble testet (se tabell 3), noe som tyder på en sannsynlig effekt på GC patogenesen. I dette tilfellet, alanin på den extradomain EC4 av det modne E-cadherin (figur 2E) tilveiebringer konformasjonell frihet, selv når den er i nærhet av Ca
2 + bindingsseter. En treonin substitusjon her har en begrenset effekt på den lokale struktur og vridningsvinkler av proteinet. Men vi kan ikke utelukke at oxydrilic sidekjeden kan være post-translasjonell modifisert i spesielle situasjon og dermed påvirke strukturen og funksjonen til
CDH1 plakater (figur 2F).
Avskrift analyse av intronic germline mutasjoner
For å undersøke om intronic mutasjoner påvist i vår GC-serien (tabell 3) kan potensielt forårsake en effekt på spleising, vi utførte
CDH1
transkripsjon analyse. Polymorfe og tause varianter ble ekskludert fra denne analysen siden de sannsynligvis ikke har noen sykdomsfremkallende rolle. cDNA fremstilt fra perifert blod av de valgte GC individer som bærer intronic ID 5, ID 9 eller ID 17 mutasjoner (tabell 3) ble sammenlignet med det fra to friske bloddonorer, en bare å ha den samme ID-17-mutasjon som GC-pasienter (BD kode S190 ), og en annen (BD-kode S189) uten
CDH1
mutasjon.
for ID 5 og ID 7 intronic mutasjoner, forsterket vi regionen som dekker en del av ekson 1 til del av ekson 5, for ID 17 mutasjon, ekson 10 til 13 (figur 3). RT-PCR exon 1 til 5 fragmenter viste ingen forskjell når det kjøres på 4% agarosegel (figur 3A) og heller ikke etter toveis-sekvensering (data ikke vist); av converse ID 17 intronic variant kan påvirke spleising fører til en unormal mindre
CDH1
transkripsjon (Figur 3B). Ved isolering og sekvensering, fant vi at de mindre bandet resulterte i en hoppet transkripsjon mangler ekson 11, med ekson 10 direkte koblet til ekson 12. Dette avvik transkripsjon ble også påvist i BD S190 bærer samme kimcellelinje substitusjon (figur 3B).
Totalt mRNA ble ekstrahert fra PBMC fra hvert representert prøve og retrotrascribed til enkeltstreng-cDNA for å amplifisere: (A) Eksoner 1-5 på omtrent 768 bp. I den andre kjørefelt AMAG (S121) pasient bærer ID fem mutasjoner (IVS1 c.48 + 7C T); i tredje kjørefelt FDR (S97) som bærer ID 9 mutasjon (IVS4 c.532-18C T); (B) Eksoner 10-13 av omtrent 686 bp. GC (S10), GC (S46) og BD (S190) som bærer ID 17 mutasjon (IVS12 c.1937-13T C). Gule piler bevis et mindre bånd tilsvarende avvikende karakterutskrifter som mangler ekson 11; (C) β-aktin ble benyttet som intern forsterkning kontroll. MW: 1 Kb DNA stigen. PCR produktene ble kjørt i en 4% agarose og gel farget med SYBR Grønn dyef
Analyse av
CDH1
protein overflod og mRNA uttrykk nivå i fag som viser
CDH1
intronic mutasjoner
En sammenligning av E-cadherin mRNA-ekspresjonsnivået ble utført fra EBV-udødeliggjorte lymfocytter oppnådd fra perifert blod fra S10 og S190 (mutasjon ID 17), S97 (ID 9) og S189 (ingen
CDH1
mutasjoner) fag. Subject S10 ble rammet av et magekreft, er underlagt S97 første grad slektning av en pasient med en magekreft (FDR), mens S189 og S190 var begge blodgivere. Vi har observert mellom kontrollen blod donor (S189) som ikke har noen
CDH1
mutasjon og pasienter, en relativ sterk reduksjon av E-cadherin uttrykket (ca. 60%, figur 4) i pasient S10 som har både ID 17 mutasjon og en GC, mens bare omtrent en 2% reduksjon i blodgivere S190 som har samme ID 17 mutasjon (
p
0,05, med hensyn til GC S10). For S97 (mutasjon ID 9, FDR emne), observerte vi en tilsvarende E-cadherin uttrykk som i kontrollgruppen S189.
Relativ kvantifisering av E-cadherin mRNA-nivåer i EBV-udødelig lymfocytter (LCL). LCLer ble generert fra såing av 2,5 × 10
6 PBMC udødeliggjort av B.95.8 EBV og dyrket i suspensjon. Omtrent 8 millioner av celler ble høstet for hver prøve etter immortalisering. Pasienter som ble testet var: GC S10 husing ID-17 varianten (IVS12 c.1937-13T C), FDR S97 bærer ID 9 (IVS4 c.532-18C T), BD S190 med ID 17 og BD S189 uten
CDH1
mutasjon. S189 ble ansett som referanse (verdien 1) Resultatene er representative for tre uavhengige eksperimenter. E-cadherin uttrykk nivået var normalisert normalisert p-aktin Data er representert som betyr ± SD. *, P 0,05, **, p. 0,01
Immunhistokjemisk analyse på svulst magevevet intronic ID 17 tilfelle (pasient kode S10, figur 5E) viste en redusert uttrykk av membran-bundet E-cadherin i signet ringtumorceller (sorte piler), mens både membranen og cytoplasmisk farging var tilstede i normal epitel. Den samme pasient viste redusert β-catenin farging i de signet ring celler sammenlignet med den sterke ekspresjon av dette protein i de normale tilstøtende celler (figur 5H). Tapet av både E-cadherin og β-catenin farging var også merkbart for det andre pasienter (S46) som har den samme intronic ID 17 mutasjon og påvirkes av GC også (figur 5F og 5I, henholdsvis for E-cadherin og β-catenin) .
(A) Hematoxylin og eosin-farging i normal gastrisk vev. (B) Hematoxylin og eosin farging i svulstvev fra GC S10 med signetring cellekreft: signetring celler er markert med svarte piler. (C) Hematoxylin og eosin farging bevis diffuse histotype av GC S46. (D) E-cadherin farging i normal gastrisk vev. (E) Reduksjon av E-cadherin flekker i signetringceller i GC S10 forhold til omkringliggende normale celler; signetring celler er markert med svarte piler. (F) Tap av E-cadherin uttrykk i de diffuse tumorceller i GC S46 sammenlignet med normalt vev (på høyre side av fotomikrografi). (G) β-catenin farging i normal gastrisk vev. (H) Svakt β-catenin flekker i signetringceller (svarte piler) av GC S10. (I) Tap av β-catenin farging i tumorvevet av GC S46 sammenlignet med normalt vev (på høyre side av fotomikrografi). Alle mikrofotografiene ble tatt på 400 × forstørrelse.
Diskusjoner
GC pasienter har vanligvis en dårlig prognose [29]. Identifisering av pasienter med økt risiko for å utvikle GC og tidlig deteksjon av GC er lovende tilnærminger for å redusere sykelighet og dødelighet av GC. FDR fra GC pasienter er kjent for å ha en 2-3 ganger økt risiko for GC, sannsynligvis på grunn av eksponering for de samme miljømessige risikofaktorer og /eller arvet faren for kreft [30].
parietalceller ødeleggelse funnet i AMAG kombinert med den viktige rollen E-cadherin i epitelial polaritet og mage glandular arkitektur, tyder på at germline endringer av
CDH1
kan være en ekstra risikofaktor for GC utvikling i AMAG pasient [31].
i 1998 Guilford og kolleger beskrevet for første gang germline mutasjoner av
CDH1
genet [28]. Senere har ulike typer mutasjoner blitt rapportert i familier med ulik etnisitet med diffuse GC [32], [33]. Den første
CDH1
germline mutasjon ble beskrevet i en italiensk familie i 2006, i en pasient som møtte IGCLC kriteriene for HDGC [34]. Men svært få studier rapporterer
CDH1
germline mutasjoner i sporadiske GC tilfeller uten familiær aggregering eller i fag som har risiko for å utvikle GC [35], [36]. Videre, i disse studiene de funksjonelle effekter av
CDH1
varianter ofte ikke blir etterforsket.
Styrken vår studie er samlingen av 59 kaukasiske pasienter med sporadisk GC, 59 FDRs og 20 AMAGs som deltok vår gastroenterologi tjeneste i de siste årene for mage symptomer og en diagnose eller utelukkelse av et GC etter endoskopisk og evaluering histologisk vev.
Som oppsummert i tabell 3, diverse annen germline
CDH1
variantene har Det er oppdaget. I 59 GC-serien, med unntak av polymorfe og stille endringer som sannsynligvis ikke har noen patogene rolle, fant vi 6 forskjellige erstatninger i 9 pasienter (9/59 GCer = 15,2%): 4 av missense type (ID 10, ID 11, ID 12, ID 15) i 4 forskjellige pasienter (6,8%) og to ikke-missense type (ID 2 og ID-17) i 5 forskjellige GCer (3,4%).
ID 10 (p.G274S) er en roman missense mutasjon som vi fant i en gammel mann med en GC blandet histotype. Denne varianten ble ikke påvist i 187 fri-kreft individer (108BDs + 59FDRs + 20AMAGs) eksklusive dermed en polymorfisme. En sykdomsfremkallende effekt av ID 10 mutasjon ble ikke støttet etter funksjonell (aggregering og invasjon)
in vitro
analyser som vi nylig rapportert [26], likevel data fra
i silico
karakterisering av mutasjonen og en reduksjon i β-catenin ekspresjon funnet i tumorvevet kan ikke helt utelukke betydningen av denne mutasjon i GC utvikling. Dermed på dagens ID 10 forblir en roman
CDH1
mutasjon med en patogenesen av en ubestemt betydning.
ID 11 (p.A298T) substitusjon i exon 7 av
CDH1
har allerede blitt beskrevet i en 36-år gammel ung hvit mann i en HDGC familie [27]. I vår serie ble denne varianten oppdaget bare i en mannlig (S47) av 74-åringen med en blandet histotype. Den potensielle sykdomsfremkallende effekten av denne mutasjonen har blitt bekreftet gjennom
in vitro
funksjonelle studier i ulike laboratorier [27], [37], [38]. Her modelleringsresultater først (figur 2A-B) ved å analysere 3D-protein-ligand-bindende vekselvirkninger, sterkt støtte potensialet for endrede proteinfunksjon og føre til mulig molekylære mekanismen som opprett denne prosessen. Potensialet endret protein funksjon ble støttet også fra SIFT analyse (tabell 4) med en god score. Dessuten, en fersk studie, ved hjelp av
i silico
protein utforming FoldX algoritmisk tilnærming [39], reasserts den patogene rolle ID 11 (p.A298T) substitusjon, basert på en beregning av innfødte statlige stabilitetsendringer (ΔΔG 0,08 kcal /mol) [40]. Forfattere preget pasienter som hadde denne missense mutasjon som å ha en yngre alder ved diagnose og en diffus histotype. Vårt tilfelle fremhevet at ID 11 kan også påvises i en gammel pasient med blandet GC.
ID 12 (p.T470I) ble funnet i en 57-år gammel mann (S39) med en diagnose av GC . Denne endringen ble først beskrevet i en familie av Maori etnisitet med EOGC, men emnet viser denne mutasjonen ble ikke påvirket av GC på tidspunktet for undersøkelsen [28]. Her fant vi at p.T470I AA endringen er tolerert av SIFT og også ved modellering analyse. Dessverre, tumor bioptic vevsprøve var utilstrekkelig til å utføre E-cadherin IHC farging.
ID 15 substitusjon (p.A592T) ble påvist i hver klinisk gruppe testet, noe som tyder på en sannsynlig polymorfe diffusjon. Likevel, denne varianten har tidligere blitt rapportert i forbindelse med skjoldbruskkjertelen svulster og lobular brystkreft [41] – [43]. Vår strukturell analyse og
in vitro product: [35] og
i silico
studier [38], [40] støtter ikke en patogen rolle for denne varianten i GC.
som anbefalt av nyere kliniske retningslinjer for forvaltningen [44], endoskopi overvåking bør utføres årlig i de individer med mutasjoner av usikker betydning (f.eks missense). Etter vår mening, fag som bærer ID 15 og også ID 10, må følges i opptil 10 år før unntatt en rolle selv svak for denne endringen i patogenesen av GC.
I ID to identifiserte vi en C -til-G endring før startkodonet (-71C G,
CDH1
5’UTR region), som representerte den vanligste varianten forbundet med GC i vår serie, som forekommer i tre av 59 GC pasienter ( 5,1%). Denne varianten ble også rapportert i en finsk studie [45] i en av 13 (7,7%) GC pasienter og hos 2 av 51 kontroller (3,9%), og også i to EOGC pasienter i Nord-amerikansk opprinnelse (3,4%) [46] . Totalt data fra disse studiene tyder på at ID 2 er en ganske vanlig mutasjon, men forfatterne ikke rapportere data om ID 2 variant i forhold til E-cadherin uttrykk status. ID to ble funnet i vår serie i en tarm, en blandet, og ett diffuse GC histotypes. Alle disse pasientene hadde over 50 år på diagnose og var negative for HP infeksjon. Ingen av kontrollpersonene (n = 111) ble testet uten GC viste dette mutasjoner (tabell 3). En
in situ
evaluering eller en sammenheng mellom ID 2 og E-cadherin uttrykk var ute av stand til å utføres på grunn av manglende tumormateriale. Den potensielle sykdomsfremkallende effekten av denne arrangøren variant av E-cadherin uttrykk nivå fortjener videre studier
Intronic ID 17 variant (IVS12 c.1937-13T C). Ble funnet i 2 tisper med GC (2/59 GCer = 3,4%) både positivt for HP infeksjon, og det ble også funnet i en BD (1/52 = 1,9%, Tabell 3). Samme endring ble tidligere rapportert i lobular brystkreft med høy frekvens (12/53 = 23%) [47], i HDGC familier (2/27 = 7,4%) [48] og i EOGC pasienter (7/79 = 8,9% ) [46], men også i en relativ kontrollpopulasjon [46]. Av notatet, vi viser for første gang at denne substitusjon fører til en avvikende
CDH1
transkripsjon huse en sletting av
CDH1
exon 11. Exon 11, sammen med partielle sekvenser av flankerer eksoner , kodifiserer for EC4 domenen til det modne protein [25]; ID 17 er en ut-av-ramme sletting og fører til dannelse av et for tidlig stoppkodon i posisjon 384 av den EC4 promoteren. Følgelig er det translaterte proteinet fra
CDH1
ID 17 strengen kunne mangler transmembrandomenet og den cytoplasmiske hale som er involvert i β-catenin binding. Både S10 og S46 GC pasienter som har ID-17 mutasjon, viste en reduksjon i ekspresjon av E-cadherin og β-catenin av IHC-analyser (figur 5); GC S10 pasienten, med en signetring cellekreft, fikk diagnosen i en alder av 61 år, og GC S46 pasienten, med en diffus adenokarsinom ble diagnostisert i en alder av 58 år. Videre evaluering av E-cadherin ekspresjon fra den EBV-udødelig B-lymfocytter viste en sterk reduksjon (60%) i GC S10 huse ID 17 mutasjon sammenlignet med BD kontroll (S189) uten
CDH1
forandringer, men også sammenlignet med et enkelt bloddonor (S190) som bærer den samme ID-17 variant. Ettersom alle fag bærer ID 17 mutasjonen er heterozygot for
CDH1
genet, våre data tydet på at S190 enkelte, men ikke kreftceller av S10 og S46 pasienter kan utnytte noen kompenserende mekanisme som motvirker E-cadherin nedregulering. I svulster, er E-cadherin under-uttrykk knyttet til økt β-catenin transkripsjonen aktivitet, en hoved effektor av Wnt veien [49]. Ekspresjon av et stort antall gener relatert til tumorprogresjon, inkludert de for cyklin D1, c-
myc
, vaskulær endotelial vekstfaktor, og Survivin styres via Wnt /β-catenin veien [50]. E-cadherin binding til P-catenin hindrer dens translokasjon til kjernen; følgelig kan en reduksjon av E-cadherin ekspresjon favorisere GC patogenesen gjennom økt atom β-catenin akkumulering. Siden pasienter S10 og S46 med ID17 varianten er både kvinner viser en Helicobacter pylori (HP) infeksjon, antar vi at ID 17 kan være forbundet med en sex-spesifikke prognostisk faktor (det er vel kjent at forekomsten av GC er høyere for menn enn for kvinner) og /eller en HP infeksjon. En sletting av ekson 11 i
CDH1
genet ble også beskrevet i en HDGC pasient, men i det siste tilfellet avvikende spleising ble knyttet til en annen intronic mutasjon (IVS11 c.1711 + 5G A) [27] .
