Abstract
RASSF1C er en stor isoformen av RASSF1 genet, og fremstår som et onkogen. Dette er i motsetning til den RASSF1A isoform, som er en etablert tumor suppressor. Vi har tidligere vist at RASSF1C fremmer lungecancer celleproliferasjon og har identifisert RASSF1C målgener med vekstfremmende funksjon. Her har vi videre rapportere at RASSF1C fremmer lungekreft cellemigrasjon og forbedrer lungekreft celletumor sfære formasjon. Vi viser også at RASSF1C overekspresjon reduserer den hemmende effekten av anti-kreft-middel, betulinsyre (BA), på kreftcellelunge spredning. I tidligere arbeid har vi demonstrert at RASSF1C opp-regulerer
piwil1
genekspresjon, noe som er en stamcelleselvfornyelse gen som er overuttrykt i mange humane kreftformer, inkludert lungekreft. Her rapporterer vi på effektene av BA på
piwil1
genuttrykk. Celler behandlet med BA viser redusert
piwil1
uttrykk. Dessuten synes samspillet mellom IGFBP-5 med RASSF1C å hindre RASSF1C fra opptil regulerende PIWIL1 protein nivåer. Disse funnene tyder på at IGFBP-5 kan være en negativ modulator av RASSF1C /PIWIL1 vekstfremmende aktiviteter. I tillegg fant vi at hemming av ATM-AMPK sti opp-regulerer RASSF1C genekspresjon
Citation. Reeves ME, Firek M, Chen ST, Amaar YG (2014) Bevis for at RASSF1C Stimulering av Lung Cancer Cell spredning Avhenger IGFBP-5 og PIWIL1 uttrykk nivåer. PLoS ONE 9 (7): e101679. doi: 10,1371 /journal.pone.0101679
Redaktør: Pierlorenzo Pallante, Institute of Experimental endokrinologi og Oncology «G. Salvatore «(IEOS), Italia
mottatt: 10. juni, 2013, Godkjent: 11 juni 2014; Publisert: 09.07.2014
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Arbeidet er finansiert av Loma Linda Cancer Center. Den Funder hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
RASSF1 genet spiller en viktig rolle i menneskelig kreft celle vekst og progresjon. Det koder flere isoformer, de store er av disse er RASSF1A og RASSF1C. RASSF1A er den hyppigst inaktivert tumor suppressor i humane kreft hovedsakelig ved hjelp av spesifikk promoter metylering. Det hemmer cellevekst og migrasjon, og fremmer apoptose. På den annen side er det RASSF1C isoformen godt uttrykt i de fleste humane cancere, og ser ut til å fungere som et onkogen. I motsetning til RASSF1A, fremmer det kreft celleproliferasjon og migrasjon, og demper apoptose [1] – [13]. Således synes det RASSF1 genet for å spille en viktig rolle i dobbelt kreft, virker alternativt som en tumor suppressor og som et oncogen [1] – [15]. I samsvar med dette konseptet, nyere studier viser at ekspresjon av RASSF1C er oppregulert i humant lungekarsinom vev i forhold til matchede normale vev, og er forbundet med progresjon av kreft og dårlig prognose [13]. I tillegg RASSF1C over-uttrykk (men ikke RASSF1A over-uttrykk) i humane kreftceller øker opphopning av β-catenin onkogen, en sentral aktør i Wnt signalveien, som fører til økt transkripsjonen aktivering og celleproliferasjon [16].
Vi har tidligere vist at over-uttrykk for RASSF1C opp-regulerer (og stanse av RASSF1C nedregulerer) uttrykk for PIWIL1, en stamcelle selvfornyelse genet [12]. Den Piwil genet familien er en underfamilie av argonaute proteiner som spiller en sentral rolle i stamcelleselvfornyelse, gametogenesis, og transcriptional gene silencing i et bredt spekter av arter. De argonaute proteiner binde små RNA og de er preget av amino-terminal (N), PAZ (Piwil-argonaute-Zwille), MID (midten), og Piwi domener [17]. Hos mennesker, tre Piwil (Piwil en (også kalt Hiwi), Piwil2, og Piwil3) gener er identifisert. Piwi protein uttrykk profiler har nylig fått mye oppmerksomhet for sitt potensial funksjonell engasjement i onkogenese i en rekke humane kreftformer og Piwil1 og Piwil 2 har vist seg å være uavhengige prognostiske faktorer i magekreft [17] – [19]. De PIWIL proteiner og deres samspill små RNA (piRNAs) kan spille en rolle i tumordannelse gjennom å øke genet metylering og stanse av cyclin avhengige kinase hemmere og tumor dempere. De PIWIL proteiner og deres samvirkende små RNA (piRNAs) kan spille en rolle ved tumordannelse ved å øke genet metylering og stanse av cyklinavhengige kinaseinhibitorer og tumor-suppressorer [17] – [19]. Nyere studier viser at over-ekspresjon av PIWIL1 fremmer sarcomagenesis og ned-regulerer en rekke tumor undertrykkende midler, herunder insulinlignende vekstfaktorbindende protein 5 (IGFBP-5) [20]. IGFBP-5 er et medlem av IGF-bindende protein familien som er involvert i reguleringen av mitogener IGF I og II. IGFBP-5 er kritisk viktig i human cancer progresjon [21]; og vi har tidligere vist at RASSF1C er en bindende partner av IGFBP-5 [20].
Derfor ønsket vi å finne ut om RASSF1C medierer dens virkning på kreftceller gjennom samhandling med IGFBP-5 og PIWIL1. For å gjøre dette, har vi designet eksperimenter for å fastslå effekten av RASSF1C på lungekreft celleproliferasjon, migrasjon og tumor sfære formasjon. På grunn av at anti-cancer middel, betulinsyre (BA), har vist seg å ned-regulere PIWIL1 genekspresjon [22], studerte vi effektene av BA og RASSF1C /IGFBP-5 interaksjon med PIWIL1 genekspresjon og β-catenin proteinnivåer . Vi fant at RASSF1C fremmer kreftcellemigrering og tumor sfære formasjon, og reduserer inhibering av proliferasjon av BA. I tillegg interaksjon av IGFBP-5 med RASSF1C hindret RASSF1C-mediert oppregulering av PIWIL1. Endelig stanse av PIWIL1 genekspresjon redusert β-catenin protein nivåer, noe som indikerer at PIWIL1 kan bidra til Wnt signalering. Dermed RASSF1C, IGFBP-5, PIWIL1, og Wnt veien kunne fungere sammen som en ny akse som påvirker lungekreft cellevekst og progresjon.
Materialer og metoder
Cell kultur
Den menneskelige lungekreft cellelinjer NCI-H1299 og A549 ble oppnådd fra American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). A549 er RASSF1A negativ, p16 negativ, og p53 positive mens NCI-H1299 er RASSF1A negativ, p16 negativ, og p53 negativ. Cellekultur ble utført som anbefalt av ATCC.
Gene ekspresjonsvektorer
RASSF1C, IGFBP-5, og RASSF1A var over-uttrykt i menneskelig lungekreft celler ved hjelp av induserbar Murine Leukemia Virus (MLV) -baserte retrovirale vektorer som tidligere beskrevet [12].
Cell antall teller
NCI-H1299-celler som stabilt transduced med MLV-ryggraden (BB) og MLV-HA-RASSF1C (1C) ble behandlet med 1 ug /ml doksycyklin i 72 timer, og deretter ble cellene tellet ved bruk av et hemocytometer. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
Alamar blå assay
Celleproliferasjon /levedyktighet ble målt ved Alamar blå assay som tidligere beskrevet [11], [12]. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger og data ble analysert ved hjelp av t-test.
In vitro
celle invasjon analysen
BD BioCoat Matrigel invasjonen Chamber (BD Biosciences, Bedford, MA) ble anvendt for å utføre lungekreftcelle invasjons analyser. NCI-H1299-BB (kontroll) eller NCI-H1299-1C (overuttrykkende RASSF1C) celler ble sådd ut ved en tetthet på 25.000 celler i matrigel kamrene og dyrket i serumfritt RPMI-1640 i 24 timer. Kamrene inneholder NCI-H1299-BB og NCI-H1299-1C celler ble så overført til brønnen inneholdende medium supplert med 10% kalve bovint serum i 24 timer. Cellene på den nedre overflate av membranen ble fiksert med metanol og farget med 1% toluidinblått. De fargede Membranene ble fotografert gjennom mikroskopet og invaderende celler ble talt. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
Tumor sfære formasjon
En CD133 mikro Kit (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) ble brukt til å isolere A549 side befolkningen (SP, CD133
+, kreft stamceller) og ikke-SP (CD133
-) celler ved hjelp av en bruker flowcytometri protokollen fra leverandør. De SP celler ble isolert fra A549 transduced med enten kontroll MLV-ryggraden (A549-BB) eller MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). SP og ikke-SP-celler ble deretter inkubert i serumfritt medium supplert med EFG (20 ng /ml) og FGF (10 ng /ml) for å fremme SP-celler for å danne tumor kuler for tre wk. Tumor sfærer ble fotografert, oppsamlet, og sådd ut på medier supplert med 10% kalveserum, og cellene ble dyrket til 70% konfluens. Da celler ble anvendt for Western blot-analyse for å kontrollere ekspresjon av eksogen HA-RASSF1C.
RNA isolering og RT-PCR-analyse
Total RNA fra humane lungekreft-cellelinjer ble isolert fra kulturer og revers transkriptase (RT) -PCR ble utført ved anvendelse PIWIL1 genspesifikke primere som tidligere beskrevet [12]. PCR ble utført ved bruk av varmstart konsentrat-blanding (Qiagen, Valencia, CA), og PCR-reaksjonene ble kjørt med følgende betingelser: 95 ° C i 15 min, 95 ° C i 1 minutt, 60 ° C i 30 sek, og 72 ° C i 30 sekunder i 35 sykluser. Amplifisering av cyklofyllin ved hjelp av gen-spesifikke PCR-primere ble anvendt som en kontroll lasting. RT-PCR-reaksjonene ble utført i triplikater og folden endringen ble beregnet ved hjelp av to
-ΔΔCT metoden [23]. RT-PCR-kjøringer ble gjentatt minst 3 ganger.
Betulinic syre (BA) behandling
BA (Enzo Life Sciences, New York, New York) ble oppløst i DMSO på 5 mg /ml . A549 og NCI-H1299-celler ble sådd ut ved 5000 celle /brønn i 96-brønners plater. Neste dag ble cellene behandlet med 25 ug /ml BA i 24 timer. Celleproliferasjon ble deretter analysert ved anvendelse av Alamar blå analysen. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
stanse av Piwil1 ekspresjon i lungecancerceller
lungekreftceller (NCI-H1299) ble platet ut ved 5000 /brønn i 96-brønners plater 24 hr . før infeksjon og cellene ble infisert med Mission utenfor målgruppen shRNA Kontroll Transduction Partikler eller med flere Mission Lentiviral shRNA Transduction Partikler (NMID: NM_004764) for å kneble RASSF1C (Sigma, St. Louis, MO) som tidligere beskrevet [14]. Celler ble behandlet med polybrene (Sigma, ST. Louis, MO) i to timer før tilsetning av Lentiviral partikkel ved en infeksjonsmultiplisitet (MOI) på 5. knockdown validering av
piwil1
ekspresjon ble undersøkt ved Western blot og QRT -PCR hjelp RASSF1C antistoff og RASSF1C spesifikke primere, henholdsvis. Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
Western blot analyse
Western blot analyse ble utført ved hjelp av Odyssey Infrared System (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE) og anti-β- catenin antistoff # 9582 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PIWIL1 antistoff ab12337 (Abcam, Cambridge, MA), anti-HA antistoff klone 16B12 (Covance, Berkeley, CA), monoklonalt beta aktin antistoff AC-74 (Sigma, St. Louis, MO), og fluorescensmerket merkede sekundære antistoffer IRDye 680RD Infrarød Dye (LI-COR biovitenskap, Lincoln, NE). Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger. Protein nivåer ble normalisert til aktin nivåer (lasting kontroll) med standardavvik.
transkriptomet PCR Array skjermen
SureFind transkriptomet PCR Array ble hentet fra Qiagen (katalog nr 336611. Den besto av 90 cDNA prøvene stammer fra brystkreftcellelinje MCF7- behandlet med 90 ulike kjemiske hemmere som regulerer ulike signalveier. PCR utvalg ble screenet med RASSF1C genet spesifikke primere. data~~POS=TRUNC analyse~~POS=HEADCOMP ble utført ved å importere Ct verdier hentet inn i SureFind transkriptomet PCR Array data Analysis Software ved https://www.sabiosciences.com/tpadataanalysis.php (Qiagen). kjemikaliene som er identifisert som RASSF1C genekspresjon regulatorer ble brukt til å behandle lungekreft celler for å bekrefte deres virkninger på RASSF1C genekspresjon ved hjelp av RT-PCR.
Dorsomorphin og Trichostatin En behandling
H1299 lungekreftceller ble behandlet med Dorsomorphin, også kjent som forbindelse C, (10 uM) eller Trichostatin A (10 uM) i serumfritt medium i 24 timer før cellene ble samlet for RNA isolering. Kontrollceller ble behandlet med dimetylsulfoksid (DMSO). RT-PCR-analyse ved bruk av RASSF1C, PIWIL1, og cyklofyllin gen spesifikke primere ble gjennomført som nevnt ovenfor. Dorsomorphin ble oppnådd fra Phoenix Pharmaceutical, Inc. (Burlingame, CA) og Trichostatin A ble oppnådd fra Reagenser Direct (Encinitas, CA). Forsøkene ble gjentatt minst 3 ganger.
Statistical Analysis
t-test ble brukt til å beregne betydningen av dataene.
Resultater
RASSF1C overekspresjon forbedrer lungecancer cellemigrering
cancercellelinje NCI-H1299 lunge ble transdusert med retrovirale vektor som tidligere beskrevet [12], [13] for å skape en stabil cellelinje som over-uttrykker RASSF1C. Vi fant at stabile RASSF1C over-uttrykk ikke bare økt lungekreft celleproliferasjon (figur 1), som er konsistent med våre tidligere funn ved hjelp av forbigående over-uttrykk for RASSF1C [11], men også fremmet celle migrasjon (figur 2).
NCI-H1299-celler som stabilt transdusert med MLV-ryggraden (BB) eller MLV-HA-RASSF1C (1C) ble behandlet med 1 pg /ml doksycyklin i 72 timer, og deretter ble cellene tellet. RASSF1C over-uttrykk (1C) økte celleproliferasjon med 2,5 ganger sammenlignet med kontroll (BB). Dataene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM. * P. 0,05
. RASSF1C fremmer kreft celle lunge migrasjon. (A) BD BioCoat Matrigel invasjon kammeret ble brukt for å vurdere celle invasjon /migrering av NCI-H1299-celler som stabilt transdusert med tom MLV-ryggraden (BB) eller MLV-HA-RASSF1C (1C). Celler behandlet med doksycyklin ved 1 ug /ml ble ko-inkubert med serumholdig medium. Etter 24 timer ble de nedre sidene til filtrene fiksert og farget, og cellene i fire mikroskopiske områder ble tellet. Den gjennomsnittlige cellenummer teller ble plottet. (B) NCI-H1299-celler overuttrykkende RASSF1C viste et høyere antall celler invaderer Matrigel kammeret og vil migrere til den andre siden av filtersammenlignet med kontroll NCI-H1299-BB-celler. Dataene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og verdiene som representerer de gjennomsnittlige celle kimtall. * P. 0,05 som bestemt ved t-test
RASSF1C forbedrer lungetumor sfære dannelse
Det har vist seg at CD133-positive celler fra A549-cellelinjen kan gi opphav til tumor kuler og kan fungere som tumor-initiere celler [24], [25]. Derfor ønsket vi å vurdere effekten av RASSF1C over-uttrykk på lungekreft svulst sfære formasjon. Vi isolert A549 side befolkningen (SP, CD133
+ celler), som viser stamcelleliknende egenskaper, og ikke-SP CD133
– celler ved hjelp CD133 flowcytometri [24], [25]. De SP-celler ble isolert fra A549 transdusert med enten MLV-ryggrad (A549-BB) eller MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). Celler ble dyrket i serumfritt medium supplert med EFG og FGF å bevirke SP-celler for å danne tumor kuler (figur 3A). RASSF1C-SP-CD133
+ celler dannet mer og større svulst kuler i forhold til å kontrollere BB-SP-CD133
+ celler (figur 3A). For å vise at tumoren sfære avkom fremdeles over-uttrykt RASSF1C, tumor sfærer ble isolert, dyrket og anvendt for Western blot-analyse. SP celler gjorde faktisk over-express RASSF1C (figur 3B). Alt dette antyder at RASSF1C kan forsterke lungekreft stamcelleproliferasjon, og det er mulig at dette skjer ved oppregulering av PIWIL1 genet, en stamcelle selvfornyelse-genet [12].
(A) Ikke -SP-1C CD133
-, SP-BB CD133
+, og SP-1C CD133
+ -celler isolert fra A549 lungekreft cellelinjen ble dyrket i serumfritt medium supplert med 10 ng /ml EGF og 20 ng /ml FGF til å fremme tumor sfære dannelsen for tre wk. (B) A549 celler repopulated fra kreftkuler ble sjekket for HA-RASSF1C uttrykk ved hjelp HA-antistoff. Som forventet, SP-1C CD133- og CD133 + uttrykte HA-RASSF1C, mens SP-BB celler ikke. Dataene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter.
RASSF1C reduserer følsomheten av lungekreftceller til anti-cancer agent betulinsyre
Betulinic syre (BA) er en anti-inflammatorisk og anti-kreft middel som har vist seg å fremme apoptose og hemmer celleproliferasjon og migrasjon. Den gjør dette, i det minste delvis, ved å nedregulere PIWILI, cyklin B1, cyklin D1, BCL2 og opp-regulering bax-genekspresjon i flere typer kreftceller, inkludert A549 [22], [26], [27]. Vi har tidligere vist at RASSF1C over-uttrykk up-regulerer PIWIL1 genekspresjon og dermed har vi ønsket å finne ut om RASSF1C overuttrykk vil redusere de anti-proliferative effekter av BA på lungekreft celler. Våre eksperimenter viser at A549 og NCI-H1299-celler overuttrykkende RASSF1C var mindre følsomme overfor BA anti-proliferative effekter sammenlignet med kontrollceller (figur 4), noe som ytterligere understøtter en vekstfremmende rolle for RASSF1C i lungekreftceller.
A549 (A) og NCI-H1299 (B) lungekreftceller over-uttrykker RASSF1C ble behandlet med betulinsyre (BA) i 24 timer. Cellene ble så analysert med hensyn til cellenes levedyktighet /proliferasjon. RASSF1C over-ekspresjon betydelig redusert følsomheten av celler til BA. Dataene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05: for 1C forhold til BB
Effekter av BA på PIWIL1 uttrykk i lungekreftceller
Det har blitt rapportert at BA behandling av humane adenokarsinom i ventrikkel AGS celler ned. -regulates PIWIL1 genuttrykk [26]. Derfor ønsket vi å vurdere effekten av BA på PIWIL1 genuttrykk i lungekreftceller. RT-PCR data (figur 5) viser at
piwil1
mRNA nivåer ble redusert i A549 og H1299 celler på BA behandling. Ned regulerende effekten av BA på
piwil1
mRNA nivåer i lungekreftceller er i samsvar med det som ble observert i mage adenokarsinom AGS celler [26].
Piwil1
mRNA uttrykk ble undersøkt i nærvær og fravær av serum og BA i lungecancer cellelinjer A549 (A) og NCI-H1299 (B). RT-PCR data viser at
piwil1
uttrykk ble nedregulert ved BA i fravær og nærvær av serum. PCR-reaksjoner ble satt i tre paralleller og Cyclophillin ble anvendt som en intern kontroll lasting og brukt til å normalisere de relative ekspresjonsnivåer ved hjelp av to
-ΔΔ metode (26). RT-PCR reaksjonen ble kjørt i tre uavhengige ganger.
PIWIL1 knock-down fører til reduksjon av β-catenin uttrykk
RASSF1C har tidligere blitt koblet til Wnt signalveien, som RASSF1C over-uttrykk øker og lyddemping eller RASSF1C reduserer β-catenin akkumulering i lungekreftceller [16]. Vi har tidligere demonstrert at knock-down av RASSF1C ekspresjon resulterer i nedregulering av PIWIL1 genekspresjon [12]. Dermed har vi ønsket å finne ut om PIWIL1 genet knock-down vil påvirke β-catenin uttrykk. Knock-down av PIWIL1 genekspresjon ved anvendelse av en shRNA-lentiviral vektor resulterte i lavere nivåer av β-catenin mRNA og protein (figur 6). Våre funn tyder på at PIWIL1 kan modulere β-catenin nivåer, og at RASSF1C og PIWIL1 kan spille en nøkkelrolle i Wnt veien signaliserte til fremme tumorigenesis.
Knock-down av
piwil1
uttrykk resulterte i en reduksjon i β-catenin mRNA og proteinnivåer. (A) Western blot analyse av H1299 lungekreft celler infisert med Mission Lentiviral-shRNA-kontroll partikler (shRNA-forts) og Mission Lentiviral-shRNA-
piwil1 plakater (shRNA-
piwil1
) til stillhet endogene
piwil1
uttrykk. Western blot analyse ved hjelp av anti-PIWIL1 antistoff viser redusert PIWIL1 proteinnivået i shRNA-PIWIL1 celler sammenlignet med shRNA-forts celler. Stanse av
piwil1
genuttrykk resulterte i en reduksjon i β-catenin protein nivåer som bestemmes ved hjelp av β-catenin antistoff. Normaliserte PIWIL1 protein nivåer til aktin (lasting kontroll) er også vist, data representerer tre uavhengige blotter. (B)
Piwil1 Hotell og
β-catenin
mRNA nivåer ble også vurdert i shRNA-styring og shRNA-
piwil1
celler og RT-PCR data viser nedregule både
piwil1 Hotell og
β-catenin
mRNA nivåer som er konsistent med Western blot analyse. RT-PCR eksperimenter ble utført minst 3 uavhengige ganger.
Intracellulær IGFBP-5 ser ut til å modulere RASSF1C funksjon i lungekreftceller
Nyere arbeider viser at PIWIL1 overuttrykk ned -regulates et antall av tumorsuppressorgener, som blant annet IGFBP-5, i humane stamceller [18]. Tidligere arbeid i vårt laboratorium har vist at RASSF1C bindes til IGFBP-5 og kan regulere osteosarkom celleproliferasjon og apoptose [20]. Derfor ønsket vi å undersøke effekten av RASSF1C /IGFBP-5 samspill på PIWIL1 genuttrykk i lungekreftceller. Interessant, fant vi at samtidig uttrykk for RASSF1C og IGFBP-5 redusert PIWIL1 mRNA og proteinnivåer i lungekreftcellelinjer, mens co-uttrykk for RASSF1A-RASSF1C ikke har en stor effekt på PIWIL1 mRNA nivåer sammenlignet med celler over-uttrykker RASSF1C (figur 7). PIWIL1 proteinnivåer ble også redusert hos lungekreftceller som samtidig uttrykte RASSF1C-IGFBP-5 sammenlignet med celler overuttrykkende RASSF1C (figur 8). Videre fant vi at lungekreftceller samtidig uttrykte RASSF1C og IGFBP-5, men ikke celler som samtidig uttrykte RASSF1A og RASSF1C, var like oppmerksomme på BA hemming som kontrollcellene (Figur 9). Vi bør ikke at RASSF1A over-uttrykk alene ikke øke veksthemmende effekten av BA (data ikke vist). Disse funnene tyder på at intracellulær IGFBP-5, men ikke RASSF1A, negativt påvirker RASSF1C funksjoner. Linking RASSF1C /IGFBP-5 interaksjon til modulering av PIWIL1 genekspresjon og celleproliferasjon er et nytt funn som krever videre undersøkelser.
Piwil1
mRNA uttrykk ble undersøkt i H1299-celler som stabilt transduced med MLV -Ha-back bone (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C), MLV-HA-RASSF1A og 1C (1A-1C) og MLV-HA-1C og IGFBP-5 (1C-BP5). RT-PCR data viser at
piwil1
mRNA uttrykk i celler co-uttrykker 1C og BP5 ble redusert sammenlignet med celler over-uttrykker 1C og 1A and1C. Dataene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05: for 1C forhold til BB
(A) Western blot analyse av NCI-H1299 og A549-celler som stabilt transduced med MLV-ryggraden (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C. ), MLV-HA-IGFBP-5 (BP5), og ko-transdusert med både MLV-HA-RASSF1C og -IGFBP-5 (1C-BP5) og behandlet med 1 pg /ml doksycyklin i 48 timer. Den anti-HA-tag antistoff detektert et HA-RASSF1C og HA-IGFBP-5-fusjonsprotein i celler som over-uttrykte hver alene og de som co-uttrykte dem begge. Fusjonsproteinet ble visualisert ved hjelp av fluorescerende merkede sekundære antistoffer. (B) Western blot analyse av A549 og H1299 lungekreft celler stabilt transduced med MLV-ryggrad (A549-BB og H1299-BB), MLV-HA-RASSF1C (A549-1C og H1299-1C), MLV-HA-IGFBP- 5 (A549-BP5 og H1299-BP5), og MLV-HA-RASSF1C /MLV-HA-IGFBP-5 A549-1C-BP5 og H1299-1C-BP5). Den anti-PIWIL1 antistoff ble brukt til å sondere Western blot. PIWIL1 blir oppregulert i A549 og NCI-H1299-celler overuttrykkende RASSF1C, men ikke i celler som uttrykker IGFBP-5 eller ko-uttrykker både IGFBP-5 og RASSF1C. (C) Viser norm PIWIL1 protein nivåer til aktin (lasting kontroll) med standardavvik, data representerer tre uavhengige blotter.
. H1299-BB, H1299-1C, H1299-1A-1C, og H1299-1C-BP5-celler ble behandlet med betulinsyre (BA) i 24 timer. Cellene ble så analysert med hensyn til cellenes levedyktighet /proliferasjon. Celler som samtidig uttrykker RASSF1C-IGFBP-5 var mer følsomme overfor BA sammenlignet med celler som over-uttrykker RASSF1C eller ko-uttrykker RASSF1A-RASSF1C. Dataene er representative for minst 3 uavhengige eksperimenter, og verdiene representerer gjennomsnitt ± SEM. * P 0,05: for 1C forhold til BB
Hemming av ATM-AMPK veien induserer RASSF1C genuttrykk
For øyeblikket ingenting er kjent om oppstrøms signal kaskader involvert i regulering RASSF1C genet. uttrykk. Derfor utførte vi en transkriptomet PCR rekke studier for å identifisere kjemiske hemmere og tilhørende signalveien (e) som modulerer RASSF1C uttrykk. PCR rekke besto av cDNA fra brystkreftcellelinje MCF7 behandlet med 90 forskjellige kjemiske inhibitorer som regulerer forskjellige signalveier. Matrisen ble screenet med RASSF1C genet spesifikke primere og flere kjemiske hemmere som synes å opp-regulere og ned-regulere RASSF1C uttrykk ved ≥ 1,5 ganger ble identifisert. De mest merkbare reagenser er Dorsopmorphin (AMPK hemmer) og KU60019 (ATM-hemmer) som opp-regulerer RASSF1C uttrykk med 2,8 og 2,4 ganger henholdsvis; og Trichostatin A (HDAC hemmer og AMPK aktivator) ned regulerer RASSF1C uttrykk av to ganger (tabell 1). Vi bekreftet senere effekten av Dorsomorphin og Trichostatin på RASSF1C ekspresjon i H1299 lungekreftceller (figur 10). Disse funnene er nye og tyder på at ATM-AMPK veien kan modulere ekspresjon RASSF1C /funksjon i lungecancerceller.
H1299 lungekreftceller ble behandlet med Dorsomorphin og Trichostatin A ved en konsentrasjon på 10 uM for å bekrefte PCR- array-data. RT-PCR-analyse viser at Dorsomorphin betydelig oppregulert RASSF1C genekspresjon mens litt opp regulerende PIWIL1 genuttrykk. Trichostatin En behandling signifikant nedregulert RASSF1C og PIWIL1 mRNA nivåer. Dataene som presenteres er et gjennomsnitt av tre uavhengige RT-PCR eksperimenter utført i tre eksemplarer, * = P. 0,05
Diskusjoner
RASSF1 ser ut til å være et gen med dual funksjonalitet, både som en tumor suppressor protein (RASSF1A isoform), og som et oncoprotein (RASSF1C isoform) [11] – [16]. I denne artikkelen, rapporterer vi at over-ekspresjon av RASSF1C ikke bare forbedrer lungecancer celleproliferasjon, men fremmer også cellemigrering. Dette er i overensstemmelse med våre tidligere funn hos brystkreftceller [13]. I tillegg RASSF1C overekspresjon reduserer også effekten av anti-kreft-middel, betulinsyre, som er kjent for å redusere cancercellelunge spredning [22]. Dette støtter ytterligere vekstfremmende og apoptose dempe virkningene av RASSF1C.
Vi har tidligere vist at RASSF1C modulerer PIWIL1 genekspresjon, en stamcelle selvfornyelse genet. Derfor er det mulig at RASSF1C kan bidra til lungekreft stamcelle utvikling og progresjon. I samsvar med dette, fant vi at CD133
+ lungekreftceller (som viser kreftstamcellelignende egenskaper [24], [25] over-uttrykker RASSF1C ser ut til å danne større og mer tallrike kreftkuler i forhold til å kontrollere CD133
+ celler. pIWIL1 genekspresjon er forhøyet i mange humane kreftceller, og det har vært antydet at pIWIL1 kan være involvert i tumordannelse [17], [18], [26]. Nylig har sh-RNA
piwil1
gene knock-down i lungekreft stamceller (SSCloAldebr) er blitt vist å signifikant redusere tumorvekst i nakne mus, ytterligere impliserte rolle PIWIL1 proteinet i å opprettholde kreft stamcelleproliferasjon [28].
BA har tidligere vist seg å redusere menneskelige kreftcelle spredning og ned-regulere
piwil1
mRNA uttrykk i adenokarsinom celler [22], [26]. Vi vurderte effekten av BA på
piwil1
genet ekspresjon i lungecancerceller ved hjelp av RT-PCR og Western blot-analyse. Selv om behandling av lungekreftceller med BA resulterte i en reduksjon i celleformering (figur 4) og i nedregulering av
piwil1
mRNA som er konsistent med publisert litteratur.
piwil1
genet er over-uttrykt i flere kreft hos mennesker, og banke ned av
piwil1
avtar (og over-uttrykk for
piwil1
genet øker) tumorvekst
in vivo product: [18], [19], [28]. Men svært lite er kjent om sin rolle i lunge kreft celle vekst og progresjon. Vi banket ned
piwil1
genuttrykk til ytterligere lære om sine funksjoner i lungekreftceller. Vi fant ut at
piwil1
genet knock-down resulterte i en nedgang i endogene β-catenin protein nivåer. Vi har vist at RASSF1C opp-regulerer PIWIL1 uttrykk [12], og andre har vist at RASSF1C forbedrer akkumulering av β-catenin proteinnivåer i A549 lungekreftceller [15]. Våre funn peker på en mulig sammenheng mellom RASSF1C og PIWIL1 og den kanoniske Wnt signalveien, en vei som spiller en nøkkelrolle i å ikke bare holde stamceller i en selvfornyende og udifferensiert tilstand, men også for å fremme tumorigenesis [19], [ ,,,0],28].
PIWIL1 har nylig blitt vist å hemme differensiering av sarkom forløpere
in vitro Hotell og å indusere sarkomer
in vivo plakater (19). PIWIL1 induserer sarcomagenesis gjennom nedregulering av tumor-suppressorer og cyklin-avhengige kinase-inhibitorer via hypermethylation [19]. En av de tumor suppressorer nedregulert ved PIWIL1 er IGFBP-5, som vi tidligere har vist seg å være et samspill partner av RASSF1C [19]. Derfor ønsket vi å studere effekten av RASSF1C /IGFBP-5 samspill på PIWIL1 genuttrykk i lungekreftceller. Forbløffende nok co-uttrykk for RASSF1C og IGFBP-5 betydelig negerte RASSF1C oppregulering av PIWIL1 genekspresjon og også forbedret hemmende effekten av BA sammenlignet med celler som verken uttrykt RASSF1C eller co-express RASSF1A og RASSF1C (figur 9). Sammen utgjør disse funnene tyder på at IGFBP-5 kan binde og binder RASSF1C, og dermed hindre oppregulering av PIWIL1 genekspresjon av RASSF1C. Denne koblingen av IGFBP-5 /RASSF1C samspill med modulering av PIWIL1 uttrykk er et nytt funn og fortjener videre studier og validering.
For øyeblikket ingenting er kjent om hvordan RASSF1C genuttrykk er regulert, og dermed har vi utført en transkriptom PCR matrise skjerm og identifiserte flere kjemiske hemmere som synes å modulere RASSF1C genuttrykk. Blant disse kjemiske hemmere, fant vi at den kjemiske inhibitor Dorsomorphin (også kjent som sammensatte C) og KU60019 up-regulere RASSF1C 2 ganger mens den kjemiske Trichostatin A nedregulerer RASSF1C genuttrykk ved to ganger i bryst og lunge kreftceller (tabell 1). Dorsomorphin har vist seg å hemme effektene av ioniserende stråling (IR) på cellesyklus-stans og celleproliferasjon gjennom inaktivering av ATM-AMPK-p21
waf /cip sti [29]. Aktivering av ATM-AMPK-p21
waf /CIP vei med Metformin har nylig blitt vist å hemme vekst og for å forbedre IR effekter på NSCLC celler [30].
