Abstract
Onco-MIR-182-5p har blitt rapportert å være over-uttrykt i blærekreft (BC) vev imidlertid har ikke blitt gjennomført en detaljert funksjonsanalyse av MIR-182-5p i BC. Derfor hensikten med denne studien var å: 1. gjennomføre en funksjonsanalyse av MIR-182-5p i blærekreft, 2. vurdere nytten som en svulst markør, 3. identifisere MIR-182-5p målgener i BC. I utgangspunktet har vi funnet at Mir-182-5p uttrykk var betydelig høyere i blærekreft sammenlignet med normalt vev og høy MIR-182-5p uttrykk var assosiert med kortere total overlevelse i BC pasienter. For å studere den funksjonelle betydningen av MIR-182-5p, vi over-uttrykt MIR-182-5p med MIR-182-5p forløper og observert at celle spredning, migrasjon og invasjon evner ble økt i BC celler. Men celle apoptose ble hemmet av MIR-182-5p. Vi identifiserte også
Smad4 Hotell og
RECK
som potensielle mål gener fra Mir-182-5p bruker flere algoritmer. 3’UTR luciferase aktiviteten til disse målgener var betydelig redusert og protein uttrykk av disse målgener var signifikant oppregulert i MIR-182-5p hemmer transfekterte blære kreftceller. MiR-182-5p også økt kjernekraft beta-catenin uttrykk og samtidig Smad4 trykt atom beta-catenin uttrykk. I konklusjonen, tyder våre data på at Mir-182-5p spiller en viktig rolle som et onkogen ved å banke ned RECK og Smad4, noe som resulterer i aktivering av Wnt-beta-catenin signalveien i blærekreft
Citation.: Hirata H, Ueno K, Shahryari V, Tanaka Y, Tabatabai ZL, Hinoda Y, et al. (2012) onkogene miRNA-182-5p Targets Smad4 og Reck i Human blærekreft. PLoS ONE 7 (11): e51056. doi: 10,1371 /journal.pone.0051056
Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA
mottatt: 14. september 2012; Godkjent: 29 oktober 2012; Publisert: 30.11.2012
Dette er en åpen-tilgang artikkelen, fri for all opphavsrett, og kan bli fritt reproduseres, distribueres, overføres, endres, bygd på, eller brukes av alle for ethvert lovlig formål. Arbeidet er gjort tilgjengelig under Creative Commons CC0 public domain engasjement
Finansiering:. Denne studien ble støttet av National Center for Forskningsressurser i USA National Institutes of Health gjennom Grant Antall RO1CA138642, RO1CA130860, RO1CA160079, VA Merit anmeldelse tilskudd og VA Program Project. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
blærekreft (BC) er den tredje største dødsårsaken blant urologiske tumorer og den vanligste histologiske typen blærekreft er uroteliale karsinom (UC), tidligere kjent som overgangsordning celle carcinoma (TCC) [1]. Omtrent 75% av pasientene er «ikke-muskel invasiv UC (PTA, pTis, PT1) og har en 5-års overlevelse på mellom 88-98% [2]. Den vanligste behandlingen for disse pasientene er endoskopisk reseksjon [1], [3]. Pasienter med muskel invasiv UC er vanligvis behandles med radikal cystektomi eller cellegift strålebehandling [1], [4]. Men halvparten av muskel invasiv UC pasienter utvikler påfølgende metastatisk sykdom etter første aggressiv behandling [1], [5]. Tidligere studier har identifisert flere potensielle molekylære biomarkører for blærekreft [6], [7]. Inaktivering av tumorsuppressorgener
TP53 Hotell og
Rb Hotell og
Ras
onkogen aktivering har vært ansett som viktige sentrale aktører i blærekreft kreft [6].
Aktivering av Wnt-beta-signalisering catenin har også blitt studert og rapportert å være assosiert med kreft progresjon og dårlig prognose i blærekreft, [8], [9]. Transformerende vekstfaktor beta (TGF-beta) spiller en avgjørende rolle i fosterutviklingen og patogenese av en rekke sykdommer og kreft [10]. Bevis på krysstale mellom TGF-beta og andre signalveier, inkludert Wnt signalering har blitt rapportert [10]. Smad4 er en sentral intracellulær signaltransduksjon komponent av TGF-beta, og nylige studier har vist at Smad4 samvirker med beta-catenin i flere caners [11] – [14]
RECK er avgjørende repressor av matriksmetalloproteinaser (MMP’er. ) og tidligere studier har vist at RECK ekspresjon er signifikant lavere i blærecancer vev sammenlignet med normale urothelial vev [15] – [17]
Hittil har mange microRNAs har blitt identifisert og rapportert å være viktig i flere krefttyper. [18]. MicroRNAs (mirnas) er små ikke-kodende RNA, omtrent 22 nukleotider i lengde, som er i stand til å regulere genekspresjon på både transkripsjons- og translasjonsnivåer [19]. Mirnas binder seg til 3’UTR av målet mRNA og undertrykke oversettelse fra mRNA til protein eller indusere mRNA cleavage og dermed regulere uttrykket av målgener [20].
I denne studien fant vi at MIR-182- 5p var signifikant høyere i blæren kreft vev sammenlignet med vanlige uroteliale vev og høy MIR-182-5p uttrykk var signifikant assosiert med kortere total overlevelse. Så langt har det ikke vært noen rapporter om funksjon av MIR-182-5p i blærekreft. Dermed har vi fokusert på MIR-182-5p, utført funksjonelle analyser, identifisert flere mål gener fra Mir-182-5p bruker flere algoritmer og identifisert
Smad4
og
RECK
som målgener. Til slutt, vi over-uttrykt disse målgener (
Smad4 Hotell og
RECK
) i blæren kreftceller til å undersøke mekanismen av MIR-182-5p funksjon.
Resultater
miRNA-182-5p Expression er vesentlig høyere i blærekreft vev og Associated med Shorter Total overlevelse
Vi har sammenlignet miRNA-182-5p uttrykk nivåer i blærekreft vev (n = 18) og normal uroteliale vev (n = 6) ved real-time PCR. Mir-182-5p uttrykk var betydelig høyere i blærekreft vev (fig 1A). Vi undersøkte sammenslutning av MIR-182-5p og flere kliniske parametere som vist i Figur 1-B og observert at høy MIR-182-5p uttrykk var signifikant assosiert med kortere total overlevelse.
A. MIR-182-5p uttrykk i kliniske prøver og blærekreftcellelinjer, B. Association of MIR-182-5p med klinikk-patologisk parametre, C. Kaplan Meier plott av total overlevelse.
Når det gjelder flere andre kliniske parametre, ingen signifikant sammenheng ble observert. Vi delte de 18 blærekreftpasienter inn i to kategorier basert på medianverdien og Kaplan Meier plott viste at total overlevelse var kortere i høy MIR-182-5p uttrykker gruppen (p-verdi = 0,0349, Log-rank test) (Figur 1- C).
miRNA-182-5p Expression er betydelig økt i blærekreft cellelinjer
Vi har sammenlignet MIR-182-5p uttrykk i flere blærekreft cellelinjer og dens uttrykk i T24 og UM -UC-3-celler var i området fra at det i blærecancer vev. Dermed har vi brukt disse to blære kreft cellelinjer for videre eksperimenter i denne studien (figur 1A).
Effekt av mikroRNA-182-5p Over-uttrykk på celleviabilitet og migrasjon i blærekreft cellelinjer
for å bekrefte funksjonen av MIR-182-5p, transfektert vi MIR-182-5p forløper til blærekreft cellelinjer (T24 og UM-UC-3). Ved 24 timer etter transfeksjon av MIR-NC eller MIR-182-5p forløper til blæren kreftceller, ble Mir-182-5p uttrykk nivå verifisert av real time PCR (endring, 4545, 5920, henholdsvis Figur 2-A.) . Deretter ble det utført flere funksjonelle analyser. Vi observerte betydelig økt celleproliferasjon (fig. 2-B), invasjon (fig. 2-C) og migrasjon (fig. 2-D) i miRNA-182-5p transfektert celler i forhold til Mir-NC transfekterte celler. I tillegg MIR-182-5p betydelig redusert celle apoptose (fig. 2-E).
To blære kreft cellelinjer (T24 og UM-UC-3) ble transient transfektert med enten MIR-182-5p forløper eller kontroll (MIR-NC). A. Relativ MIR-182-5p uttrykk, B. Celleviabilitet analysen, C. Invasion analysen, D. Sårtilheling analyse (24 timer), E. Flowcytometrisk analyse av apoptose i MIR-NC eller MIR-182-5p transfektert BC celler.
3′-UTR-Luciferase Assay og Target protein uttrykk i MIR-182-5p Transfektanter
RECK mRNA har en stund Smad4 har to potensielle gratis bindingssetet med speil 182-5p innenfor sin 3 «UTR (fig. 3-A). Basert på disse resultatene, utførte vi 3’UTR luciferasepreparater analyser og funnet at de relative luciferase aktiviteter med disse områdene ble signifikant redusert i MIR-182-5p transfekterte blære kreftceller (T24, UM-UC-3) (Fig. 3-B ). Disse resultatene tyder på at Reck og Smad4 mRNA er potensielle mål gener fra Mir-182-5p. Western-analyse bekreftet at RECK og Smad4 protein uttrykk ble betydelig økt i MIR-182-5p hemmer transfekterte celler (Fig. 3-C).
A. RECK og Smad4 3’UTR posisjon og utfyllende MIR-182-5p sekvenser. B. 3’UTR Luciferase assay (MIR-NC og MIR-182-5p forløper), C. RECK, Smad4 og beta-tubulin protein uttrykk i MIR-NC-hemmer eller Mir-182-5p hemmer transfekterte blære kreftceller (T24, UM-UC-3).
Effekter av over-uttrykk for RECK og Smad4 på blærekreft Cell (T24) funksjon
for å se på funksjonen av RECK og Smad4, vi overexpressed RECK og Smad4 i T24 celler som ble bekreftet ved å måle mRNA (fig. 4-A) og protein uttrykk nivåer (fig. 4-B). Deretter utførte vi flere funksjonelle analyser. Som vist i figur 4, celle-levedyktighet (fig. 4-C), invasjon (Fig. 4-D) og migrasjon (fig. 4-E) ble signifikant hemmet i RECK og Smad4 transfektert T24 blærekreftceller. Som vist i fig 4-F, ble andelen av apoptotiske celler signifikant økt i RECK eller Smad4 transfekterte celler.
A. Ved 24 timer etter transfeksjon av enten pCMV6-tom, pCMV6-RECK eller pCMV6-Smad4 i blærekreftceller (T24), ble Reck og Smad4 uttrykk nivåer verifisert av real time RT-PCR (endring, 24744, 8563, henholdsvis) og Vest-analyse (B) C. Celleviabilitet analysen, D. Invasion analysen, E. Wound healing analysen, F. flowcytometrisk analyse av apoptose i tom, RECK og Smad4 transfektert T24 celler. Data er gjennomsnitt ± S.D. av fire uavhengige eksperimenter. G. beta-catenin uttrykk i atom fraksjon, CREB ble brukt som kontroll.
Effekt av MIR-182-5p og Smad4 på Beta-catenin Expression i Nuclear Brøk
Som vist i figur 4-G, ble beta-catenin ekspresjon i den nukleære fraksjonen betydelig økt i MIR-182-5p transfekterte T24 celler. I kontrast, beta-catenin uttrykk i atom fraksjonen ble betydelig redusert i Smad4 transfektert T24 celler.
Diskusjoner
En rekke microRNAs er identifisert som tumor suppressor eller onkogener basert på deres uttrykk nivå i blærekreft vev og /eller funksjonell analyse. Imidlertid har mange miRNA studier fokusert på tumor suppressor mirnas inkludert MIR-125b, -133a, -143, -145, -200 familie (200a, 200b, 200c, 141, 429), -203, -205, -218, – 449a, -493 -517a og [21] – [29]. To mirnas (MIR-21 og MIR-129) har blitt identifisert og bekreftet som onkogener i blærekreft [30], [31].
MiR-182-5p har også blitt rapportert å være et onkogen i flere -kreft [32] – [37]. I likhet med resultatene, en rapport funnet at MIR-182-5p ekspresjon var signifikant høyere i blærecancer vev sammenlignet med normal urothelium, men funksjonsanalyse ble ikke utført i denne studien [38]. Dermed har vi undersøkt sammenhengen mellom MIR-182-5p uttrykk og kliniske parametere inkludert patologiske stadier og pasientens utfall og fant at Mir-182-5p uttrykk ble korrelert til kortere samlet overlevelse etter operasjon i blærekreftpasienter. Disse resultatene tyder på at Mir-182-5p kan være en ny og nyttig diagnostisk biomarkør i blærekreft.
Vårt neste mål var å finne ut om MIR-182-5p fungerer som en blærekreft onkogen. Av tre blærecancercellelinjer (T24, UM-UC-3, J82), ekspresjon av MIR-182-5p i to cellelinjer (T24 og UM-UC-3) var i området fra ekspresjon observert i blærecancer vev . Dermed har vi brukt disse to blærekreft cellelinjer (T24 og UM-UC-3) for funksjonell analyse eksperimenter. Vi fant at overuttrykk av MIR-182-5p betydelig forfremmet blærekreft celleviabilitet, migrasjon og invasjon og hemmet apoptose. Vi brukte flere algoritmer for å søke etter potensielle Mir-182-5p målgener siden microRNAs utøve sine effekter ved å regulere målet genuttrykk. Vi identifiserte RECK og Smad4 som potensielle målgener av 3’UTR luciferase assay og Vest-analyser.
MMP spiller en viktig rolle i kreft invasjon og metastasering og MMP-2 heving i blæren kreft vev har blitt rapportert å være korrelert med tumorstadium og dårlig prognose i blærekreftpasienter [39], [40]. RECK er en avgjørende MMP-2-repressor og RECK ekspresjon ble tidligere rapportert å bli nedregulert i blærecancer vev sammenlignet med normal urothelium [16], [17]. I tillegg har DNA-metylering blitt identifisert som en RECK Stillemekanismen [41]. Nylig MIR-21 ble identifisert som en regulator av
RECK
genuttrykk i flere krefttyper [42], men hittil har det ikke vært noen rapport som viser direkte regulering av RECK av MIR-182-5p.
Vi undersøkte også den funksjon av RECK ved spissen uttrykker det i en blærecancercellelinje (T24). Som vist, RECK hemmet celleproliferasjon, ble migrering og invasjon evner i blærecancerceller og antall av apoptotiske celler økte med RECK transfeksjon.
Smad4 er et viktig signaltransduksjon komponent av TGF-beta og nylige studier viser at Smad4 funksjoner ved å samarbeide med beta-catenin i flere kreftformer.
Wnt-beta catenin signal er avgjørende for embryogenese og tumorgenesen [43]. I kreftceller, er Wnt veien vanligvis aktivert forårsaker ufosforylerte beta-catenin å akkumulere i cytoplasma og flytter til kjernen, hvor det binder seg til TCF /LEF og transcriptionally regulerer Wnt målgener fremme tumorigenesis [43]. I blærekreft, deregulert Wnt-beta-catenin signal spiller en viktig rolle i utviklingen og metastasering. Dermed har vi så for å se om beta-catenin uttrykk ble endret ved enten miRNA-182 eller Smad4 transfeksjon. Som vi observerte, MIR-182-5p økt atom beta-catenin uttrykk mens Smad4 redusert kjernekraft beta-catenin uttrykk. Så vidt vi vet, har det ikke vært noen rapporter om MIR-182 og Wnt-beta-catenin signal og våre resultater tyder på at onko-MIR-182-5p kan være involvert i reguleringen av Wnt-beta-catenin relaterte gener.
I vår studie, redusert Smad4 overekspresjon blærekreft celleproliferasjon, migrasjon og invasjon evne. Apoptose ble også økt med Smad4 overekspresjon i blæren kreftceller. Etter tap av Smad4 er blitt rapportert å spille en kausal rolle for å starte squamous cell karsinomer i huden, øvre fordøyelseskanalen, så vel som adenocarcinoma i mage-tarmkanalen [44], kan våre resultater indikerer at Smad4 spiller en viktig rolle i blærekreft. Siden vi fokuserte bare på Smad4 i Wnt-signalkaskade, er det mulig at andre gener kan være direkte eller indirekte regulert av MIR-182-5p. Andre eksperimenter vil være nødvendig for å belyse den eksakte rolle MIR-182-5p i Wnt-beta catenin signalering. Til sammen viser denne studien at Mir-182-5p utøver sin onkogene effekter i blæren kreftceller ved å nedregulere RECK og Smad4.
Dette er den første rapporten til også å dokumentere at Mir-182-5p uttrykk er betydelig økt i blæren kreft vev der det fungerer som et onkogen ved å hemme RECK og Smad4 uttrykk og kan være potensielt nyttig som en prognostisk biomarkør. Resultatene tyder også på at Mir-182-5p kan ha terapeutisk potensiale for behandling av blærekreft.
Materialer og metoder
Etikk erklæringen
Formalin fiksert, parafin- innebygd (FFPE) blærekreft prøver ble innhentet fra San Francisco Veterans Affairs (VA) Medical Center. Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter og studien ble godkjent av UCSF komité for menneskeforskning (Godkjenningsnummer: H9058-35751-01).
kliniske prøver
Totalt 18 mann pasienter med patologisk bekreftet blærekreft ble inkludert i denne studien (Veterans Affairs Medical Center i San Francisco)
Cell Kultur
Tre blære kreft cellelinjer (J82, ATCC nummer. HTB-1, T24, ATCC nummer: HTB-4, UM-UC-3, ATCC nummer: ble CRL-1749) kjøpt fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). De J82 og UM-UC-3 cellelinjer ble dyrket i MEM Eagle «s med Earles BSS supplert med 10% føtalt bovint serum. T24-cellelinjen ble dyrket i McCoys 5A medium med 10% føtalt bovint serum.
RNA og protein utvinning
RNA (mikroRNA og total-RNA) ble ekstrahert fra formalinfiksert, parafin-innleiret (FFPE) human blærekreft og ikke-kreft normal blære vev (urotelialceller) ved hjelp av en miRNeasy FFPE kit (Qiagen) etter laser mikro-disseksjon basert på patologer anmeldelser. Totalt RNA ble også utvunnet fra blære cancercellelinjer under anvendelse av en miRNeasy mini-sett (QIAGEN). Cellene ble lysert med RIPA buffer (Thermo Scientific, Rockford, IL) som inneholder proteasehemmere (Sigma, St. Louis, MO). Protein kvantifisering ble gjort ved hjelp av en BCA proteinanalyse kit (Thermo Scientific, Rockford, IL). NE-PER Kjerne- og Cytoplasmatiske Ekstraksjonsreagens ble brukt til å trekke ut kjernefysiske og cytoplasmatiske proteinfraksjoner fra blæren kreftceller (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL).
mikroRNA Transfeksjon (pre-MIR Precursor og MIR Inhibitor)
Pre-Mir ™ miRNA forløpere [negativ kontroll (MIR-NC) eller HSA-MIR-182-5p, Ambion] ble transient transfektert inn i blæren kreftceller ved Lipofectamine 2000 (Invitrogen) i henhold til produsentens instruksjoner.
Anti-MIR ™ miRNA hemmer [negativ kontroll (inh-NC) eller MIR-182-5p inhibitor (MIR-182-hemmer), Ambion] ble transient transfektert inn i blæren kreftceller ved SIPORT NeoFX Transfeksjon Agent (Ambion) i henhold til produsentens instruksjoner. Etter transfeksjon ble cellene inkubert ved 37 ° C i 48 timer før vurdering.
Cell levedyktighet, Cell Invasion, Wound Healing analysen
Celleviabilitet ble målt 3 dager etter transfeksjon med MTS (CellTiter 96 vandig En løsning Cell Proliferation Assay, Promega). Data er gjennomsnitt ± S.D. 6 uavhengige eksperimenter. Cell invasjon ble utført med CytoSelect 24-brønnen celle invasjon analysen kit (Cell BIOLAB, San Diego, CA) i henhold til produsentens instruksjoner. Transfekterte celler ble resuspendert i kulturmedium uten FBS og plassert i det øvre kammer i tre eksemplarer. Etter 48 timers inkubasjon ved 37
o C (5% CO2), ble cellene migrerer gjennom membranen farget. Resultatene ble uttrykt som invaderte celler kvantifisert ved OD 560nm. Såret helbredelsesprosessen begynner med vev matrix ombygging, migrering og eventuell lukking av såret området. Derfor er denne analysen blir ofte brukt for vurdering av kreftcellemigrering. Sårheling Analysen ble utført med CytoSelect 24-brønnen til sårbehandling analysesett i henhold til produsentens instruksjoner. For å generere et viklet felt, transfekterte celler ble dyrket inntil de dannet et monolag rundt innsatsen. Etter fjerning av innsatsen, ble en 0,9 mm åpent sår felt som genereres og cellene ble tillatt å migrere fra hver sin side av gapet. Lukking av sår ble målt og prosent lukke ble målt. [Prosent lukkefrekvens (%) = migrerte celle overflateareal /totalt overflateareal x100)].
apoptose Analyser
Celler (48 timer etter transfeksjon) ble vasket to ganger med 1XPBS og trypsinisert. Etter inaktivering av trypsin i fullstendig medium, ble cellene resuspendert i iskald 1 x bindingsbuffer (70 ul). Annexin V-FITC-løsning (10 ul) og 7-AAD levedyktighet fargestoff (20 ul) ble tilsatt til 70 ul av cellesuspensjoner. Etter inkubering i 15 minutter i mørket, 400 ul iskald 1x bindingsbuffer ble tilsatt. Den apoptotiske fordelingen av cellene i hver prøve ble deretter bestemt ved anvendelse av en FACS (Cell Lab QUANTA SC, Beckman Coulter, Fullerton, CA). Data er gjennomsnitt ± S.D. av fire uavhengige forsøk.
Plasmid Bygg og 3’UTR-Luciferase Assay
Vi konstruerte individuelle plasmider for hvert bindingssete i 3’UTR av mRNA fra potensielle mål gener basert på microRNA.org informasjon. Da fikk vi bekreftet MIR-182-5p binding til målgener mRNA 3’UTR av luciferase assay med MIR-182-5p forløper. PmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor ble brukt til å utføre 3’UTR luciferase assay (Promega, Madison, WI, USA). Primersekvensene som brukes til plasmid innsatser er vist i tabell 1. I et totalvolum på 20 ul, 5 ul av hver av 100 uM forover primer og revers primer, 2 ul av 10 x annealing-buffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 M NaCl, 10 mM EDTA) og 8 ul vann ble tilsatt til en 200 ul PCR-rør og inkubert ved 95 ° C i 5 minutter og deretter plassert i romtemperatur i 1 time. Oligonukleotidene ble ligert inn i
PME
I-
Xba
jeg stedet pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target Ekspresionsvektor. Colony direkte PCR ble utført for innsatsen anerkjennelse bruker REDTaq (Sigma, St. Louis, MO, USA). Primerne anvendt for PCR var som følger: forover primer, 5′-cgtgctggaacacggtaaaa-3 «; revers primer, 5»-gcagccaactcagcttcctt-3 «. PCR-parametrene for sykling var som følger: 94 ° C i 3 minutter, 30 sykluser med PCR ved 94 ° C i 30 sekunder, 55 ° C i 30 sekunder og 72 ° C i 30 sekunder, 72 ° C i 10 minutter og 4 ° C i 10 minutter. PCR-produktet ble kuttet med Noti (Takara /Fisher Scientific,
Pittsburgh
,
PA, USA
). Størrelsen på vektorene inneholdende innskuddene var omtrent 200 bp og 100 bp ved hjelp av elektroforese siden NotI gjenkjenningssekvensen ble innlemmet i primerne. For MIR-182-5p forløper transfeksjon, blære kreft celler ble ko-transfektert med MIR-NC og pmirGLO eller MIR-182-5p og pmirGLO Dual-Luciferase miRNA Target ekspresjonsvektorer bruker Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Luciferase aktivitet ble vurdert ved hjelp av Dual-Luciferase® Reporter analysesystem (Promega) (48 timer etter deres transfeksjon).
Overuttrykte Plasmid av målgener (RECK, Smad4) og Funksjonelle analyser
for å konstruere målgen (RECK, Smad4) over uttrykker plasmider, ble gener amplifisert med total RNA fra human voksen normale nyrevev (katalog #: R1234142-50, Biochain Institute, Newark, CA) og RWPE-1 etter transkripsjon-polymerasekjedereaksjon (RT-PCR). Sekvensene til primerne for kloning er vist i Tabell 1. polymerasekjedereaksjon produkter ble klonet inn i pTargeT-pattedyrekspresjonsvektor System (Promega, Madison, WI). Deretter pCMV6-RECK eller pCMV6-Smad4 ble oppnådd ved subkloning et NheI-XhoI fragmentet fra pTargeT-RECK /Smad4 inn i NheI-XhoI stedet pCMV6-Entry Vector.
I utgangspunktet vi transfektert pCMV6-tom og pCMV6- RECK eller -Smad4 inn blære kreftceller og RNA og protein ble hentet. Overekspresjon av RECK eller Smad4 ble bekreftet av real time RT-PCR og Western Blot analyse og funksjonelle analyser ble utført.
Kvantitativ Real-time RT-PCR
kvantitativ real-time RT-PCR var utført i tre eksemplarer med en Applied Biosystems Prism 7500 Fast Sequence Detection System bruker TaqMan universell PCR Master mix henhold til produksjon protokoll (Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA). De TaqMan prober og primere ble kjøpt fra Applied Biosystems. Menneskelig GAPDH og RNU48 ble anvendt som en endogen kontroll. Nivåer av RNA uttrykk ble bestemt å bruke 7500 Fast System SDS programvareversjon 1.3.1 (Applied Biosystems).
Western Analyse
Totalt celle protein (15-20 mikrogram) ble benyttet for Western blotting . Prøvene ble løst i 4-20% Nøyaktige Protein Gel (Thermo Scientific, Rockford, IL) og overført til PVDF membraner (Amersham Biosciences, Fairfield, CT). Membranene ble neddykket i 0,3% skummet melk i TBS inneholdende 0,1% Tween 20 i 1 time og probet over natten ved 4 4 ° C med primært polyklonalt og monoklonalt antistoff mot Smad4 (# 9515), RECK (# 3433), beta-catenin ( # 9562), CREB (# 9197) og beta-tubulin (# 2128) fra Cell Signaling Technology, Beverly, MA. Blottene ble vasket i TBS inneholdende 0,1% Tween 20 og merket med pepperrot peroksidase (HRP) -konjugert sekundær anti-mus eller anti-kanin-antistoff (Cell Signaling Technology, Beverly, MA). Proteiner ble forsterket av kjemiluminescens (Amersham ECL pluss Western Blotting deteksjonssystem, Fairfield, CT) for visualisering. Protein uttrykk nivåer ble uttrykt i forhold til beta-tubulin eller CREB nivåer
Statistical Analysis
Alle statistiske analyser ble utført ved hjelp av Statview. (Versjon 5, SAS Institute Inc., NC). En
p
-verdi av 0,05 ble ansett som statistisk signifikant
Takk
Vi takker Dr. Roger Erickson for hans støtte og hjelp i forbindelse med utarbeidelsen av manuskriptet. .
