Abstract
Bakgrunn
Forstå drivere for metastaser i menneskelig kreft er viktig for potensiell utvikling av terapi for å behandle metastaser. Rollen til tap av TGFB tumor suppressor aktiviteter i metastatisk prosessen er i hovedsak ukjent.
Metodikk /hovedfunnene
Utnytte
in vitro Hotell og
in vivo
teknikker, har vi vist at tap av TGFB tumor suppressor signalering nødvendig for at siste trinnet i metastatisk prosess – kolonisering av metastatisk nettstedet. Dette arbeidet demonstrerer for første gang at TGFp-reseptoren rekonstituering fører til redusert metastatisk kolonisering. Videre har vi identifisert en roman TGFB /PKA tumor suppressor sti som virker direkte på en kjent celle overlevelse mekanisme som reagerer på stress med survivin /XIAP avhengig hemming av caspases den effekten apoptose. Koblingen mellom den TGFp /PKA transduceome signalisering og kontroll av metastasering gjennom induksjon av celledød ble vist ved TGFp-reseptor restaurering med reaktivering av TGFp /PKA reaksjonsveien i reseptor-mangelfulle metastatiske tykktarmskreftceller som fører til kontroll av avvikende celleoverlevelse.
Konklusjon /Betydning
Dette arbeid påvirker vår forståelse av mulige mekanismer som er avgjørende for vekst og vedlikehold av metastaser, samt forståelse av en roman TGFB funksjon som en metastatisk lyddemper. Disse resultatene øke muligheten for at regenereringen av svekkede TGFp-signalering vil være et effektivt mål ved behandling av metastase. Vårt arbeid viser det kliniske potensialet for å utvikle anti-metastaser terapi basert på hemming av denne svært viktige avvikende celleoverlevelsesmekanisme av det mangefasetterte TGFB /PKA transduceome indusert veien. Utvikling av effektive behandlinger for metastatisk sykdom er et presserende behov siden metastaser er den viktigste dødsårsaken i solide tumorer
Citation. Chowdhury S, Howell GM, Rajput A, Teggart CA, Brattain LE, Weber HR, et al. (2011) Identifisering av en roman TGFB /PKA signalnettverk Transduceome i formidling Kontroll av Cell Survival og metastaser i Colon Cancer. PLoS ONE 6 (5): e19335. doi: 10,1371 /journal.pone.0019335
Redaktør: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, USA
mottatt: 18 februar 2011; Godkjent: 27 mars 2011; Publisert: 03.05.2011
Copyright: © 2011 Chowdhury et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health gir CA72001 og CA38173 til MGB. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
tykktarms~~POS=TRUNC kreft~~POS=HEADCOMP (CRC) er en av de vanligste kreftformer med høy forekomst globalt [1] og er den nest høyeste årsaken til kreft dødsfall blant voksne i Norge [2] statene. CRC kan kureres ved hjelp av kirurgi og multimodal behandling i omtrent halvparten av personer med denne sykdommen (Stages I-III). Imidlertid er metastaser til fjerne organer (trinn IV) den hyppigste årsaken til behandlingssvikt [2]. Nyere arbeider har understreket på betydningen av utviklingen av upassende celle overlevelse signalering for ulike trinn i metastatisk prosess. Spesielt bemerkelsesverdig i sammenheng med overlevelse signalering i den metastatiske prosess er betydningen av avvikende celleoverlevelse til vellykket kolonisering på metastaser i fjerntliggende organer [3]. Viktigere er molekylære mekanismene som er involvert i den tidlige fasen av metastase kritisk for diagnose og terapi ikke godt forstått [1]. Flere viktige spillere inkludert Bcl-2 inhibitor-of-apoptose (IAP) proteiner XIAP og Survivin, og den fosfoinositid 3-kinase (PI3K) – AKT /PKB som overfører anti-apoptotiske signaler i å fremme veksten av kreft celler har vært implisert i metastase [4], [5].
tumorsuppressorgener (TSG) bidra til induksjon av apoptose i respons på stress. Unnlatelse av å indusere apoptose i respons på ulike typer celleskader har vært lenge anerkjent som bidrar til onkogenese. Et eksempel på TSG tap bidrar til kreft-dannelse og progresjon er TGFp signale [2]. Den TGFp signalveien har bidratt både negativt og positivt i å regulere veksthemming, proliferasjon, replikasjon, invasjon, metastase, apoptose, immunovervåkning og angiogenese i en kontekstavhengig måte [6]. TGFB hemmende /tumorsupressorproteinene svar er redusert med økende progresjon og i sent stadium maligniteter er ofte skadet på en måte som støtter invasjon og metastase [6]. Mens korrupsjon av TGFp responser for å støtte metastasering innebærer tilstedeværelse av funksjonelle reseptorer i disse cellene, er det like klart at det er et betydelig antall modeller fra transgene mus til humane kreft xenografter som indikerer at tap eller dempning, av reseptor-ekspresjon i en bred ulike tumortyper fører til økt malignitet [7], [8], [9], [10]. Disse resultatene tyder på at noen undergrupper av kreft har fulgt en sti mot ondartet progresjon involverer tap av TGFB reseptor uttrykk, mens andre har, i en ennå ikke bestemt måte, tilranet TGFfi signale å kjøre ondartet progresjon. Det finnes flere eksempler på TGFB reseptor stanse i kliniske prøver som viser at TGFB reseptor RI og /eller RII (utpekt TGFβRI og TGFβRII henholdsvis) downregulation er tidlige hendelser i onkogenese og at tap av reseptor uttrykk ved epigenetisk lyddemping korrelerer til ondartet progresjon i undergrupper av flere typer kreft [11], [12].
Vi har vist at TGFp signalering i et tidlig stadium ikke-metastaserende kolonkarsinom modell fører til celledød i tykktarmskreftceller som respons på stress i forbindelse med inaktivering av pakt og inhibering av ekspresjonen av IAP-proteinet survivin [13]. Kompleksdannelse mellom survivin og annen IAP protein XIAP i cytoplasma som svar på stress gjør at stabilisering av XIAP og hemming av sine effektor og bøddel caspase mål å hemme celledød [14]. Derfor, gitt den dominerende rollen PI3K /AKT signalering i celleoverlevelsesmekanismer og foreningen av XIAP og survivin i kreft progresjon [5], hevdet vi at tap av TGFB signale kan bidra til økt XIAP /survivin uttrykk og dermed tap av TGFB signale kan være en nøkkel til en avvikende overlevelsesmekanisme som tillater metastatisk vekst på distale organ steder i kontrast til dagens oppfatning at TGFB TSG er først og fremst en gatekeeper for å hindre onkogenese.
TGFB signalering har vist seg å aktivere Camp- avhengig Protein kinase A (PKA) [15]. PKA spiller en dominerende rolle i integrering av flere signaloverføringsnett [16] inkludert muligheten for å forstyrre XIAP /survivin komplekse gjennom fosforylering av survivin på Ser
20 [17].
De molekylære mekanismene som er involvert i TGFp mediert nedregulering av IAP ble undersøkt for å bestemme effektene av TGFp reseptorsignalisering på metastase i en metastatisk ortotopisk modell av colon carcinoma. Vi rapporterer nå identifisering av en roman TGFB /PKA /AKAP mediert transduceome som konvergerer på XIAP funksjon i å kontrollere avvikende celleoverlevelse. I tillegg har vi vist at TGFB reseptor redning i svært metastatiske celler med epigenetisk stanse av TGFB reseptorer fører til redusert metastaser i en TGFB /PKA signalveien avhengig mekanisme i en svært metastatisk ortotopiske tykktarmskreft modeller in vivo. Rescue av spesifikke tumor suppressor aspekter av TGFB signalveien kan gi terapeutiske fordeler uten å fremme celleoverlevelse og metastatiske effekten av TGFB. Hvis disse TGFB tumor suppressor effekter kan etterlignet i sent stadium svulster, kan til slutt bli innhentet. Terapeutisk verdi mot metastatisk CRC
Resultater
TGFB aktiverer PKA i tykktarm kreft celler
En kritisk rapport fra Simeone laboratorium bemerket at TGFB signale aktiverer PKA i Mv1Lu celler og formidler kontroll av TGFB veksthemmende tiltak [15]. TGFp aktivering av PKA ble formidlet av en Smad avhengig, syklisk AMP (cAMP)-uavhengig mekanisme. Dette tatt opp muligheten for at TGFp aliserte mediert kontroll av avvikende celle overlevelse observert i tidlig stadium TGFp-sensitive FET colon carcinoma modellen, kan det innebære aktivering av PKA. Vi antok at TGFB aktiverer PKA i FET celler i en cAMP uavhengig, Smad avhengig mekanisme. For dette formål ble FET-celler behandlet med TGFp (5 ng /ml) i angitte tider, og en protein kinase assay ble utført for å måle PKA-aktivitet (figur 1A). Etter TGFfi behandling, øket PKA aktivitet med omtrent to ganger i løpet av 15 min og 4 ganger i 1 time. Det ble observert at TGFp-mediert aktivering PKA ble fullstendig opphevet etter forbehandling av celler med H89 (15 uM), et farmakologisk PKA-inhibitor [15]. TGFp-mediert aktivering av PKA var også konsentrasjonsavhengig (figur 1B) med maksimal aktivitet i FET-celler observert ved 5 ng /ml TGFp. For å bekrefte at aktivering av PKA var nedstrøms av Smad aktivering av TGFp, observerte vi at forbehandling med H89 hadde ingen effekt på fosforylering av Smad2 ved hjelp av TGFp immunoblotanalyse (Fig S1). Vi utviklet stabil PKA katalytisk α-subenheten shRNA knockdown i FET celler (betegnet FET PKACatα KD) for å validere H89 respons genetisk (figur S2). TGFB behandling for de angitte tider var ute av stand til å aktivere PKA i knockdown celler i motsetning til robust aktivering i foreldre FET celler (figur 1C). Aktivering av PKA av TGFp har vist seg å være cAMP uavhengig i Mv1Lu celler [15]. Classical PKA aktivering innebærer cAMP binding til regulatoriske subenheter av PKA å utløse dissosiasjon av de katalytiske underenhetene. En alternativ mekanisme for PKA aktivering innebærer sammenslutning av IKB med PKA katalytiske subenheter, og dermed opprettholde en inaktiv tilstand av PKA. Ved IKB degradering, er aktivering av PKA uavhengig av cAMP-aktivering [18]. Vi avgjort om aktivering av PKA av TGFB er avhengig av cAMP-aktivering i FET celler ved å behandle celler med TGFB og måling av cAMP-nivåer ved hjelp av en ikke-radioaktive cAMP enzym immunoassay (figur 1D). Det ble observert at TGFp var ute av stand til å øke cAMP-produksjonen i motsetning til Forskolin behandling som ga en betydelig økning i cAMP-nivåer som forventet. Deretter undersøkte vi IkB protein følgende TGFp behandling for bestemte tidspunkter for å bestemme hvorvidt aktivering av PKA av TGFp var på grunn av IkB degradering (figur S3). De IKB nivåer forble uendret etter TGFB behandling. Derfor er PKA aktiveres ved TGFB i en leir og IKB uavhengig måte i FET celler i samsvar med rapporten fra Zhang et al (2004). For ytterligere å bekrefte den funksjonelle betydning av TGFp mediert PKA-aktivering, ble transkripsjonsfaktor CREB testet, som har blitt identifisert som et direkte mål for den cAMP-PKA signalveien [15]. Vi observerte at TGFp var i stand til å stimulere fosforylering av CREB (figur 1E) uten endring i den totale CREB nivåene (data ikke vist). Forbehandling av celler med H89 etterfulgt av TGFp eksponering betydelig redusert fosforylering av CREB. Zhang et al (2004) understreket betydningen av aktivt Smad3 i TGFB mediert PKA aktivering. Vi utviklet stabil shRNA Smad3 knockdown i FET celler (betegnet FET Smad3KD) (figur S4). TGFp behandling på følgende Smad3 knockdown-celler var ikke i stand til å aktivere PKA (figur 1F) som indikerer til avhengigheten av TGFp mediert PKA-slag ved Smad3 som rapportert tidligere [15].
FET-celler behandlet med TGFp (5 ng /ml ) aktivert PKA i en tid (A) og konsentrasjon (B) avhengig måte. PKA-inhibitor H89 (15 uM) ble anvendt for å hemme PKA aktivering. Forskolin (10 uM) ble anvendt som en positiv kontroll. Sammenligning av foreldrenes FET og FET PKACatα KD celler til TGFp-mediert aktivering PKA (C). Knockdown av katalytisk α-subenhet opphevet PKA aktivering av TGFp. PKA aktivering av TGFp er uavhengig av cAMP-generering som bestemt ved cAMP-analysen (D). TGFp fører til CREB aktivering i FET-celler (E). Actin ble brukt som lasting kontroll for vestlige blotter. PKA aktivering av TGFp er Smad3 avhengig som bestemt ved knockdown av Smad3 i FET-celler (F). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt verdier ± S.E.M. (n = 3). Alle forsøk har blitt gjentatt tre ganger uavhengig av hverandre.
TGFB /PKA signale mediert XIAP downregulation
XIAP og survivin er godt karakteriserte IAP familiemedlemmer nylig dokumentert metastatisk gener [5]. Deres felles rolle i å fremme celle overlevelse og metastasering gir en sterk begrunnelse for å målrette ekspresjon og /eller aktivitet av disse tilgangspunkter i avanserte stadier av kreft. En tidlig begivenhet i forbindelse med PKA aktivering er fosforylering av Survivin på Ser
20 i cytosol, men ikke i mitokondriene [17]. Denne fosforyleringen av Survivin har vist seg å forstyrre bindingen grensesnitt for XIAP, som fører til XIAP degradering. Våre data samt tidligere rapporter tyder på at PKA aktivering responsen er en tidlig reaksjon etter TGFB behandling, og det oppnår maksimal nivåer innen 1 time av TGFB behandling. Vi antok at TGFB fører til en frigjøring av avvikende celleoverlevelse ved å stimulere PKA-mediert forstyrrelse av XIAP /Survivin kompleks. FET celler ble behandlet med TGFB for de angitte tider etterfulgt av bestemmelse av XIAP og survivin (figur 2A og S5). TGFB behandling nedregulert både XIAP og survivin ved de angitte tider. Som survivin fosforylering har allerede vist seg å være knyttet til PKA aktivering, fokuserte vi vår oppmerksomhet på regulering av XIAP. Nedbrytning av XIAP ble blokkert av H89 forbehandling før TGFB eksponering for de angitte ganger (figur 2B). For å undersøke spesifisiteten av respons, sammenlignet vi effekten av TGFp på FET PKACatα KD-celler og paren FET-celler (figur 2C). TGFp-behandling ikke hadde noen effekt på XIAP proteinnivåer i FET PKACatα KD-celler som viser avhengigheten av PKA katalytiske subenheten i TGFp-mediert tap av XIAP protein. For å bekrefte spesifisiteten av TGFB /PKA vei i dette svaret, ble FET Smad3 KD celler behandlet med TGFB for de angitte tider og XIAP protein ble bestemt (figur 2D). I samsvar med den Smad3 avhengighet av TGFB mediert PKA aktivering, stabil shRNA knockdown av Smad3 avskaffet XIAP downregulation. En proteasomal inhibitor (MG132) ble anvendt for å bestemme hvorvidt tap av XIAP var avhengig proteasomal nedbrytning (figur 2E). Det ble observert at forbehandling av FET-celler med MG132 (15 uM) i 1 time før behandling TGFp fullstendig avskaffet XIAP nedbrytningen indikerer at XIAP blir degradert i løpet av proteasomet. PKA er en viktig regulator av proteasomal aktivitet og PKA har vist seg å co-rense med proteasomet [19], [20]. Vi antok at TGFB /PKA-mediert regulering av proteasomal aktivitet kan gi et ekstra lag med kontroll av IAP uttrykk (utover PKA indusert fosforylering av survivin på Ser
20). Tidligere rapporter viser at PKA fosforylerer den Rpt6 ATPase, som utfolder seg og transporterer substrater til proteasome og dette fosforylering forbedrer kymotrypsin proteasomal aktiviteter proteasome [21]. For å oppnå dette, fastslått hvorvidt vi TGFp-mediert aktivering PKA er i stand til å øke den chymotrypsin-lignende proteasomal aktivitet ved anvendelse av en proteasomal aktivitetsanalyse. TGFp behandling av FET-celler selektivt stimulerte chymotrypsin-lignende aktivitet av proteosomet innen 1 time (figur 2F). H89 forbehandling før TGFp eksponering fullstendig avskaffet basalnivået av den proteasomal chymotrypsin-lignende aktivitet og fullstendig opphevet de stimulerende virkninger av TGFp på proteasomet.
TGFp (5 ng /ml) behandling for angitte tidspunkter nedregulerer XIAP i FET-celler (A) og denne virkning er mediert av PKA som forbehandling med PKA inhibitor H89 før TGFp eksponering opphever XIAP tap (B). Stabil shRNA knockdown av PKA katalytisk subenhet i FET celler fører til opphevelse av XIAP tap (C). Stabil shRNA knockdown av Smad3 fører til opphevelse av XIAP tap i FET celler (D). TGFB (5 ng /ml) mediert XIAP downregulation er en proteasomal hendelse. Forbehandling med proteasomal inhibitor MG132 (15 mm) opphevet XIAP tap av TGFB (E). TGFp-mediert aktivering av PKA fører til aktivering av chymotrypsin-aktivitet innenfor proteasomet, og denne virkning er opphevet ved H89 (F). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt verdier ± S.E.M. (n = 3). Actin ble brukt som lasting kontroll for vestlige blotter. Alle forsøk har blitt gjentatt tre ganger uavhengig av hverandre.
Sammen er disse dataene føre til hypotesen om at TGFB /PKA signal regulerer XIAP uttrykk på flere nivåer med aktivering av PKA fører til fosforylering av nøkkel proteasomal komponenter som fremme proteasomal nedbrytning av XIAP.
AKAP regulerer TGFB /PKA mediert XIAP downregulation
det er en overflod av A-kinase forankring proteiner (AKAPs) som compartmentalize PKA og andre enzymer til nærhet av spesifikke cellulære organeller for gjennomføring av enzymfunksjon. Vi antok at AKAPs er en kritisk komponent i TGFB /PKA mediert XIAP downregulation. Det er godt dokumentert at subcellulære lokalisering av PKA regulatoriske subenheter (PKARI og /eller PKARII) formidles gjennom interaksjon med AKAPs [22]. AKAP inhibitor Ht31, har et syntetisk peptid thyroid forankring har vist seg å være en meget potent konkurrerende inhibitor av PKARII /AKAP interaksjon, for derved å forhindre PKA forankring [23]. For å sikre at Ht31 var spesielt rettet mot AKAP-PKA interaksjoner, utførte vi PKA aktivitetsanalyser på FET celler for å fastslå omfanget av PKA aktivering etter forbehandling med Ht31 (25 mm) før TGFB eksponering (figur 3A). Etter avtale med tidligere studier [15], Ht31 var i stand til å blokkere TGFB mediert PKA aktivering. Siden AKAP-PKA samhandling synes å være en forutsetning for TGFB mediert PKA aktivering, begrunnet vi at disse interaksjonene kan også være nødvendig for nedstrøms signal hendelser som førte til XIAP tap (figur 3B). Tilsetning av Ht31inhibitor i 1 time før TGFp behandling for angitte tider fullstendig avskaffet XIAP tap.
AKAP inhibitor Ht31 (25 uM) behandling i 1 time før eksponeringen TGFp opphever TGFp mediert PKA aktivitet (A) og TGFp mediert XIAP tap (B). AKAP149 siRNA knockdown ble gjort på FET-celler (C). Knockdown av AKAP149 fører til oppheving av TGFp mediert PKA aktivitet (D) og XIAP nedregulering (E). Resultatene er uttrykt som gjennomsnitt verdier ± S.E.M. (n = 3). Actin ble brukt som lasting kontroll for vestlige blotter. Alle forsøk har blitt gjentatt tre ganger uavhengig av hverandre.
Siden AKAP familien omfatter mer enn 50 medlemmer [24], var utfordringen å identifisere et individ AKAP som var å svare på de TGFB /PKA effekter på XIAP . Etter innledende screening for forekomst av ulike AKAP familiemedlemmer i Fet celler, fant vi AKAP149 protein uttrykk i disse tykktarmskreftceller. AKAP149 (også betegnet D-AKAP1 og AKAP121 i mus) har blitt identifisert som et membranprotein i mitokondriene [25]. Det har blitt rapportert at mitokondrie AKAP121 er involvert i målretting cAMP aktivert PKA til den ytre mitokondriemembranen (OMM) og spiller en rolle i mitokondriell biogenese og overlevelse [26]. Vi hypotese basert på den forståelse at mitokondrie XIAP og survivin flytte til cytoplasma etter en stressrespons som AKAP149 kan regulere TGFB /PKA mediert XIAP degradering. Ekspresjon av en AKAP149 liten interfererende RNA (siRNA) forhindret at TGFp-mediert aktivering PKA (figur 3C-D). Videre observerte vi at TGFB var ute av stand til å nedregulere XIAP protein i AKAP149 siRNA knockdown celler i forhold til foreldre FET kontrollceller (Figur 3E). Dette pro-apoptotiske funksjon av AKAP149 er i kontrast til den kjente funksjon av mitokondriell AKAP121 (eller dets human homolog AKAP149) for å fremme overlevelse.
neste spørsmål ved om effekten av AKAP149 var selektiv i denne TGFp /PKA virkning . Mens AKAP-PKA samhandling er et globalt fenomen, validering av AKAP149 som selektivt å regulere TGFB /PKA signal ville være en roman utvidelse av vår forståelse av TGFB /PKA mediert XIAP downregulation. AKAP220 har vist seg å regulere proteinfosfatase 1 (PP1) aktivitet ved å koordinere plassering av PKA og PP1 katalytisk subenhet [27]. Vi forstummet uttrykk for AKAP220 i FET celler med AKAP220 siRNA. Disse transfekterte celler når behandlet med TGFp hadde ingen effekt verken på induksjon av PKA aktivitet eller XIAP downregulation (data ikke vist). Til sammen spiller AKAP stillas en sentral rolle i TGFB /PKA sti mediert XIAP downregulation med mitokondrie lokalisert AKAP149 er nødvendig for TGFB /PKA-mediert reaksjon.
Involvering av PP2A i TGFB /PKA mediert XIAP downregulation
det har blitt observert at aktivering av PKA fører til inaktivering av AKT ved defosforylering av proteinfosfatase 2A (PP2A) [28]. Dette har ført til hypotesen om at TGFp-mediert aktivering av PKA er ansvarlig for undertrykkelse av AKT-aktivering som vi tidligere har rapportert som en konsekvens av TGFp signalering [13]. Derfor fant vi ut PP2A aktivitet i FET celler (Figur 4A). TGFB behandling for bestemte tidspunkter økt PP2A aktiviteten betydelig. PP2A selektiv inhibitor okadainsyre (OA, 50 nM) var i stand til fullstendig oppheve PP2A aktivering når det behandles alene eller forbehandlet før TGFp eksponering. Deretter testet vi den rollen TGFB i formidling AKT inaktivering og XIAP tap (figur 4B). Det ble observert at TGFp mediert defosforylering av AKT er PP2A avhengig som reflekteres ved evnen til OA til å blokkere TGFp mediert defosforylering av AKT. XIAP downregulation ble også avskaffet av OA behandling. Selv om PP2A er en tumor suppressor involvert i kontrollen av flere celleoverlevelsesreaksjonsveier [29], er dokumentasjon av en rolle i nedbryte celleoverlevelse signalering innenfor TGFp pathway en ny utvidelse av PP2A funksjon.
FET-celler ble behandlet med TGFp (5 ng /ml) i den angitte tid og PP2A-aktivitet ble bestemt ved bruk av PP2A aktivitet analyseprotokollen som beskrevet i materialer og metoder (A). PP2A inhibitor okadainsyre (OA, 50 nM) ble anvendt for å hemme PP2A. Forbehandling med OA før TGFB (5 ng /ml) behandling avskaffet TGFB mediert XIAP tap og defosforylering av AKT (B). Stabil shRNA knockdown av PP2A katalytisk α-subenhet ble gjort på FET-celler (C). Knockdown av PP2A katalytisk α-subenhet har ført til opphevelse av TGFp (5 ng /ml) mediert XIAP nedregulering uten å påvirke PKA aktivitet (D-E). XIAP immunoutfellingsstudier i FET-celler behandlet med TGFp (5 ng /ml) eller forbehandlet med H89 eller Ht31 i 1 time før eksponering TGFp. XIAP dissosierer fra Pakt følgende TGFB behandling for angitt tid (F). Hemme PKA aktivitet ved H89 eller AKAP-PKA interaksjon med Ht31 opphever den TGFB mediert XIAP-Pakt dissosiasjon.
For å validere ytterligere rolle PP2A i TGFB /PKA signal, vi genererte stabil shRNA PP2A katalytisk subenheten knockdown i FET celler utpekt FET PP2A Cat KD (Figur 4C). TGFB behandling av FET PP2A Cat KD celler viste PKA aktivering indikerer at PKA aktivering er oppstrøms PP2A aktivering (Figur 4D). Men stabil shRNA knockdown av PP2A katalytiske subenheten fullstendig avskaffet TGFB mediert XIAP hemming og viste vedvarende fosforylering av AKT også (Figur 4E). FET PKACatα KD celler behandlet med TGFp viste også en vedvarende fosforylering av AKT (data ikke vist).
Mens inhibering av AKT-aktivering vil ha potensiale for mange effekter på celle overlevelse, en effekt som er av spesiell interesse som er relatert til TGFB /PKA funksjon er i sammenheng med at den er rettet mot XIAP stabilitet. En tidligere studie rapporterte at XIAP blir fosforylert av AKT på Ser
87 som fører til økt stabilisering av XIAP og redusert apoptose av eggstokkreft celler i respons til cisplatin [30]. Vi tenkte at PP2A hemming av AKT aktivitet kan representere en ekstra mekanisme for avbrudd av stabilisering av XIAP som er målrettet av TGFB /PKA vei gjennom forbedring av PP2A aktivitet. For dette formål ble FET-celler behandlet med TGFp eller forbehandlet med forskjellige TGFp /PKA pathway inhibitorer før TGFp eksponering for bestemte tidspunkter og immunoutfelt for XIAP og immunoblottet for mulige proteiner bundet til XIAP. Vi fant en sammenslutning av XIAP med Pakt (figur 4F). Etter TGFfi behandling, var det en betydelig dissosiering av XIAP-pakt kompleks. Men forbehandling med H89 eller Ht31 før TGFB eksponering helt avskaffet XIAP-Pakt dissosiasjon av de to proteinene indikerer at TGFB /PKA signalnettverk mediert inaktivering av AKT destabiliserer XIAP som fører til proteasomal degradering. Derfor bruker hemmer og stabil knockdown studier, understreker vi romanen funn at TGFB /PKA signal formidler tap av XIAP protein av en PKA-PP2A avhengig undertrykkelse av AKT aktivering fører til XIAP tap.
TGFB reseptor tilberedning fører til redusert metastatisk kolonisering: Virkning på TGFp /PKA aliserte
Vi har utviklet teknologi for ortotopisk colonic implantering av humane tarmkreft linjer i atymiske mus som gjør det mulig for reproduserbar kvantitativ analyse av metastaser til lever og lunger [31], [ ,,,0],32], [33]. Den metastatisk mønsteret som vises i denne modellen systemet gjenspeiler innholdet i metastatisk spredning hos mennesker. Meget metastatisk GEO tykktarm kreft celler ble brukt til videre forstå virkningen av TGFB /PKA signalnettverk på metastasering. GEO cellene har dempet TGFβRI uttrykk og dermed dempes TGFB tumor suppressor signalering samt [8]. Vi har benyttet colonic ortotopisk implantering av subkutant dyrket xenotransplantater å karakter faktorer som påvirker graden av metastaser til lever og lunger uten å påvirke invasjon i den primære tumorstedet [31], [33]. GEO-celler ble funnet å være svært metastatiske i dette ortotopisk modell som reflekteres av metastatisk kolonisering i 53% av de implanterte dyr (tabell 1). Redning av reseptor dempning i GEO-celler ved transfeksjon av en TGFβRI ekspresjonsvektor (betegnet GEORI) resulterte i reduksjon av metastatisk forekomsten til omtrent 20% av dyrene implantert uten å påvirke invasjon ved den primære området som både GEO og GEORI transfekterte dyr som ga opphav til en invasive primær tumor i 100% av implanterte dyr. GEO transplanterte dyr utviklet robust levermetastaser sammenlignet GEORI (figur 5A). Hematoxylin og eosin (H E farging viser levermetastaser (B). Sammenligning av primærtumor deler av GEO og GEORI mus ved TUNEL analysen flekker som nevnt i materialer og metoder for å bestemme deres apoptotiske priser (C). De apoptotiske priser ble kvantifisert (D). Sammenligning av primærtumor deler av GEO og GEORI mus ved Ki-67 flekker som nevnt i materialer og metoder for å bestemme sine priser av spredning (E). De spredning priser ble kvantifisert (F). TGFp-reseptor rekonstituering fører til en endring i PKA aktivitet. Sammenligning av PKA aktivitet i svært metastatiske GEO celler kontra dårlig metastatiske GEORI celler (G) og i svært metastatiske CBS celler kontra dårlig metastatiske CBSRII celler (H). Sammenligning av TGFp (5 ng /ml) eksponering mellom GEO og GEORI celler (I) og CBS og CBSRII celler (J). PKA inhibitor H89 avskaffet TGFB mediert XIAP tap i GEORI og CBSRII celler (K).
En nøkkel til å utnytte den undertrykkelse av metastase ved TGFB signalering er klarlegging av den molekylære mekanismen som metastase er hemmet. Basert på nedgangen i metastatisk forekomst med TGFB reseptor tilberedning fører til redning av TGFfi signalering, hypotese vi at TGFB /PKA mediert XIAP downregulation krever en intakt TGFB signale mekanisme som går tapt i høyt metastatiske GEO celler. Men redningen av TGFfi signale av reseptor rekonstituering i GEORI celler fører til redusert metastatisk forekomsten bør øke TGFB /PKA signal og nedstrøms effekter på XIAP. GEO celler med svekket TGFB signale hadde ingen PKA aktivering med TGFB eksponering (Figur 5G). Imidlertid GEORI celler med funksjonell TGFp signalering på grunn av reseptor rekonstituering hadde en sterk økning av PKA aktivering av TGFp som var omtrent fire ganger høyere enn kontrollen. En andre colon carcinoma cellelinje (CBS celler) med svekket TGFβRII signalering [34] viste også redusert metastaser etter redning av reseptor-mangel (data ikke vist). En lignende respons i PKA aktivitet ble observert i svært metastatiske CBS celler sammenlignet med dårlig metastatiske CBSRII celler etter TGFB behandling in vitro (Figur 5H).
Etter denne observasjonen vi en hypotese om at den svært metastatisk GEO og CBS celler ville være motstandsdyktige mot TGFp /PKA signale mediert tap av XIAP protein. Vi tenkte at manglende evne til TGFB aliserte til indusere PKA aktivering i disse cellene på grunn av reseptor inaktivering vil også forhindre nedstrøms effekter på XIAP dermed gjøre disse cellene mer metastatisk gjennom økt pro-overlevelse signalering. Mens GEO og CBS begge viste ingen reaksjon på TGFB behandling ved gitte tider (figur 5I-J), GEORI og CBSRII celler viste XIAP downregulation for lignende behandlinger (Figur 5I-J).
