Abstract
Nikotin er et kjent risikofaktor for utvikling av kreft og har vært vist å endre genekspresjon i cellene og vev etter eksponering. Vi brukte Illumina® Next Generation Sequencing (NGS) teknologi for å få objektiv biologisk innsikt i transkriptomet av normale epitelceller (MCF-10A) til nikotin eksponering. Vi ga uttrykk data fra 54,699 transkripsjoner bruker triplicates av kontroll og nikotin stresset celler. Som et resultat, har vi identifisert 138 forskjellig uttrykt transkripsjoner, inkludert 39 uncharacterized gener. I tillegg 173 transkripsjoner som primært knyttet til DNA-replikasjon, rekombinasjon og reparasjon viste bevis for alternativ spleising. Vi oppdaget den største nikotin stressrespons ved HPCAL4 (oppregulert med 4,71 ganger) og NPAS3 (nedregulert med -2,73 ganger); begge er gener som ikke tidligere har blitt implisert i nikotin eksponering, men er knyttet til kreft. Vi har også oppdaget betydelig nedregulering (-2,3 ganger) og alternativ spleising av NEAT1 (lncRNA) som kan ha en viktig, ennå uoppdagede regulerende rolle. Gene ontologi Analysen avdekket nikotin eksponering påvirket gener involvert i cellulære og metabolske prosesser. Denne studien avdekker tidligere ukjente konsekvenser av nikotin stress på transkriptomet av normale bryst epitelceller og gir innsikt i den underliggende biologisk påvirkning av nikotin på normale celler, markerer grunnlaget for fremtidige studier
Citation. Bavarva JH, Tae H, Settlage RE, Garner HR (2013) karakteriserer det genetiske grunnlaget for Nikotin indusert kreft Development: En transkriptomet Sequencing Study. PLoS ONE 8 (6): e67252. doi: 10,1371 /journal.pone.0067252
Redaktør: Emmanuel Dias-Neto, AC Camargo Cancer Hospital, Brasil
mottatt: 05.02.2013; Godkjent: 15 mai 2013; Publisert: 18 juni 2013
Copyright: © 2013 Bavarva et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres
Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet av Medical Informatics and Systems Division direktør fond på Virginia Bioinformatikk Institute. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer
Innledning
på verdensbasis er mer enn 1 million kvinner diagnostisert med brystkreft hvert år, og mer enn 410 000 dør av sykdommen [1]. Store kohortstudier utført i USA og Japan viser at risikoen for brystkreft er knyttet til aktiv og passiv røyking [2], [3]. Studier har vist at 80-90% av inhalert nikotin absorberes systemisk i løpet av røyking, 1 mg fra en enkelt sigarett, noe som resulterer i plasmakonsentrasjoner av ca. 15 ng /mL umiddelbart etter røyking [4]. In vivo studier viser nikotin fremmer veksten av faste tumorer, noe som antyder at nikotin kan bidra til celleproliferasjon, invasjon, og angiogenese [5] – [7]. Videre er nikotin vist seg å overstyre DNA-skade indusert cellesyklus-G1 /S begrensning og således fremmer genetisk ustabilitet [8]. Tidligere studier har vist at nikotin stimulering kunne endre genekspresjon i endotelceller og neuroblastom-celler [9], [10]. En microarray basert studie knyttet nikotin stimulering med transkripsjonsfaktor NF-kB, men konkluderte med at ville være nødvendig fremtidig analyse siden de evaluert bare 4132 gener, og det var en sterk mulighet viktige gener ble savnet [9]. En annen microarray studie av neuroblastom celler antydet at fysiologiske og psykologiske effekter av nikotin eksponering kan skyldes effekter på genekspresjon, men de hadde også lignende tekniske begrensninger [10]. I tillegg studier på nikotin mangler konsensus om nikotin dosering.
Vi hypotese the missing link mellom nikotin stress og kreft vil bli funnet ved hjelp av en uhildet sekvense tilnærming heller enn en målrettet gruppe basert tilnærming. Neste generasjons sekvensering (NGS) teknikker, i motsetning til cDNA mikromatriser brukt tidligere, gjør systematisk undersøkelse av kjente, uncharacterized avskrift uttrykk over et bredt dynamisk område, og alternative og nye spleise hendelser uten noen teknologiske og /eller biologiske bias. Dette all-inclusive tilnærming kan gi bedre ledetråder til komplekse veier, forståelse av uncharacterized vitnemål og gi manglende informasjon om genregulering i henhold nikotin stress som var tidligere ikke mulig med mikromatriser. Videre valgte vi en LD
50 dose fordi det er standardisert og er etablert som en nøyaktig måte å måle effekter [11]. Her beskriver vi funnene fra denne systematiske analyser og oppdaget tidligere ukjente sammenslutninger av uncharacterized transkripsjoner.
Materialer og metoder
reagenser, kjemikalier og cellekultur
Nikotin ble kjøpt fra Sigma (St. Louis, Missouri, USA). MCF-10A, normal bryst epitel cellelinje, ble oppnådd fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). MCF-10A-celler ble dyrket i DMEM /F12-medium (Invitrogen, Carlsbad, CA), supplert med hesteserum (5% endelig, Invitrogen), antibiotics- Pen /Strep (1% endelig, Invitrogen), vekstfaktor EGF (20 ng /ml slutt, Peprotech, Rocky Hill, NJ), hydrokortison (0,5 mg /ml slutt, Sigma), kolera toksin (100 ng /ml slutt, Sigma), og insulin (10 ug /ml slutt, Sigma) ved 37 ° C i en fuktet atmosfære inneholdende 5% karbondioksyd.
eksperimenter
Tjuefire timer før forsøkene ble MCF-10A-celler sådd med en tetthet på omtrent 3 x 10
5 celler /brønn i seks-brønns plater eller 5 × 10
7/500 cm
2 kvadrat cellekulturskåler (Corning). Nikotin ble fortynnet i komplett kulturmedium ved de påkrevde slutt serielle konsentrasjoner. Nikotindoserings forsøk ble utført i seks-brønners plater i 72 timer og ved slutten; antall levende celler ble beregnet ved hjelp av TC10 BioRad® celleteller. Disse doserings eksperimenter ble ytterligere analysert og sammenlignet for nikotinet LD
50 dose (5 mM /811 ng /ml) i 500 cm
2 plater i 72 timer. Etter eksponering, var festet cellene høstet for RNA ekstraksjon ved hjelp av en Qiagen sin RNeasy® kit følge produsentens protokoll. RNA ble skikkelig testet for kvalitet på Nano-drop® og Bioanalyzer® før transkriptom sekvensering ble utført ved bruk av Illumina HiSeq®.
transkriptomet sekvense
RNA bibliotekene ble utarbeidet etter den TruSeq® RNA prøveopparbeidelse veilede i henhold til produsentens anbefalte protokoll (Illumina, San Diego, California). Total RNA for de tre biologiske replikater fra kontroll og nikotin stresset cellepopulasjoner ble transkribert til cDNA. Inkludert DNA-prøver ble deretter skåret ved forstøvning (35 psi, 6 min). Dupleksene ble buttendet (store Klenow-fragment, T4 polynukleotidkinase og T4 polymerase) ble tilsatt, og en enkelt 3’adenosine-del ved hjelp av Klenow-ekso- og dATP. Illumina adaptere, inneholdende primer områder for strømningscelleoverflaten gløding, amplifikasjon og sekvensering, ble ligert på de reparerte endene av cDNA. Gelelektroforese ble brukt til å velge ut for DNA-konstruksjonene 200-250 basepar i størrelse, som deretter ble amplifisert ved 18 cykler av PCR med Phusion polymerase (NEB). Disse bibliotekene ble deretter denaturert med natriumhydroksyd og fortynnet til 3:05 i en hybridiseringsbuffer for lasting på en enkelt bane av en Illumina HiSeq® strømningscelle. Klynge formasjon, primer hybridiserings- og sekvenseringsreaksjoner ble i henhold til produsentens protokoll. Høy throughput sekvensering ble utført ved hjelp av parvise end leser 100 basepar. Én strømnings felt ble anvendt for cDNA-sekvensering, noe som ga et gjennomsnitt på 45.26 million leser per prøve med midlere kvalitet Resultatet . 36,3
RNASeq dataanalyse
RNASeq data ble analysert i henhold til metoden beskrevet av Trapnell et al., [12]. Kort fortalt ble Hat v2.0.3 brukt til å justere RNAseq leser til Ensemble GRCh37 genomet som tilbys av Illumina iGenome med merknader. Genuttrykk ble målt for hvert gen fra Ensembl databasen ved Kartlagt Fragments per kilobase av Exon modell per million kartlagt leser (FPKM) beregnes ved hjelp Mansjettknapper v2.0.1. Vi brukte programmet CuffDiff v2.0.1 for å teste for differensial transkripsjon uttrykk og alternativ spleising hendelser i hver gruppe av cellelinjer. Standardparametere ble benyttet for alle analyser. Gener ble vurdert forskjellig uttrykt justert for multippel testing; p≤0.05. Cummerbund pakke for R ble brukt til å generere spredningsplott vises i utfyllende data. Gener som har bevis for alternativ spleising (de som har en Q-verdi 0,05 tyder på en endring i den relative overflod av forskjellige transkripter som stammer fra en enkelt transkripsjonsstartsetet) ble identifisert ved CuffDiff. Mansjettknapper utfører transkripsjon slutning og mengdemåling etterfulgt av differensial test av relative overflod bruker Jensen-Shannon Divergence (JSD) for å oppdage bevis for alternativ spleising [13]. I denne sammenheng er JSD et mål for forandring i den relative overflod av multiple transkripter fra hver locus på tvers av to eksperimentelle betingelser [14]. Gene funksjoner og biologiske prosesser ble undersøkt ved hjelp av PANTHER klassifiseringssystemet [15] og transkripsjonsfaktor berikelse ble utført ved hjelp av oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) programvare (https://www.ingenuity.com). Sequence leser er tilgjengelig i NIH Short Les Archive under forsøket sjonsnummer SRX254950.
Kvantitativ RT-PCR
For hver prøve, en mikrogram total RNA ble revers transkribert ved hjelp av Qiagen QuantiTect revers transkripsjon Kit (Valencia, CA) i henhold til produsentens standardprotokollen. For Taqman real-time PCR, ble 1,0 mL fortynnet cDNA brukt i 20 ul real-time PCR ved hjelp Taqman Gene Expression Master Mix i henhold til produsentens standardprotokollen. Applied Biosystems er TAQMAN analysene som ble brukt var som følger: HPCAL4 (Hs04188853_g1), NEAT1 (Hs01008264_s1), Actin (Hs01060665_g1) og 18S rRNA (Hs03928985_g1). Kvantitativ RT-PCR ble utført i en StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems, Foster City, California).
Diskusjon
Resultater og
Kvalitetskontroll og forskjells uttrykk analyse
Dette er den første transkriptomet sekvense studie av nikotin streket normale bryst epitelceller. Expression analyse via direkte transkriptomet sekvensering (RNAseq) sonder de sjeldneste og mest celle- og kontekstspesifikke transkripsjoner. Videre er RNAseq metoder ikke forspent ved forutgående kjennskap til skjøting og tillate analyse for å bestemme hele repertoaret av alternativt spleisede isoformer. Til slutt, RNAseq som en metode har vist seg å være mer kvantitativ som antall lesninger fremstilt fra et RNA-transkript er en funksjon av den transkriptet og genekspresjon i stedet for en kjemisk egenskap av probehybridisering som forandrer seg med sammensetningen av prøven [16 ] – [18]
for å identifisere differensielt uttrykte gener og karakterutskrifter, første bekreftede vi RNAseq data var fri for sekvense skjevhet og vist en jevn dekning over prøver (Figur S1).. Vi normalisert da prøvene (FPKM), beregnet en testobservator (p-verdi) og justert p-verdi (q-verdi). Fra dette, var det totalt 2015 forskjellig uttrykt transkripsjoner (q-verdi 0,05), 1680 oppregulert og 335 nedregulert (tabell S1). Totalt 138 transkripter ble uttrykt forskjellig med ± 2 gangers endring (107 oppregulert og 31 nedregulert) ved eksponering nikotin og 39 av disse var uncharacterized (tabell 1). Vi brukte Taqman real-time PCR for å validere de to øverste gener (HPCAL4 og NEAT1) og bekreftet deres opp- og nedregulehenholdsvis (figur S2).
Kreft er en multifaktoriell sykdom, knyttet til antall underliggende biologiske hendelser som betennelsesreaksjon, tumorsuppressorgener, onkogener og transkripsjonsfaktorer. En objektiv, all inclusive tilnærming med neste generasjons sekvensering kan derfor gi mer fullstendige opplysninger og hjelpe oss å bedre forstå de manglende koblinger. Våre resultater indikerer at HPCAL4, TREM1, EFNA2, SPATA22 og KRT85 er de fem oppregulert gener og NPAS3, DEFB129, NEAT1, WDR96 og VRK2 er de fem downregulated gener ved nikotin eksponering. Hippocalcin som 4 (HPCAL4) og utløser reseptor uttrykt på myeloide celler 1 (TREM1) ble sterkt oppregulert gener med mer enn fire ganger endring på nikotin stress. HPCAL4 er et forholdsvis under-studert gen og har en ukjent funksjon, men det er rapportert å være overuttrykt i lungekarsinom [19]. Kromosomet region 1p34.2, hvor HPCAL4 er plassert, er også forbundet med mange typer av kreft inkludert bryst, lunge, neuroblastom, og kolorektal [19]. Det er mulig at HPCAL4 genet kan være årsaken til slike foreninger i disse kreftformene. TREM1 er vist å være involvert ved inflammatorisk respons, og er en positiv regulator av TNF-α og IL-8 [20]. TREM1 er også et mål for matriksmetalloproteinaser (MMP) som kan spalter ekstracellulære proteiner. Denne trans glykoprotein besitter en Ig-lignende ectodomain lett skur av MMP å generere Strem-en. Mens membran forankret TREM-en forsterker betennelsesreaksjoner, utstillinger sTREM1 anti-inflammatorisk egenskaper [21]. I denne studien har vi også observert oppregulering av MMP2 som kan indikere en mulig økning i sTREM1 og derfor anti-inflammatorisk effekt. Dette styrker tidligere nikotin funn hvor det ble rapportert å stille immunsuppressive og anti-inflammatorisk effekt [22]. EFNA2 aktivering fremmer endotelcelle inflammatoriske respons [23], har SPATA22 en rolle i meiotisk DNA-reparasjon eller rekombinasjon og er nødvendig for meiotisk fremskritt i mus kjønnsceller [24] og KRT85 er et hårkeratin gen som er blitt rapportert å være transkripsjonelt aktivert av NF-kB effektor p65 /rela [25]. Den mest ned-regulert gen, NPAS3, har vist tumorundertrykkende aktivitet [26], og derfor dens regulering ned i nikotin streket celler tyder på NPAS3 mulige ukjente rolle i økt mottakelighet kreft. Interessant nok, ingen av de regulerte gener ble detektert som uttrykkes differensielt i tidligere studier microarray [9]. Dette er sannsynligvis på grunn av flere grunner, inkludert ulike celletyper som brukes, ulike doser og eksponeringstider og teknologiske begrensninger. Mer påfallende er det faktum at med unntak av TREM1, alle andre topp regulert gener er rimelig ny og studerte. Dette rettferdiggjør ytterligere grunn til å sekvensere transcriptomes for nikotin streket celler som det sannsynligvis avslører tidligere ukjente forbindelser.
En distinkt nedregulert gen er NEAT1, som er en lang ikke-kodende RNA (lncRNA) kjent for å være en vesentlig strukturell determinant av paraspeckles [27]. Den funksjonelle rollen av ikke-kodende RNA er ikke veldefinert; Men Chen et. al., har nylig foreslått en funksjonell rolle NEAT1 i reguleringen av mRNA eksport [28]. Vi er, for første gang, rapporterer den differensielle responsen av lncRNA til nikotin. Dette skaper muligheter for å driste seg til nye uutforskede muligheter i kreftforskning og eksemplifiserer en større rolle for lncRNAs i transkripsjon forskrifter og kreftutvikling.
Alternativ spleising analyse
Defekter i mRNA spleising er en viktig årsak til sykdom og flere studier har rapportert cancer-spesifikk alternativ spleising, selv i fravær av genomiske mutasjoner [29]. Vi identifiserte 173 gener som viste tegn på alternativ spleising (tabell S2). Tjuetre av dem er også forskjellig uttrykt (tabell S3). Det er også viktig å merke seg at NEAT1 er en av de mest ned-regulert lncRNAs det også presentert bevis for alternativ spleising på nikotin stress. Den øverste atten gener med kvadratroten av
Jensen-Shannon divergens
0.8 er vist i Tabell 2. Disher et. al., foreslo at mis-spleising følgende oksidativt stress representerer en ny og betydningsfull genotoksiske utfall, og at det ikke bare DNA-skader indusert av oksidativt stress som fører til mis-spleising, men endringer i den alternative spleising maskineri selv [30]. Nikotin er rapportert å indusere oksidativt stress i kultur celler [31], og derfor, som kan være en grunn for påvisning av avvikende spleisevarianter i nikotin stresset celler. Flere spleisede former av et enkelt gen kan ha kontrast biologiske egenskaper. For eksempel spleisevarianter av MDM2 viser både onkogene og veksthemmende egenskaper [32]. Derfor, for å avdekke biologiske betydningen av alternativt spleisede gener på nikotin stresset garanterer ytterligere undersøkelser.
Gene ontologi
For å få innsikt i naturen av genene regulert og alternativt skjøtes på nikotin stresset utførte vi genet ontologi analyse ved hjelp PANTHER klassifiseringssystemet analysert ved hjelp av binomiske testobservatorene og Bonferroni korreksjon. Vesentlig beriket biologiske prosesser og genfunksjoner er vist i figur 1. Under nikotin stress, de fleste av genene differensielt regulert og alternativt spleiset var involvert i metabolsk, cellulære og utviklingsmessige prosesser og ha katalytiske og bindingsfunksjoner. Interessant, forskjellig uttrykt (DE) gener hadde høyere tilknytning strukturelle molekylær aktivitet vers transkripsjons regulerende funksjon av alternativt spleisede gener. DE gener ble videre analysert ved Oppfinnsomhet Pathway Analysis (IPA) for å identifisere biokjemiske mekanismer som kan bli berørt. Figur S3 viser nettverket av gener som er assosiert med kreft, det endokrine og nervesystemet, som blir påvirket av nikotin. NF-kB-komplekset og østrogen reseptor er også funnet i nettverket av differensielt uttrykte gener tyder på sine forbindelser til nikotin spenning indusert DE gener. Det fremgår av denne analyse at nikotin påvirker immunresponsrelaterte gener, noe som indikerer en mulig påvirkning av nikotin på moduleringen av normal immunsystemaktivitet. Epitelial kreft og dermatologiske lidelser var de to øverste biologiske funksjoner knyttet til nikotin-stresset regulerte gener som avslørt av IPA. Interessant er østrogen-reseptor-bundet indirekte til nettverket som tyder på et distansert forhold og mulig påvirkning av nikotin stress. Dessuten ble de gener assosiert med celle bevegelse, signalering, spredning, død og overlevelse funksjoner. Kanoniske eggstokkreft signalveier var signifikant assosiert til disse resultatene. Tre av molekyler fra kanonisk eggstokkreft vei, MMP2, CGA og WNT7B var opp regulert på nikotin eksponering. Funksjonell betydning av alternativt spleisede gener evaluert gjennom IPA avslørt toppen nettverk av gener assosiert med DNA-replikasjon, rekombinasjon og reparasjon (figur S4).
Pie skjema som illustrerer likheter og forskjeller mellom GO vilkår i henhold til følgende kategorier. (1A) Biologisk fremgangsmåte for differensielt uttrykte gener. (1B) Biologisk fremgangsmåte for alternativt spleisede gener. (1C) Molecular funksjon for differensielt uttrykte gener. (1D) Molecular funksjon for alternativt spleisede gener.
transkripsjonsregulator analyse
For å identifisere hvilke transkripsjons regulatorer regulere differensial uttrykket av disse genene som er beskrevet i disse forsøkene, opp- og ned regulerte gener ble gjeninnført i IPA og ble analysert for anriking av transkripsjon regulatorer knyttet til arrangører av forskjellig uttrykt gener. Det var fem opp regulatorgener (S100A14, HEY1, CGA, IGFBP2 og LGALS1) fra listen. Deres målmolekyler, inkludert MMP2 og PROX1, ble også regulert opp i studien indikerer en tett korrelasjon (tabell 3). Alle de mulige transkripsjons regulatorer som mål-genene ble uttrykt forskjellig er detaljert i tabell S4. Opp regulering av S100A14 er forbundet med basal-type bryst kreft sammenlignet med ikke-basal typer [33]. S100A14 er også foreslått å være en nyttig markør for påvisning av metastatisk kolorektal og brystkreft [34]. CGA er identifisert som en ny ER-α responsive-genet i humane brystcancerceller og muligens en sterk markør for å forutsi tamoxifen respons på brystkreft [35]. Betydelig høyere uttrykk av IGFBP2 er rapportert i brystkreft vev sammenlignet med godartet brystvevet [36]. LGALS1 undertrykker T-celle-medierte cytotoksiske immunresponser og fremmer tumor angiogenese [37]. Derfor, over uttrykk for S100A14, CGA, IGFBP2 og LGALS1 i nikotin stresset celler er tankevekkende av deres samlede rolle i økt kreft mottakelighet hos røykere. I vår studie, nikotin stresset opp-regulerer HEY1 og MMP2. Den motsatte situasjonen ble observert ved evaluering av anti-kreft-effekt av curcumin som resulterte i nedregulering av HEY1 og MMP2, på grunn av inaktivering av Notch-en som curcumin inhiberte proliferasjonen og invasjon [38]. Dette tyder på rollen til nikotin i å støtte kreftutvikling og muligheten for curcumin for å bidra til å redusere risikoen og utvikling av kreft hos røykere. MMP-2 overekspresjon har vært rapportert i mange svulster [39] inkludert eggstokkene [40] og bryst [41] kreft. Det har blitt foreslått at MMP-2 kan ikke bare være en uavhengig prediktor for økt tumor aggressivitet, men også viktig i aktivering av andre proteaser som er direkte involvert i tumor angiogenese [42]. Det er rapportert at nikotin øker MMP2 ekspresjon og stimulerer esophageal squamous celle carcinoma (TE-13) migrering og invasjon [43]. Derfor oppregulering av MMP2 på nikotin stress i vår studie styrker tidligere funn og fremhever muligheten for at MMP2 er en betydelig biomarkør for å vurdere risikoen for kreft hos røykere. PROX1 er en transkripsjonsregulator som er involvert i nevrogenesen, så vel som en rekke krefttyper. Endringer i PROX1 er rapportert i flere kreftformer, selv om det ikke alltid klart om PROX1 utøver svulst undertrykkende eller onkogene egenskaper. Tykktarm og kreft i hjernen viser PROX1 løpet uttrykk, mens brystkreft viser redusert uttrykk grunn hypermethylation [44]. Derfor, i vår studie, effekten av forhøyet PROX1 uttrykk ved nikotin stress er ukjent.
Interessant, transkripsjon regulator HEY1 ligger på cytogenetisk bandet 8q21. Amplifisering av 8q21 er assosiert med dårlig prognose i pasientens bryst kreft og er uavhengig av MYC [45]. Andre interessante gener som ble berørt av nikotin stress inkluderer alternativt skjøtes NAPRT1 og CPSF1 på cytogenetisk bandet 8q24. Selv om vi ikke studere kromosom forsterkning i denne studien, er effekten av nikotin stress på transkripsjonsregulator HEY1, NAPRT1 og CPSF1 på eller nær 8q21 tankevekkende. For å undersøke de samlede effektene av nikotin på gener per kromosom, analyserte vi alle forskjellig uttrykt og alternativt spleiset gener (false oppdagelse korreksjon q≤0.05) (figur S5). Tolv prosent av gener som befinner seg på kromosom 19 ble uttrykt forskjellig og 14 transkripter på kromosom 12 viste bevis for alternativ spleising på nikotin stress. Men kromosom 17 hadde både et høyt nivå av forskjellig uttrykt og alternativt skjøtes transkripsjoner, og det er interessant å merke seg at markør brystkreft BRCA1 er også plassert på kromosom 17. Mens grunnen for kromosom bias er ukjent, er uttrykk ubalanse tidligere dokumentert i hepatocellulær karsinom [46]. Kromosom skjevhet av forskjellig uttrykt transkripsjoner ved nikotin stresset derfor garanterer fremtidige grundige undersøkelser.
Selv om denne pilotstudien forsøker å utnytte standardisert konsentrasjon av nikotin for å dokumentere fysiologiske og gentoksiske effekter, lavere konsentrasjon av nikotin identiske med de som finnes i plasma etter røyking kan utnyttes i fremtiden for å ytterligere evaluere effektene.
i konklusjonen, denne studien viser at nikotin stress utløser reaksjoner fra en rekke studerte og uncharacterized genene og fører til avvikende spleise hendelser som kumulativt kunne bidra mot utvikling av kreft og endret immunsystem aktivitet hos røykere. I tillegg gener lokalisert på kromosom 12, 17, og 19 viser forspent følsomhet overfor nikotin spenning som indikerer ukjent biologisk betydning. Dette innebærer at nikotin vil være et additiv i kreft forplantning ved å modulere immunaktivitet og ovarialcancer signalveier. Denne studien har brede implikasjoner som vi presenterer nye mulige sammenhenger mellom gener som HPCAL4 (oppregulert), NPAS3 (nedregulert) og NEAT1 (alternativt spleiset samt høyt nedregulert lncRNA) som kan være målrettet eller overvåkes for å redusere eller vurdere risikoen for kreftutvikling hos røykere (spesielt) og kreftpasienter. Observasjoner fra denne transkriptomet studien gir dermed ny biologisk innsikt i nikotin stress på normale bryst epitelceller som kan benyttes i kliniske sammenhenger for å vurdere de skadelige effektene av nikotin hos røykere.
Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
Tetthet graf og spredningsplott. (1A) cummerbund ble brukt til å generere en tetthet graf av tetthetene til de FPKM verdier for alle genene. Kontroll- og Nikotin prøvene var svært like, indikerer ingen skjevhet i sekvensering dekning mellom prøvene. (1B) De FPKM verdier for alle genene ble plottet for kontroll og Nikotin prøver, etter midling over replikater og normalisering. Hver prikk representerer et gen
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s001 plakater (JPG)
Figur S2.
Validering av topp to gener ved Taqman real-time RT-PCR. Taqman real-time RT-PCR validering vurdering av HPCAL4 (opp regulert) og NEAT1 (ned regulert) indikerer den generelle avtalen av RNASeq funn og kvantitativ PCR. Brett endringene var i forhold til kontrollgruppen og normalisert til de multipleksede husholdningsgener (Actin og 18S rRNA). Feilfelt representerer standardfeil
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s002 plakater (JPG)
Figur S3.
Oppfinnsomhet pathway analyse av forskjellig uttrykt gener. Top nettverk fra Oppfinnsomhet pathway analyse indikerer at DE genene har viktig rolle i kreft. De som vises i rødt er oppregulert, grønn er nedregulert og de i hvitt tjene til å gjøre det indirekte forbindelse mellom DE genene
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s003 plakater (JPG)
Figur S4.
Oppfinnsomhet pathway analyse av alternativt spleisede gener. Top nettverk fra Oppfinnsomhet pathway analyse indikerer at alternativt spleisede gener har tilknytning til DNA replikasjon, rekombinasjon og reparasjon
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s004 plakater (JPG)
Figur S5.
forskjellig uttrykt og alternativt skjøtes transkripsjoner per kromosom og deres relative prosenter. (4A) Radar graf viser relative prosenter av DE utskrifter per kromosom. (4B) Radar graf viser relative prosenter av alternativt spleisede utskrifter per kromosom. . (4C) Tabell illustrerer det totale antallet forskjellig uttrykt og alternativt skjøtes transkripsjoner per kromosom
doi: 10,1371 /journal.pone.0067252.s005 plakater (JPG)
Tabell S1.
Liste over alle forskjellig uttrykt gener og uncharacterized transkripsjoner (q 0,05)
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s006 plakater (XLS)
Tabell S2.
transkripsjoner som viste tegn på alternativ spleising
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s007 plakater (XLS)
tabell S3.
Overlappende gener som viste differensial uttrykk og bevis på alternativ spleising
doi:. 10,1371 /journal.pone.0067252.s008 plakater (XLS)
Tabell S4.
IPA transkripsjonsfaktor berikelse analyse presentere alle transkripsjonsfaktorer som kan ha påvirket ulikt regulert gener
Doi:. 10.1371 /journal.pone.0067252.s009
(XLS)
Takk
Dette arbeidet ble støttet av medisinsk informatikk og Systems Division regissør fondet ved Virginia Bioinformatikk Institute.
